Respuesta a la temperatura de las tasas de descomposición de materia orgánica en el suelo: construcción y aplicaciones de un bloque de gradiente de temperatura

Resumen

Introducimos un bloque de gradiente de temperatura y detallamos su construcción y utilización. El bloque proporciona 22 temperaturas discretas, distribuidas linealmente entre un rango definido por el usuario de 0 a 90 °C. Los datos recogidos de este sistema permiten probar y desarrollar nuevas teorías sobre la respuesta térmica a las tasas de descomposición de materia orgánica en el suelo.

Resumen

El suelo es el mayor reservorio de carbono (C) de la Tierra, que contiene casi el doble de carbono que la atmósfera. El aumento de temperatura inducido por el cambio climático podría potenciar la descomposición de la materia orgánica (SOM) del suelo, liberando potencialmente dióxido de carbono (CO₂) a la atmósfera, resultando así en una retroalimentación positiva al cambio climático. Esto plantea la pregunta: ¿cómo podemos definir la respuesta de las tasas de descomposición de SOM a cambios a corto plazo en la temperatura? ¿Podemos utilizar estos datos para ajustar ecuaciones definidas mecanicamente en modelos del sistema terrestre para predicciones climáticas? La mayoría de las investigaciones hasta la fecha se han centrado en incubaciones de suelos de laboratorio a diferentes temperaturas discretas. Sin embargo, esto no da lugar a una curva de respuesta a la temperatura detallada, que es necesaria para probar nuevas hipótesis impuestas por los últimos avances en el campo, como la teoría de la velocidad macromolecular (MMRT). En este artículo, introducimos un bloque de gradiente de temperatura, modificado y mejorado respecto a trabajos anteriores, detallamos su proceso de construcción y proporcionamos una explicación detallada de su utilización. El bloque de gradiente de temperatura es un bloque de aluminio con cuatro filas de 22 agujeros discretos, que permite la incubación simultánea de 88 microcosmos (viales de 60 mL). El bloque se enfría en un extremo y se calienta en el otro, creando una distribución lineal de temperatura. Proporciona 22 puntos de temperatura discretos a lo largo de un rango definido por el usuario dentro de límites de 0 a 90 °C. Tras 3,5 horas de incubación, se mide la producción de_CO2 de cada uno de los 88 microcosmos. Los resultados demuestran que el bloque produce el gradiente de temperatura definido por el usuario y facilita la construcción de curvas de respuesta a temperatura de la descomposición SOM. Además, los datos recogidos de este sistema pueden utilizarse para probar y desarrollar nuevas hipótesis y teorías sobre el impacto de los cambios de temperatura en las tasas de descomposición de SOM, un área de creciente importancia en el contexto del cambio climático.

Introducción

El aumento de las concentraciones de dióxido de carbono (CO₂) en la atmósfera conduce a temperaturas más altas en la Tierra¹. Este fenómeno fue reportado por primera vez en 1856 por Eunice^{Foote 2}, quien realizó un experimento sencillo pero innovador. Llenó un cilindro con aire ambiente y otro con_CO2 y registró las temperaturas en ambos¹. Los resultados fueron claros: los cilindros con mayores concentraciones de_CO2 exhibieron temperaturas más altas, demostrando el efecto de calentamiento del aumento del CO2 1 atmosférico^. Esta observación tiene importantes implicaciones para el cambio climático. Hoy en día, las primeras ideas de Foote continúan informando la ciencia climática contemporánea, guiando la investigación sobre cómo el aumento de los niveles de_CO2 afecta al calentamiento global e influye en diversos ecosistemas.

Los suelos almacenan casi el doble de carbono (C) que la atmósfera en el primer metro, desempeñando un papel crucial en el ciclo^{global de carbono 3}. Un proceso clave que influye en las reservas de carbono del suelo es la descomposición de materia orgánica del suelo (SOM), que determina la velocidad a la que el carbono se libera de nuevo a la^{atmósfera 4,5}. Las temperaturas medias anuales más altas, impulsadas por el cambio climático, tienen el potencial de estimular la descomposición de materia orgánica del suelo (SOM), acelerando la liberación de_CO2 en la^{atmósfera 6,7}. Esto representa un mecanismo de retroalimentación positiva al cambio climático, especialmente cuando las temperaturas más altas aceleran las pérdidas de C por descomposición de SOM más que las entradas fotosintéticas^{de C 6}. A pesar de una extensa investigación sobre el tema, la magnitud y dirección de la llamada retroalimentación tierra-carbono-clima sigue siendo objeto de un gran debate 8,9,10,11. Esta incertidumbre se debe en gran parte a lagunas fundamentales de conocimiento sobre la respuesta térmica a las tasas de descomposición de SOM. Abordar estas lagunas es esencial para refinar modelos del sistema terrestre e incorporar representaciones teóricamente fundamentadas de la respuesta térmica a las tasas de descomposición de SOM.

La respuesta térmica a las tasas de descomposición SOM se representa comúnmente mediante el valor Q₁₀ y la ecuación de Arrhenius. El valor de Q₁₀ se define como el factor por el cual se multiplica una tasa cuando la temperatura aumenta por 10 °C. A pesar de los desafíos a su^validez 12,13,14,15, el _Q10 se ha convertido en el enfoque por defecto para comparar la respuesta térmica de diferentes tratamientos y suelos. La teoría de Arrhenius sugiere un aumento exponencial en las tasas de proceso, como las de la descomposición SOM, con el aumento de la temperatura¹⁶. Sin embargo, las actividades enzimáticas reales tienden a seguir una forma unimodal con un óptimo térmico distinto y disminuyen a temperaturas^{más altas 17, 18 y 19}. Las ecuaciones basadas en Arrhenius intentan explicar este descenso sugiriendo una desnaturalización enzimática más allá del óptimo térmico⁶. Sin embargo, la desnaturalización enzimática ocurre a temperaturas más altas que las comúnmente encontradas en suelos, lo que indica que las enzimas alcanzan un óptimo térmico antes de que ocurra^{la desnaturalización 19,20}. Además, simplemente añadir una segunda función a la ecuación de Arrhenius para tener en cuenta el colapso de las tasas respiratorias debido a la desnaturalización no permite estimar la temperatura de un punto de inflexión: la temperatura a la que se maximiza la tasa de cambio en la^{respiración 21,22}. En consecuencia, las ecuaciones basadas en Arrhenius no logran capturar completamente la forma comúnmente medida de la respuesta térmica global de las tasas de descomposición de SOM dentro del rango de temperaturas generalmente observado en suelos^14,23.

Para abordar las limitaciones de la teoría de Arrhenius, se han desarrollado múltiples ecuaciones para representar la sensibilidad a la temperatura de los procesos biológicos; sin embargo, pocos están fundamentados en la teoría biológica o se han aplicado a^{suelos 24,25}. Entre los enfoques basados en la biologia, la teoría de la velocidad macromolecular (MMRT) supera algunas de las limitaciones de la ecuación de Arrhenius incorporando las propiedades termodinámicas de macromoléculas biológicas, como las^{enzimas 26}. De manera similar, la teoría de Arrhenius Asistida por Enzimas (EAAR) explica el papel dependiente de la temperatura de las enzimas en la reducción de la energía de activación de la^{reacción 24}. Ambas ecuaciones se han aplicado con éxito a estudios de la respuesta térmica de reacciones bioquímicas en suelos y^{microorganismos} 17,24,27,28. Estas ecuaciones proporcionan valiosas perspectivas mecanicistas sobre la respuesta térmica de la descomposición SOM y los pasos subyacentes de la reacción. Sin embargo, su adopción y parametrización generalizada a menudo se ven obstaculizadas por desafíos experimentales.

Tanto los estudios de campo como los de laboratorio tienen ventajas y limitaciones para comprender la respuesta térmica a las tasas de descomposición de SOM. Los experimentos de campo proporcionan información valiosa sobre la respuesta térmica a largo plazo de las tasas de descomposición de SOM. Sin embargo, interpretar las mediciones del flujo de_CO2 en el campo puede ser complicado debido a variables de confusión como la respiración autotrófica, la variabilidad de la humedad y la accesibilidad al^sustrato 29,30,31,32,33^. Aunque estas interacciones son esenciales para cuantificar procesos del mundo real, estos estudios suelen centrarse en las respuestas a largo plazo del ecosistema más que en las mediciones de procesos mecanicistas a corto plazo. Comprender la respuesta térmica a corto plazo es crucial para parametrizar ecuaciones definidas por teorías recientes, como la MMRT y la EAAR, y para ello, los estudios de laboratorio son clave. Muchos estudios de laboratorio suelen sufrir efectos de confusión por el agotamiento del sustrato, que aumentan con el tiempo de incubación y los tratamientos de temperatura 34,35,36. Además, la mayoría de los experimentos de laboratorio utilizan solo unos pocos tratamientos de temperatura 37,38,39,40, lo que permite ajustar ecuaciones exponenciales simples o calcular razones Q₁₀ en lugar de ecuaciones más avanzadas, que requieren que las tasas se midan a un mayor número de temperaturas ^{discretas 41}. Para abordar estos problemas, es crucial desarrollar nuevos enfoques experimentales que permitan mediciones precisas de las tasas de descomposición de SOM en un rango más amplio de temperaturas, apoyando así las riguentas pruebas y el desarrollo de teorías de descomposición SOM en relación con la respuesta a temperatura.

En este artículo, describimos la construcción y utilización de un bloque de gradiente de temperatura, que no solo aborda las limitaciones experimentales actuales, sino que también proporciona un estudio de vanguardia para demostrar la respuesta a corto plazo de la descomposición de SOM a la temperatura. El diseño presentado aquí es una adaptación de la metodología desarrollada por primera vez por Thomas et al. (1963)⁴² y posteriormente modificada por Robinson et al. (2017)⁴¹. Las principales diferencias incluyen 1) una mejora del sistema de refrigeración, 2) una reducción del tiempo de funcionamiento acoplando el bloque a un analizador de_CO2 para la medición directa de concentraciones de_CO2, y 3) eliminación de la necesidad de transportar viales durante el experimento. Mientras que los informes^{anteriores 21, 41, 43} han proporcionado una descripción amplia del bloque de temperatura, el diseño detallado, los métodos de construcción y las pruebas fueron mínimos, lo que limitó la capacidad de otros investigadores para utilizar este enfoque. Aquí ofrecemos detalles completos tanto del diseño como de la construcción, y presentamos los resultados de múltiples pruebas para demostrar la correcta funcionalidad del montaje para diferentes muestras de suelo.

Protocolo

Aquí presentamos la construcción detallada y la utilización en profundidad del bloque de gradiente de temperatura. Todos los materiales con sus especificaciones respectivas pueden encontrarse en la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla de Materiales. El coste de construcción y montaje del bloque de gradiente de temperatura fue de aproximadamente 20.000 €, excluyendo el coste del analizador de gases. Este bloque de gradiente de temperatura se llama 'Eunice' en honor a Eunice Foote.

1. Construcción del bloque de gradiente de temperatura

1. Consulte la Figura 1 para el diseño del cuerpo del bloque de gradiente de temperatura.
2. Construcción del bloque de aluminio
   1. Coloca y asegura el bloque de aluminio en bruto en una fresadora universal. Introduce las medidas y ubicaciones de cada agujero en el software de la máquina. La Figura 2 especifica la ubicación y el diámetro de cada agujero para el montaje.
   2. Haz agujeros para varillas de calefacción. En un extremo del bloque, perfora dos agujeros con un diámetro de 16 mm y una profundidad de 133 mm. Coloca estos agujeros de modo que sus centros estén situados a 25 mm del borde superior y a 36,25 mm de los bordes laterales (Figura 2).
   3. Crea un patrón de castillo como agente refrigerante. En el extremo opuesto del bloque, perforar un patrón de castillo a lo largo de 180 mm de longitud (Figura 3A). Asegúrate de que el patrón del castillo tenga un grosor de 16 mm y una profundidad de 140 mm. Perforar 12 agujeros adicionales dentro del patrón del castillo, cada uno con un diámetro de 10 mm y una profundidad de 140 mm. Consulte la Figura 3B para la ubicación y distribución precisas de estos agujeros.
      NOTA: El patrón castillo se creó para aumentar el contacto del agente refrigerante con el bloque, y los 12 agujeros sirven para evitar desbordamientos.
   4. Crea una junta para el patrón castillo. Corta una junta de aluminio para encerrar el agente refrigerante dentro del bloque y colócalo sobre el patrón del castillo. Esto se utiliza para evitar fugas del agente refrigerante.
   5. Haz agujeros para la conexión del disipador. En los lados frontal y trasero del bloque, perfora agujeros con un diámetro de 15 mm para la conexión del enfriador (Figura 4). Coloca el centro de los agujeros a 75 mm de profundidad. Asegúrate de que el agujero en la parte frontal esté a 18 mm del borde y que el agujero en la parte trasera esté a 162 mm del borde. Asegúrate de que estos dos agujeros conecten el inicio y el final del patrón del castillo.
   6. Haz agujeros para sensores de temperatura. Perfora 8 agujeros con un diámetro de 3 mm y una profundidad de 150 mm. Estos sensores están situados en el centro del bloque y distribuidos uniformemente a lo largo de su longitud. Asegúrate de que el centro del primer agujero del sensor esté a 940 mm del borde, y que el último agujero del sensor esté a 205 mm del borde.
   7. Perfora los orificios para los viales de 60 mL. Crea 88 agujeros, cada uno con un diámetro de 28 mm y una altura de 144 mm. Estos agujeros están distribuidos uniformemente a lo largo del bloque. El centro del primer y último orificio del vial se alinea con los centros del primer y último agujero sensor.
3. Preparación del aislamiento
   NOTA: El material aislante está hecho de poliisocianurato con un grosor de 40 mm.
   1. Usando una sierra circular, corta el material aislante en forma de trapecio con un ángulo de 135°. Para cubrir los cuatro lados largos del bloque de aluminio, corta el material aislante en un rectángulo de 1080 mm por 230 mm. Corta cada uno de los cuatro lados de este rectángulo en un ángulo de 135° para ajustarse perfectamente alrededor del bloque. Uno de estos lados se pegará a la tapa del bloque. Usa cinta de aluminio para proteger el material aislante de la tapa del bloque.
   2. Para los dos lados cortos del bloque, corta el material aislante en un cuadrado de 230 mm por 230 mm. De nuevo, corta cada lado del cuadrado en un ángulo de 135° para asegurar un ajuste adecuado.
4. Conexión del sistema de refrigeración (Figura 5)
   NOTA: El sistema de refrigeración utilizado en esta configuración es compacto y eficiente energéticamente. Este sistema de refrigeración se opera circulando un agente natural de refrigeración con una capacidad de enfriamiento de hasta -30 °C.
   1. Acopla el acoplamiento de rodilla y la espiga de manguera al bloque (Figura 5C). Luego, conecta la manguera que dirige el agente refrigerante al refrigerador.
   2. Cubre la manguera con material aislante flexible para cubrirla por completo. Esto mantendrá el agente refrigerante a la temperatura deseada. Corta el material aislante flexible y enjútalo firmemente a la manguera, usando sellador adhesivo para fijar el aislamiento.
5. Inserta la varilla calefactora y los sensores en el bloque para asegurar el ajuste (Figura 5D).
6. Consulte la Figura 5 para una visión general de los pasos explicados anteriormente.

Figura 1: Diseño del cuerpo y partes del bloque de gradiente de temperatura. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Bloque de gradiente de temperatura que delimita la ubicación y el diámetro de los agujeros utilizados para múltiples usos. La letra "S" indica sensor. Las dimensiones están en milímetros (mm). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Diseño y mediciones del patrón del castillo utilizado como agente refrigerante. (A) Medidas del grosor, longitud y diámetro del patrón del castillo, y (B) distancia y ubicación de 12 agujeros utilizados para evitar desbordamientos. Las dimensiones están en milímetros (mm). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Vista lateral del bloque de gradiente de temperatura que indica la profundidad de cada agujero y la ubicación de las conexiones del enfriador. La letra "S" indica sensor. Las dimensiones están en milímetros (mm). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Visión general de la construcción del bloque de gradiente de temperatura. (A) Perforación de agujeros para colocar los viales de 60 mL; (B) construir el material aislante que cubre el bloque de aluminio; (C) conexión y carcasa para el agente refrigerante; (D) insertar la varilla calefactora y los sensores en el bloque. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Construcción de la carcasa de acero inoxidable.

1. Corta el acero inoxidable para los lados largos con las dimensiones 1080 mm x 230 mm x 230 mm. Para los lados cortos, corta el acero inoxidable con dimensiones de 230 mm x 230 mm. Asegúrate de hacer agujeros para la manguera de refrigeración, los sensores, las varillas calefactoras y las manillas.
   NOTA: Uno de los lados largos se utiliza como tapa del bloque.
2. Conecta con calor las manijas, las bisagras de la tapa y los cierres a la carcasa de acero inoxidable.

3. Construcción de la unidad electrónica

NOTA: Solo un electricista cualificado puede construir la unidad electrónica. El protocolo aquí descrito se ha desarrollado conforme a las leyes neerlandesas y de la UE. A continuación se presenta una breve visión general de los principales componentes utilizados; las instrucciones detalladas de cableado se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

1. Diseña el diagrama electrónico (Figura 6).
2. Monta las cajas de conexión.
   NOTA: Las cajas de conexiones se instalan para proteger los componentes eléctricos y las conexiones frente a objetos externos y daños.
   1. Fija firmemente las tres cajas de conexiones a la carcasa de acero inoxidable usando los tornillos de montaje.
   2. Preparé los puntos de entrada del cable. En la caja principal de derivación, haz seis agujeros para las prensa de cables. En las dos cajas más pequeñas, haz dos agujeros para las prensaestopas. Una caja alojará el interruptor bipartito y la otra las conexiones del cable de la varilla del calentador.
      NOTA: El interruptor de dos vías se usa para encender y apagar la unidad, lo que significa que suministra energía al mini interruptor automático.
   3. En la caja principal de derivación, haz un agujero en la parte superior para el LED verde.
      NOTA: Esta luz LED indica cuándo la unidad está encendida y la energía disponible para todos los componentes.
   4. Corta y instala el raíl DIN en la caja de conexiones principal. Luego, marca tres agujeros para los tornillos de montaje que sujetarán el raíl DIN. Monta el raíl DIN en la caja de conexiones principal.
      NOTA: El raíl DIN se utiliza para facilitar el montaje de los componentes eléctricos. Preferiblemente, colócala aproximadamente en el centro de la caja principal de conexiones.
3. Instalación de componentes eléctricos.
   NOTA: Utiliza la Figura 7 como referencia e instala cada componente eléctrico.
   1. Localiza la caja de conexiones para el interruptor de dos vías. Quita la mitad superior del interruptor para encontrar la parte que debe pasar por la placa de cubierta. Marca y perfora un agujero en la placa de cubierta de la caja de conexiones del interruptor, que debe encajar y montar el interruptor perfectamente a la placa de cubierta. Usa las instrucciones de montaje del interruptor.
   2. En la caja de conexiones principal, coloque la terminal PE/GND sobre el raíl DIN. Luego, coloca el interruptor automático en miniatura (MCB) en el raíl DIN.
      NOTA: Los terminales PE/GND se utilizan como extremos. El MCB es un interruptor automático en miniatura y el principal interruptor de seguridad en caso de fallo o escasez. Cuando el MCB está encendido, aplica energía a la fuente de alimentación AC/DC.
   3. Coloca dos terminales triples de alimentación en el raíl DIN. Utilizando dos terminales de doble puente para unirlos en la parte superior e inferior de los terminales de alimentación.
      NOTA: Utiliza terminales de paso de alimentación para conectar más de dos cables y utiliza puentes para conectar varios terminales de paso de alimentación. Asegura una conexión segura y fiable utilizando los conectores de férula.
   4. Coloca la fuente de alimentación de corriente continua en el raíl DIN como se muestra en la foto.
      NOTA: Este estudio utilizó una fuente de alimentación de 24 V y 2,5 A CA/CC. Que utiliza la potencia de CA y la convierte a 24 VDC para los requisitos de potencia de entrada de los otros componentes.
   5. Coloca el termostato en el raíl DIN como se muestra en la foto. Asegúrate de no perder el módulo de conexión del cable (Verde en la Figura 7).
      NOTA: Se utilizó un termostato para controlar y monitorizar la temperatura. Es un sistema de software basado en navegador web que requiere la dirección IP de la unidad para iniciar sesión, ajustar la temperatura de las barras de calentamiento y registrar los datos. Esto se conectaba a la red local (LAN) para poder conectarse a la unidad desde cualquier ordenador del campus.
   6. Coloque siete terminales triples de alimentación en el raíl DIN como se muestra en la imagen. Utilizando tres puentes quintuples, une los primeros cinco feed-thrus en los terminales superior, central e inferior del feed-thru.
   7. Utiliza dos puentes quintuples para unir los dos últimos feed-thrus en la parte superior e inferior.
   8. Coloca un portafusibles en el raíl DIN como se muestra en la foto.
      NOTA: Se utilizó un fusible de 630 mA para proteger los componentes de la unidad de daños en caso de cortocircuitos y sobretensiones.
   9. Coloque dos unidades de conexión de terminal único en el raíl DIN como se muestra en la imagen.
   10. Coloca el relé de estado sólido en el raíl DIN como se muestra en la foto.
       NOTA: El relé de estado sólido se utiliza para encender y apagar las varillas calefactoras.
   11. Coloca un terminal PE/GND como tope final.
4. Para el procedimiento de conexión del cable eléctrico, consulte la Figura Suplementaria 1.
5. Para una visión general de la unidad electrónica, consulte la Figura 7.

Figura 6: Diagrama de la unidad electrónica. Los colores de los cables son los siguientes: marrón = línea de corriente alterna de tensión (VAC), azul = neutro VAC, verde y amarillo = GND (tierra/tierra), rojo = tensión y corriente continua (VDC) positiva, negro = VDC negativo. Los cables de datos son blancos, pero para facilitar su identificación, en esta figura se muestran en color verde. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Caja principal de derivación de la unidad electrónica unida al bloque de gradiente de temperatura. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Montaje del bloque del gradiente de temperatura

1. Utiliza un sellador adhesivo para pegar el material aislante a la carcasa de acero inoxidable. Déjalo secar toda la noche.
2. Inserta los sensores y las varillas calefactoras dentro del bloque de aluminio.
3. Coloca el bloque de aluminio dentro de la carcasa de acero inoxidable, guiando los cables por sus respectivos orificios para conectarlos a la unidad electrónica.
4. Utiliza las bisagras para fijar la tapa aislante de acero inoxidable al bloque.
5. Conecta el sistema de refrigeración al bloque de aluminio.
6. Coloque el bloque de gradiente de temperatura en el laboratorio, asegurándose de que todas las conexiones sean seguras y funcionales (Figura 8A). Asegúrate de que el laboratorio disponga de una mesa robusta de al menos 2 m de longitud. Confirma que hay acceso a Ethernet y conexiones eléctricas. Se desea una temperatura ambiente controlada para un funcionamiento óptimo.

5. Construcción del sistema de descarga

NOTA: La línea de lavado fue diseñada para estandarizar las concentraciones de_CO2 en cada vial al inicio de la incubación. Consulte la Figura 8B para visualizar el sistema de lavado con el bloque de gradiente de temperatura.

1. Corta el tubo flexible de menor diámetro en 10 piezas, cada una de 15 cm de longitud. Coloca una aguja en un extremo de cada uno de los 10 tubos pequeños.
2. Corta el tubo de mayor diámetro en una sola pieza de 1 m de longitud. Coloca un tapón en un extremo de este tubo y conecta el otro extremo al conductor de aire ambiente en el laboratorio.
3. Mide y marca el tubo más grande a intervalos de 5 cm a lo largo de su longitud. En cada intervalo marcado, inserta una aguja conectada a uno de los tubos más pequeños.

Figura 8: Bloque de gradiente de temperatura. (A) Bloque de gradiente de temperatura instalado en el laboratorio con la tapa cerrada y (B) abierto con el sistema de descarga en pantalla. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Descripción de la unidad de inyección del analizador de gases

NOTA: El analizador de gases de este sistema permite medir la concentración de_CO2 directamente en los viales de vidrio de 60 mL. El rango de este analizador de gases está entre 0 ppm y 10.000 ppm con una precisión de 0,04 ppm a 400 ppm. El analizador de gases viene con un kit de reducción de flujo que mide a una velocidad de 1,17 mL/s.

1. Modifica el tubo de inyección del analizador de gases añadiendo un filtro externo de 0,45 μm y una aguja de inyección (Figura 9).
   NOTA: El filtro de 0,45 μm se añadió como precaución adicional para evitar que el agua entre en el analizador de gases. La aguja tiene un tamaño de 18 g y unas dimensiones de 1,2 mm x 25 mm. La aguja se seleccionó en función del diámetro para minimizar el daño a los septos de goma de los viales de vidrio de 60 mL.
2. Conecta el tubo de inyección del analizador de gases a la entrada de conexión del instrumento.
3. Al final del tubo de inyección, conecta un conector macho de bloqueo Luer. Utilizando un tubo flexible con un diámetro interno de 1/4, fija el bloqueo Luer al tubo de inyección. Luego, conecta el filtro de 0,45 μm usando un tubo flexible para unir todo herméticamente.
4. En el extremo tornillo del filtro de 0,45 μm, utiliza un conector macho y uno hembra para fijar la aguja de forma segura.

Figura 9: Unidad de inyección del analizador de gases. (A) El tubo de inyección del analizador de gases. (B) Un filtro externo de 0,45 μm y una aguja de inyección. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

7. Diseño de tratamientos para la incubación

1. Selecciona muestras de suelo.
   NOTA: Las muestras de suelo seleccionadas para este manuscrito demuestran la funcionalidad del protocolo y muestran el tipo de datos que se pueden recopilar utilizando este montaje.
2. Seleccione un rango de temperatura para la incubación en bloques, que es un rango definido por el usuario desde 0 °C hasta 90 °C.
   NOTA: El rango de temperatura para este manuscrito fue de 4 °C a 60 °C. Si el sistema se utiliza más allá de este rango, sigue los protocolos de seguridad del laboratorio al manipular temperaturas altas o bajo cero.
3. Planifica la aleatorización de las muestras.
   NOTA: Para este manuscrito, las muestras se distribuyeron al azar dentro del bloque de temperatura (posiciones A a D). Aunque este estudio probó inicialmente la aleatorización de la lectura de la muestra tras la incubación, esto introdujo errores de etiquetado durante el proceso de lectura. Por lo tanto, se priorizó un orden de medición consistente (es decir, de altas a bajas temperaturas).

8. Preparación de muestras para la preincubación

NOTA: Para limitar los cambios en las comunidades microbianas del suelo, las muestras de suelo deberían incubarse frescas lo antes posible tras la muestra. Sin embargo, dependiendo de las limitaciones experimentales y la logística, las muestras de suelo pueden necesitar secarse al aire para su transporte y almacenamiento antes de la incubación. En este manuscrito, se estandarizó un procedimiento de secado al aire para procesar muestras antes de la incubación.

1. Tamía la tierra fresca con un tamiz de 2 mm. Deja que el suelo tamizado seque a 40 °C durante 24 horas. Esta tierra seca al aire puede almacenarse hasta un procesamiento adicional.
2. Coloca la muestra de tierra en una lata metálica y mézclala bien. Distribuye la tierra mezclada en 22 viales de vidrio preetiquetados de 60 mL. Con papel de pesar, añade 3 ± 0,03 g de tierra en cada frasco de 60 mL.
3. Utilizando una pipeta, ajusta el suelo a la capacidad de retención de agua (WHC) deseada según el método de embudo. Después de ajustar el contenido de agua al % de WHC objetivo, anota el peso exacto de cada frasco.
   NOTA: Las muestras de suelo seleccionadas para este manuscrito se ajustaron al 60% de WHC.
4. Tapa los viales con algodón para permitir el intercambio de aire ambiental.
5. Preincubar las muestras durante 10 días en un laboratorio con temperatura controlada a 20 °C.

9. Ajuste del WHC durante la preincubación

1. Tras 7 días de pre-incubación, anota el peso de los frascos y ajusta al WHC objetivo. Usa una pipeta para ser preciso y añade agua según lo necesites. Calcula el agua que añadir a cada frasco usando la Ecuación 1.
   Agua para añadir = peso_T0 (g) - peso_T7 (g) (1)
   donde el peso_T0 representa el peso del vial en el tiempo cero y el peso_T7 representa el peso del frasco tras 7 días.

10. Inicialización del bloque de gradiente de temperatura

NOTA: El sistema de refrigeración se controla mediante el panel situado en la parte delantera del instrumento. El sistema de calefacción se controla mediante el interruptor detrás del instrumento y una interfaz en línea.

1. Sigue las instrucciones del fabricante para ACTIVAR el sistema de refrigeración. Pulsa el botón de encendido una vez (Elemento A, Figura Suplementaria 2). Asegúrate de que los valores de temperatura °C y rpm parpadeen con el mensaje APAGADO. Esto indica que el sistema está ENCENDIDO pero actualmente inactivo.
2. Activa la bomba pulsando el botón OK/Bomba (Ítem E, Figura Suplementaria 2) y pulsa el botón + o - (Ítem G y F, Figura Suplementaria 2) para ajustar las rpm a 3500. Antes de activar el sistema de refrigeración, comprueba que el nivel de fluido tenga luces verdes (Ítem L, Figura Suplementaria 2). Si el nivel del fluido es rojo, significa que no hay suficiente agente refrigerante. Contacta con el responsable del laboratorio o consulta el manual del fabricante.
3. Activa el sistema de refrigeración pulsando Temperatura (Ítem B, Figura S2) y pulsa los botones + o - (Ítem D y C, Figura Suplementaria 2) para ajustar la temperatura a -1,6 °C. El punto de ajuste (Ítem O, Figura Suplementaria 2) debería parpadear. Esto indica que el sistema de refrigeración aún no está en el punto establecido.
   NOTA: La temperatura establecida en el sistema de refrigeración no es la misma que la temperatura dentro del bloque.
4. Encienda el interruptor detrás del bloque (Figura suplementaria 3). Asegúrate de que se encienda una luz verde Esto indica que el sistema de calefacción está ENCENDIDO, pero el control de temperatura no está activo.
5. Para activar el control de temperatura del sistema de calefacción, abre la interfaz en línea del bloque de gradiente de temperatura introduciendo la dirección IP 10.75.117.227 en un navegador. Inicia sesión con el nombre de usuario y la contraseña proporcionados para ver la temperatura de cada sensor (Figura suplementaria 4). Esta interfaz muestra los valores de los sensores, que se actualizan cada 3 segundos.
6. Ajusta la temperatura de calentamiento establecida a 60,00 °C pulsando las flechas arriba/abajo . Pulsa el botón ENCENDIDO para activar el sistema de calefacción.
   NOTA: El bloque tarda aproximadamente una hora en alcanzar un gradiente lineal estable de temperatura.
7. Diez minutos después de que el bloque haya sido ENCENDIDO, comprueba el control del calentador para asegurarte de que funciona. El instrumento funciona cuando la temperatura es diferente para cada sensor.

11. Montaje del analizador de gases

1. Siguiendo el manual de instrucciones del fabricante, enciende el analizador de gases pulsando el botón de encendido una vez. Espera 45 minutos a que el instrumento se caliente.
2. Conecta el PC a la red Wi-Fi del analizador de gas, identificada por el nombre de host único (TG15-XXXXX), y usa la contraseña para conectarte.
3. Escribe el nombre de host o la dirección IP en un navegador web y pulsa enter para conectarte. Luego, abre la sección de ajustes y selecciona reducir caudal. Si la opción ya está seleccionada, no cambies nada en el software.

12. Preparándose para cargar muestras

1. Ajusta el WHC siguiendo la sección 6 del protocolo 1 hora antes de comenzar la incubación.
2. Comprueba el control del calentador para asegurarte de que ha alcanzado la temperatura deseada 10 minutos antes de colocar las muestras en el bloque.
3. Enciende el conductor ambiental que se encuentra en el laboratorio.
4. Conecta el sistema de descarga y conecta el analizador de gases al ordenador.

13. Coleccionar cartuchos de fogueo

1. Registrar los espacios en blanco siguiendo estos dos procedimientos:
2. Conecta la línea de lavado al sistema de inyección del analizador de gases y registra directamente el_CO2 (en ppm) de la línea de descarga.
3. Coloca cinco frascos de vidrio de 60 mL en un portaobjetos vacío. Para cada vial, coloca una línea de descarga. Después de 1 minuto, saca la línea de descarga y tapa el vial. Espera cuatro horas antes de medir el_CO2 dentro de los viales.

14. Carga de muestras en el bloque de gradiente de temperatura

NOTA: En el bloque tendrás las posiciones de bloque A, B, C, D. Coloca la misma muestra en la misma posición del bloque a lo largo del bloque (Figura 10). Por ejemplo, la muestra número 175 va en la posición del bloque A del 1 al 22, la muestra número 45 va en la posición B del bloque del 1 al 22, etc.

Figura 10: Posiciones del vial dentro del bloque. La letra "S" indica sensor. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Abre el bloque, coloca el ordenador y el sistema de descarga sobre la tapa del bloque (Figura 11). Sobre una mesa móvil, coloca las cajas que contienen las muestras.
   NOTA: Lleva una mascarilla KN95 para minimizar la variabilidad del CO₂ en las muestras. Esto evita que el_CO2 de la respiración contamine los viales.
2. Prepara una hoja de cálculo para registrar la hora de cierre (hora: minuto) de cada vial individual y, en paralelo, visualiza la hora del analizador de gases.
   NOTA: El tiempo de cierre de cada vial se utiliza para la normalización de tasas durante el procesamiento de datos.
3. Empieza a cargar las muestras en el bloque de gradiente de temperatura. Trabaja en lotes de ocho muestras. Coloca las muestras sin tapa dentro del bloque, empezando por el extremo más frío. Esto significa que las primeras ocho muestras son A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2.
4. Coloca la línea de descarga en ocho viales y espera 1 minuto. Saca la línea de descarga y cierra inmediatamente los frascos. En una hoja de cálculo, anota el momento exacto en que cada frasco fue tapado.
   NOTA: Inserta cuidadosamente la línea de descarga en cada vial, asegurándote de que no entre en contacto con el suelo. Esto previene la contaminación cruzada y ayuda a mantener la integridad de la muestra.
5. Mientras los primeros ocho viales se enjuagan, carga el siguiente lote de muestras en el bloque de gradiente de temperatura. Por ejemplo, las muestras de lavado son: A1, B1, C1, D1, A2, B2, C2, D2. El siguiente lote de muestras que se añadirán son: A3, B3, C3, D3, A4, B4, C4, D4.
6. Coloca la línea de lavado en el siguiente lote de muestras.
7. Repite estos pasos hasta que el bloque esté completamente cargado.
8. Cierra el bloque y espera 3,5 horas desde el momento en que se cerró la última muestra.
9. Configura el analizador de gases en modo de suspensión, pulsando el botón de encendido dos veces en un plazo de 3 segundos.
10. Apaga el sistema de descarga usando la válvula roja situada en la pared.

Figura 11: Configuración del bloque del gradiente de temperatura de carga. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

15. Empezando con mediciones de_CO2

1. Saque el analizador de gases del modo de suspensión pulsando el botón de encendido una vez durante una hora antes de empezar con las mediciones de_CO2 . Revisa la configuración del analizador según lo indicado en la sección 8.
2. Encienda el sistema de lavado y coloque el analizador de gases sobre la mesa móvil (Figura 12).
   NOTA: La mesa móvil debe ser lo suficientemente alta para que el sistema de inyección del analizador de gases alcance todas las muestras.
3. Revisa la sección de diagnóstico del analizador de gases (Figura suplementaria 5). Asegúrate de que el estado del instrumento sea verde para todos los componentes. Aquí hay dos posibilidades:
   1. Si todo está en verde, empieza el análisis.
   2. Si hay componentes rojos o amarillos, consulta el manual del analizador de gases y, si es necesario, pide ayuda técnica. Si el error se corrige, procede con las mediciones de_CO2 . Si el error no se corrige, detén el experimento.
4. Abre la sección gráfica del analizador de gases para visualizar las mediciones en tiempo real. Ten en cuenta que el instrumento está midiendo constantemente el_CO2 del aire.
   NOTA: La pantalla de medición se retrasa ~3-5 segundos.
5. Después de 3,5 horas de incubación, comienza a medir las muestras. Empezando por las temperaturas más altas. Por ejemplo, las primeras muestras que se leen son: A22, B22, C22 y D22.
   NOTA: Lleva la mascarilla KN95 al medir muestras a temperaturas <15 °C. Esto reducirá el ruido en los datos.
6. Conecta la aguja de inyección del analizador a una línea de lavado entre muestras. Esto facilitará la limpieza de datos.
7. En la parte superior de la pantalla, hay una función REMARK en el software del analizador de gases. Cada vez que se mide una muestra, crea una observación ÚNICA y SENCILLA . No olvides pulsar COMENTARIO antes de ejecutar cada muestra.
   NOTA: Utilice números únicos o el ID único de la muestra como COMENTARIO. Si se comete un error en la OBSERVACIÓN, toma nota del tiempo en que se midió la muestra. Por ejemplo, toma nota de las inyecciones tardías, si el REMARK terminó antes o tarde, etc.
8. Inserta la aguja en el vial de muestra de 60 mL durante 20 segundos. Después de estos segundos, saca la aguja del frasco.
   NOTA: El analizador de gases tendrá problemas de presión si la aguja permanece dentro del vial de 60 mL durante más de 38 segundos. Evita esto porque el analizador de gases dejará de funcionar durante unos minutos, hasta que la presión se estabilize de nuevo.
9. Sigue estos pasos para leer muestras y los cinco blanks con el analizador de gases:
   NOTA: Pulsa el botón COMENTARIO en el software online del analizador de gases para comenzar y terminar una observación.
   1. Comienza el COMENTARIO en hh:mm:00.
   2. Introduce la aguja en el vial en hh:mm:10.
   3. Saca la aguja del vial en hh:mm:30.
   4. Alto el COMENTARIO en: hh:mm:45.
10. Cambia el filtro de 0,45 μm conectado a la aguja de inyección del analizador cada 16 muestras. Este filtro está diseñado para capturar humedad y evitar obstrucciones de los filtros dentro del analizador.
11. Repite estos pasos para todas las muestras.

Figura 12: Coloque el analizador de gases sobre la mesa móvil. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

16. Descarga de muestras del bloque de gradiente de temperatura

1. Una a una, saca muestras del bloque y colócalas en una caja. Sigue una de estas opciones:
   1. Descargando mientras mido CO₂.
   2. Descargando después de medir la última muestra de_CO2 .
      NOTA: Seleccione una de las dos opciones según los requisitos para el análisis de muestras futuras tras la incubación en bloque o el calendario de laboratorio. Por ejemplo, el paso 16.1.1 podría cambiar la duración de la incubación de algunas muestras, lo que podría afectar los resultados de análisis posteriores. El horario del laboratorio (por ejemplo, los horarios de apertura y cierre) también podría ser un factor limitante.
2. Procesar y almacenar muestras para análisis futuros.
   NOTA: En este caso, las 88 muestras se conservaron tras la incubación en bloque. Utilizando una espátula, toda la muestra se transfirió del vial de vidrio de 60 mL a bolsas de plástico preetiquetadas.

17. Descarga de los datos

1. Para extraer los datos recogidos con el analizador de gases, accede al software en línea del analizador. Haz clic en Configuración y luego pulsa el icono de Descargar .
2. Selecciona la hora específica en la que se midieron la primera y la última muestra. Haz clic en descargar.
3. Abre una nueva hoja de cálculo, selecciona Abrir archivo. Cambia la búsqueda de archivos a Todos los archivos (*.*) y busca el documento guardado en el paso anterior. Se abrirá una nueva ventana y luego seleccionará Terminar.

18. Apagar los instrumentos

1. Apaga el analizador de gases con el botón de encendido o a través de la interfaz de software. Para apagar el instrumento con el botón, pulsa el botón de Apagado tres veces en un plazo de 5 segundos.
2. Apaga el sistema de refrigeración. Pulsa bloquear (Ítem I, Figura Suplementaria 2) y el botón OK/Pump (Ítem E, Figura Suplementaria 2). El ruido blanco debería parar. Cuando el ruido blanco desaparezca por completo, pulsa el botón OFF abajo.
3. Apaga el sistema de calefacción. Apaga el sistema de control del bloque de gradiente de temperatura usando el interruptor detrás del instrumento. Asegúrate de que la luz verde se APAGUE (Figura suplementaria 3).

19. Conversión de_CO2 ppm en tasas respiratorias en μg C por kg de suelo por hora

1. Importa los datos del analizador de gases en un software de postprocesamiento (usamos R) y extrae las siguientes variables: REMARK, TIME,_{CO 2} y H₂O.
2. Crea una nueva columna para extraer los segundos de interés, específicamente de >30 s a <35 s.
3. Elimina cualquier observación que tenga problemas relacionados con caídas de presión. Durante el experimento, las caídas de presión pudieron haber provocado lecturas de_CO2 ligeramente inferiores a las esperadas. Estas ligeras caídas (entre un 3% y un 5% inferiores al valor anterior o siguiente) no son cambios reales en CO₂, sino más bien artefactos (errores) causados por la caída de presión. Por lo tanto, elimina los valores de_CO2 que han bajado ligeramente (~3-5%) en comparación con el valor anterior o siguiente de_CO2 .
4. Calcula la concentración media de CO₂ (ppm) para los datos restantes. Para cada muestra, resta la media de los cinco espacios en blanco medidos.
5. Importa los datos del laboratorio en un software de postprocesamiento (por ejemplo, R) y extrae las siguientes variables: REMARK, peso del suelo seco y tiempo de cierre.
6. Para convertir el_CO2 ppm medido por el analizador a μg C por g de suelo, aplica la Ecuación 2:
   
   donde la concentración de_CO2 medida por el analizador de gases se expresa en ppm; El peso molecular del_CO2 es igual a 44,01 g·^mol-1; P es la presión barométrica, es igual a 1 y se expresa en atm; R es la constante universal de gas igual a 0,082058 expresada en atm·^mol-1· ^K-1; El espacio de cabeza se calcula en función del espacio de cabeza de los viales de vidrio de 60 mL expresados en mL; T es la temperatura interna asumida del instrumento, igual a 293,15 y expresada en K; y el peso del suelo seco se expresa en g.
7. Luego, divide por el tiempo de incubación expresado en horas y multiplícalo por 1000 para convertir gramos en kilogramos de suelo.
8. Por último, convierte el μg de_CO2 en μg de carbono utilizando los pesos moleculares de CO₂ y C. Esto resultará en tasas respiratorias expresadas en μg C por kilogramo de suelo por hora.
9. Guarda o exporta los datos procesados para un análisis posterior.

Resultados

Estabilidad y distribución de la temperatura del bloque
Durante el desarrollo de este protocolo, probamos la linealidad y estabilidad temporal de la temperatura dentro del bloque. Tras encender el sistema de refrigeración y el calentador, el tiempo de inicialización del bloque es de aproximadamente una hora, durante la cual la mayoría de los ocho sensores de temperatura distribuidos uniformemente alcanzan la temperatura objetivo y luego permanecen constantes tras un sobrepaso (Figura 13A). Tras este periodo, las temperaturas registradas por los ocho sensores confirman una distribución lineal perfecta de la temperatura a lo largo del bloque de aluminio (Figura 13B).

Figura 13: Linealidad y estabilidad temporal dentro del bloque de gradiente de temperatura. (A) Estabilidad temporal de las temperaturas dentro del bloque durante el periodo de incubación, y (B) temperatura registrada por los sensores en el momento de inicio de la incubación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Temperatura del bloque y temperatura del suelo
Probamos el tiempo necesario para que la muestra de suelo dentro del bloque alcance la temperatura registrada por los ocho sensores (Figura 14). En este estudio, medimos la temperatura de las muestras de suelo en ocho posiciones diferentes dentro del bloque, situadas cerca de los sensores. Los sensores, situados dentro del bloque, estaban preestabilizados a la temperatura objetivo. Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, una vez que las temperaturas del bloque se establecieron, se colocaron muestras de suelo dentro del bloque. Para esta prueba, utilizamos sensores adicionales que están separados del bloque. Usamos 15 g de tierra, asegurándonos de que la sonda sensor estuviera en contacto total con el suelo. Las muestras de suelo se dejaron sin tapar y la temperatura se registró cada minuto durante un total de 30 minutos. Durante esta prueba, el bloque se cerró ligeramente para minimizar la variación de temperatura y reproducir tantas condiciones reales de utilización como fuera posible (completamente cerrado). Comprobamos que las muestras de suelo tardan aproximadamente 12 minutos en estabilizarse a la temperatura objetivo. Consideramos aceptable este tiempo de estabilización, dado que las incubaciones duran un mínimo de 3,5 horas. Además, evaluamos la linealidad de la temperatura del suelo tras 12 minutos de incubación en bloques. Los resultados indican que las temperaturas del suelo muestran una relación lineal, estrechamente alineada con la linealidad observada en los ocho sensores (Figura 15).

Figura 14: Temperatura del suelo registrada incubada a diferentes temperaturas. Las muestras A, B, C y D se incubaron en viales situados cerca de los sensores correspondientes (véase la Figura 10 para referencia). La temperatura del suelo se registraba mediante un termopar insertado directamente en las muestras de suelo. Las temperaturas específicas monitorizadas por cada sensor son las siguientes: (A) Sensor 1 (S1) a 4,1 °C, (B) Sensor 2 (S2) a 12,5 °C, (C) Sensor 3 (S3) a 20,1 °C, (D) Sensor 4 (S4) a 28,1 °C, (E) Sensor 5 (S5) a 36,1 °C, (F) Sensor 6 (S6) a 43,8 °C, (G) Sensor 7 (S7) a 51,9 °C, y (H) Sensor 8 (S8) a 60 °C. Después de colocar las muestras de suelo en el bloque, se tarda aproximadamente 12 minutos en alcanzar la temperatura objetivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 15: Fuerte correlación lineal entre la temperatura del suelo y la temperatura del sensor. Cuatro frascos con tierra se colocaron cerca de los ocho sensores en las posiciones de bloque A, B, C y D. La temperatura del suelo se registraba mediante un termopar insertado directamente en las muestras de suelo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Interacción temperatura-humedad
Existe una interacción inevitable entre temperatura y humedad que debe evaluarse durante el periodo de incubación. Por ejemplo, las altas temperaturas pueden acelerar la evaporación, mientras que las bajas pueden causar condensación del agua. Para esta prueba, utilizamos cuatro muestras de suelo seleccionadas al azar con diferentes texturas (Tabla Suplementaria 2). Según el protocolo, cada muestra de suelo se colocó en la misma posición de bloque en las 22 temperaturas. Los resultados muestran que, tras un tiempo medio de incubación de 3,5 h, temperaturas más altas provocaban una mayor pérdida de humedad en comparación con temperaturas más bajas, independientemente de la textura del suelo (Figura 16). Los suelos incubados a 60 °C perdieron de media el 12% del agua total añadida, mientras que los suelos incubados a 4,1 °C perdieron de media solo el 1,88% del agua total añadida. Esto significa que durante las 3,5 horas de incubación en bloques, los suelos se mantuvieron dentro de condiciones óptimas de humedad, entre el 50% y el 60% de capacidad de retención de agua, independientemente de la temperatura de^{incubación 44,45} (Figura suplementaria 6).

Figura 16: Pérdida relativa de humedad del suelo durante la incubación en bloques en cuatro muestras diferentes. La pérdida de humedad se calculó en relación con la cantidad total de agua añadida para ajustar por el WHC. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Mediciones de concentración de CO2
Para comprobar la precisión y exactitud del analizador de gases, realizamos cuatro mediciones de un gas de referencia certificado (413 ± 5 ppm CO₂), para las cuales el analizador registró 413,71 ± 0,60 (ppm CO₂, media ± SD). Esto confirmó la alta precisión y exactitud de las mediciones de_CO2 registradas por el analizador de gases. Además, para cumplir con las especificaciones del fabricante, debe realizarse una prueba anual utilizando un gas de referencia certificado.

Teniendo en cuenta el tiempo de retardo causado por la línea de inyección y el kit de reducción de caudal hacia el analizador de gases, se realizaron múltiples pruebas para determinar el tiempo óptimo de medición. Los resultados muestran que la línea de inyección provoca un retraso de aproximadamente cinco segundos. En este sistema, el tiempo ideal de medición es de 20 s, permitiendo suficiente tiempo para llenar la unidad de detección de CO₂ y alcanzar un equilibrio durante 5 s (Figura 17). Dado que el kit de reducción de caudal mide a una tasa de 1,17 mL/s, este tiempo de medición corresponde a muestrear el 39% del contenido de aire en los 60 mL de los viales. Además, observamos que cuando el analizador de gases se utiliza como un sistema cerrado, se produce una caída de presión. Esta caída se produce durante el intervalo de un segundo en el que no hay inyección de aire al extraer la aguja del vial. Para tener en cuenta esta caída de presión durante el procesamiento de datos, excluimos valores de_CO2 que son ligeramente inferiores (entre el 3% y el 5%) que el valor anterior o el siguiente.

Figura 17: Tiempo óptimo de medición para una muestra individual de suelo incubada a tres temperaturas diferentes. Este gráfico muestra el tiempo de inyección y extracción de la aguja, el equilibrio de CO₂ durante 5 s y la caída de presión asociada al marco temporal seleccionado. Incubation_ID muestra la posición del bloque (C) y las posiciones del vial (5, 10 y 15). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Probando el protocolo completo
Para evaluar la funcionalidad y reproducibilidad del protocolo, incubamos dos muestras diferentes, cada una con cuatro réplicas técnicas, a lo largo de las 22 temperaturas discretas que oscilaban entre 4 °C y 60 °C. Estas muestras de suelo fueron seleccionadas para demostrar el tipo de datos generados con este sistema y su desempeño. Las características específicas de la muestra pueden encontrarse en la Tabla Suplementaria 2. El bloque de gradiente de temperatura capturó de forma fiable las tasas de respiración del suelo de las diferentes muestras en cada punto de temperatura, permitiéndonos visualizar la curva de respuesta térmica. Además, las curvas de respuesta a la temperatura resultantes para todas las réplicas fueron casi idénticas, como refleja la pequeña desviación estándar alrededor de las tasas respiratorias medias en todas las temperaturas (Figura 18). Estos resultados demuestran una alta reproducibilidad y confirman la precisión del protocolo.

Figura 18: Tasas representativas de descomposición (Rs) de SOM para dos suelos, cada uno medido con cuatro réplicas técnicas incubadas a lo largo del gradiente total de temperatura. Los puntos representan la media de las tasas respiratorias a cada temperatura, y las barras de error indican la desviación estándar entre réplicas técnicas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Se realizó una segunda prueba para demostrar la aplicabilidad científica del protocolo. Medimos las tasas de respiración del suelo a lo largo del gradiente total de temperatura y ajustamos los datos utilizando el modelo de Arrhenius o MMRT (Figura 19). Estas muestras de suelo fueron seleccionadas para demostrar el rendimiento del sistema en curvas de respuesta de temperatura contrastantes (las características de la muestra se proporcionan en la Tabla Suplementaria 2). Los resultados muestran que los datos recogidos con el bloque de gradiente de temperatura pueden analizarse más a fondo probando diferentes teorías sobre la sensibilidad a la temperatura de las tasas de descomposición de SOM. Sin embargo, surgen desafíos al trabajar con suelo fresco en cualquier experimento. Durante el periodo de 10 días previo a la incubación, observamos comunidades fúngicas creciendo dentro de algunos de los frascos en muestras de suelo más allá del conjunto de muestras representativas. A pesar de nuestros esfuerzos por eliminar cuidadosamente las comunidades fúngicas sin alterar el suelo, este crecimiento afectó los resultados de algunas muestras (Figura 20). Por ello, decidimos descartar las muestras afectadas eliminando la muestra completa, no solo los viales individuales afectados por el crecimiento fúngico.

Figura 19: Resultados representativos y tasas de respiración (Rs) de cuatro muestras diferentes de suelo incubadas en el bloque de gradiente de temperatura. La línea roja representa el ajuste de Arrhenius (A,B), y la línea azul representa el ajuste MMRT (C,D). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 20: Patrones de frecuencia respiratoria en algunas muestras afectadas por el crecimiento fúngico. Estos resultados son ejemplos de (A,B) dos muestras contaminadas que fueron excluidas de análisis posteriores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Circuito básico NO/NC. " C" también puede etiquetarse como "COM" de Común. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Panel de control del sistema de refrigeración. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Interruptor del sistema e indicador de luz. (A) Interruptor del sistema de control del bloque de gradiente de temperatura; y (B) luz verde que indica que los sensores y el sistema de calefacción están ENCENDIDOS. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Control del bloque de calentamiento por gradiente de temperatura en la interfaz online. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 5: Sección diagnóstica del analizador de gases. Todo es verde significa que el instrumento está listo para las mediciones. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 6: Capacidad de retención de agua de suelos incubados a diferentes temperaturas, mediciones registradas tras 3,5 horas de incubación en bloques. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Instrucciones detalladas de cableado. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Lista de materiales con la cantidad requerida. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Características de las muestras de suelo utilizadas para la prueba de pérdida de humedad y el protocolo completo. Estas muestras fueron seleccionadas para demostrar la funcionalidad del protocolo. La clasificación de texturas sigue el sistema USDA, con la arcilla, el limo y la arena expresados en porcentajes. OC se refiere al contenido de carbono orgánico (g C·^kg-1 suelo), el pH se midió en agua y CaCO₃ representa el contenido de carbonato cálcico (g·^kg-1 suelo). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El uso de un bloque de gradiente de temperatura para medir la respuesta térmica a corto plazo de las tasas de descomposición de SOM presenta desafíos, especialmente para detectar las frecuencias respiratorias a bajas temperaturas. Las bajas temperaturas pueden inhibir directamente las actividades catalíticas de las enzimas intracelulares y extracelulares^46,47. Por lo tanto, el tiempo de incubación debe ser lo suficientemente largo para asegurar que las bajas tasas de respiración en el extremo inferior del rango de temperatura permitan una acumulación suficiente de_CO2 en los viales de vidrio para que esté dentro del rango de detección del analizador de gases. En este montaje experimental, la temperatura más baja fue de 4,1 °C; Estas muestras fueron las primeras en cargarse en el bloque y las últimas en analizarse, lo que proporcionaba un tiempo extra de incubación. Se encontró que los ~3,5 h de tiempo de incubación en bloque fueron suficientes para detectar cambios en la concentración de_CO2 en las muestras. Esta duración de incubación probablemente dependerá del tipo de suelo y, en particular, del contenido de materia orgánica. Por ejemplo, puede ser que los suelos arenosos con bajo contenido de materia orgánica requieran tiempos de incubación más largos que los suelos ricos en carbono. Sin embargo, en las pruebas aquí, se encontró que el tiempo de incubación de 3,5 h es generalmente suficiente para la mayoría de los tipos de suelo y niveles de contenido orgánico.

Además de optimizar el tiempo de incubación para la detección de CO₂ a bajas temperaturas, es igualmente importante minimizar la pérdida de humedad en el extremo superior del gradiente de temperatura. La humedad del suelo desempeña un papel crucial en el transporte, difusión y disolución de sustratos hacia comunidades^{microbianas 48}. Por ejemplo, la humedad del suelo puede limitar las tasas de respiración al restringir la difusión del sustrato a niveles bajos de humedad y reducir la disponibilidad de oxígeno a niveles altos^{de humedad 45,49}. Por tanto, minimizar la pérdida de humedad a altas temperaturas es relevante para evitar que la humedad limite el acceso microbiano a los sustratos. Aunque los viales de este protocolo estaban completamente sellados, el agua se condensaba en las tapas y las paredes internas de los frascos. Esta condensación se consideraba como humedad perdida del suelo. Por ello, redujimos el tiempo de incubación de 4 h, como en Robinson et al. 2017⁴¹, a 3,5 h. Aunque no fue posible mantener niveles de humedad completamente constantes en todos los tratamientos térmicos, los suelos se mantuvieron en niveles óptimos de humedad durante el periodo de incubación de 3,5 horas. Incluso a altas temperaturas, el WHC del suelo se mantuvo por encima del 50%, asegurando que la disponibilidad de agua no limitara el acceso microbiano a los^{sustratos 44,45}.

Otra consideración importante es el rango de temperatura de la incubación. Aunque el sistema de refrigeración puede alcanzar temperaturas tan bajas como -30 °C y el sistema de calefacción hasta 320 °C, el material aislante tiene una tolerancia de temperatura de -183 °C a 148 °C. Los viales de vidrio utilizados en este montaje pueden soportar 500 °C. Aunque estos rangos son amplios, incubar muestras por encima de 100 °C supone una preocupación de seguridad para el operador. Para evitar el sobrecalentamiento, se añadió una resistencia térmica que aseguraba que el sistema de calefacción se apagara automáticamente si el bloque de aluminio alcanza los 90 °C. La inclusión de esta resistencia térmica es crucial debido al exceso de inicialización observado (Figura 13A). Si la temperatura durante la inicialización supera los 90 °C, el sistema se desactivará. Dadas estas limitaciones, recomendamos operar este sistema hasta una temperatura máxima de 60 °C para un rendimiento seguro y fiable. Se requieren pruebas adicionales para incubar muestras de suelo por debajo de 0 °C para garantizar una detección fiable de_CO2 , ya que la condensación y la variabilidad asociada de humedad pueden afectar las mediciones a temperaturas bajo cero. Para este protocolo, elegimos un límite inferior de temperatura de 4 °C, en el que no se observó condensación. Si el sistema se utiliza en rangos de temperatura más amplios, recomendamos implementar directrices adicionales de seguridad térmica.

Otra posible limitación de este método es que el periodo de incubación relativamente corto no permite que las comunidades microbianas se adapten a los cambios de temperatura. La respuesta térmica de los suelos expuestos a un calentamiento sostenido ha sido el foco de numerosos estudios, especialmente con el objetivo de poner a prueba las teorías de adaptación^microbiana 27,43,47,50,51. Se ha propuesto la adaptación microbiana para explicar el efecto decreciente a lo largo del tiempo del calentamiento experimental en las tasas de respiración del^{suelo 47}. Sin embargo, la metodología presentada aquí se desarrolló para medir la respuesta a corto plazo a temperatura de las tasas de descomposición de SOM. Aunque es poco probable que la adaptación microbiana ocurra en periodos cortos^{de tiempo,} un estudio reciente utilizó una metodología similar para cuantificar la tasa de adaptación microbiana incubando suelos a partir de un gradiente geotérmico. En este estudio, se ajustó la MMRT para estimar parámetros clave, incluyendo los óptimos de temperatura y los puntos de inflexión. Al comparar estos parámetros entre suelos del gradiente geotérmico, los hallazgos muestran que la tasa de adaptación microbiana es significativamente menor que la tasa de^{calentamiento 52}. Este estudio destaca la importancia de comprender toda la curva de respuesta térmica, capturando especialmente el óptimo de temperatura y los puntos de inflexión de los procesos biológicos del suelo (Figura 19C,D). A la luz de estos hallazgos, recomendamos muestrear comunidades microbianas en múltiples puntos de temperatura durante la incubación en bloques para evaluar cómo la composición y funciones de la comunidad microbiana se correlacionan con las frecuencias respiratorias y los parámetros de sensibilidad a la temperatura.

El bloque de gradiente de temperatura descrito en este artículo ofrece ventajas significativas respecto a las metodologías tradicionales. Un beneficio importante es que permite a los investigadores medir las tasas de descomposición de SOM de manera eficiente y precisa a 22 temperaturas discretas con pequeñas cantidades de suelo. Esto representa una mejora metodológica en comparación con incubar muestras de suelo a unas pocas temperaturas discretas, lo que obliga a los investigadores a aplicar el coeficiente de temperatura Q₁₀, un método que muchos estudios han^{cuestionado en 12, 13 y 15}. Otro beneficio significativo es que este montaje recopila datos que capturan claramente la forma y la inclinación de la curva de respuesta térmica. El número de tratamientos a temperatura discreta a lo largo de un amplio gradiente de temperatura nos permite identificar la temperatura del punto de inflexión y el óptimo de los procesos biológicos, lo que permite comparaciones entre tratamientos. Los ejemplos presentados en este manuscrito muestran dos patrones distintos (Figura 19A, B frente a Figura 19C, D), que los investigadores pueden analizar más a fondo utilizando diferentes teorías de sensibilidad a la temperatura. Algunos ejemplos apoyan la teoría de Arrhenius, donde las velocidades de reacción aumentan exponencialmente con la temperatura (Figura 19A,B). En contraste, otros ejemplos se alinean con la teoría de la MMRT, mostrando una respuesta unimodal con un óptimo claro de temperatura (Figura 19C,D). Estos dos patrones diferentes indican que el protocolo de incubación por bloques de temperatura presentado es capaz de reproducir ambos tipos de curvas de respuesta, lo que puede utilizarse para probar teorías sobre la sensibilidad a la temperatura de las tasas de descomposición de SOM, profundizando así nuestra comprensión de la termodinámica, la biología y la química.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fusible de vidrio de 630 mA	RS	563-637	https://uk.rs-online.com/web /p/fusibles-cartucho/0563637?gb=s
Sellador adhesivo	Innotec	01.2451.0000	https://www.innotec.nl /producten/adheseal
Bloque de aluminio y bloque de aluminio;	Metaalketen	96082150.1	https://www.metaalketen .com/aluminio/
Cinta de aluminio	Manutan	A159435	https://www.manutan.nl/nl/mnl/aluminiumtape -met-schutlaag-50565-50-m-x-50-mm-tesa -a159435?shoppingab=true&; gad_source= 1&; gclid=CjwKCAjw74e1Bh BnEiwAbqOAjE5Tw3-r3xiW 9FWALDZMlVUWpqJpQQ R_zwwXR8_R6Sb1Ce_8v x96jxoCtx4QAvD_BwE
Cable negro	RS	361-787	https://nl.rs-online.com/web /p/cable-conectado/0361787
Cable azul	RS	724-4392	https://nl.rs-online.com/web /p/cable-conectado/7244392
Alambre marrón	RS	724-4395	https://nl.rs-online.com/web /p/cable-conectado/7244395
Prensaestoupas	RS	807-9786	https://nl.rs-online.com/web/p /glándulas-cables/8079786?cm_ mmc=NL-PLA-DS3A-_-goog le-_-CSS_NL_EN_Cables_% 26_Wires_Whoop-_-(NL:Who op!)+Cable+Glándulas-_-807978 6& tipo de coincidencia=&; aud-8271861 83926:pla-339598489905& gcli d=Cj0KCQiAw8OeBhCeARIsA GxWtUyscrqjF3FwA6j2jqUyeg_ s70tOXBRuYRF90pwubv3Po8v sbZSJhV4aAq84EALw_wcB& gc lsrc=aw.ds
Sierra circular	Ryobitools	RWSL1801M	https://nl.ryobitools.eu/elektrisch-g Ereedschap/Zaagmachines/Cirkelz AGEN/RWSL1801/RWSL1801M/?gad_so urce=1& gclid=Cj0KCQjw2ou2BhCC ARIsANAwM2Easx4PAZzvVYvFFUD ZKemTdqNDXsde_NDPSB8FAlGu7 8Hzy2j3TuoaAhTjEALw_wcB
Cierres	Kramp	HS491976	https://www.kramp.com/shop-nl/nl/p /verstelbare-haakvergrendeling-118- 128-typ.3--HS491976
Agente refrigerante más fresco y natural	Dijkstra Vereenigde	L035004186	https://www.laboratorium-apparatuur .nl/ika-rc2-green-basic-koelthermo staat-30-c-bad-volume-4-litros-l035004186
DIN Rail	RS	648-5722	https://nl.rs-online.com/web/p/din-ra ils/6485722?cm_mmc=NL-PLA-DS 3A-_-google-_-CSS_NL_NL_Pmax _Test-_--_-6485722& tipo de coincidencia=&; & g ad_source=1& gclid=CjwKCAjw8f u1BhBsEiwAwDrsjOqGDs92gjrJHkp SsYmOiS0OK6tC9U_fMHEhlmvu7r SbNp8VnmuDERoCC0UQAvD_ BwE& gclsrc=aw.ds
Puentes dobles	RS	803-7530	https://nl.rs-online.com/web/p/din-rail -terminal-accessories/8037530?sear chId=11c9702f-3312-4bb0-a826-e9d 50bd91ee1& GB=S
Cable Ethernet	RS	657-2090	https://nl.rs-online.com/web/p/ Cable-Ethernet/6572090
Mascarilla facial	KN95	NA	https://www.bol.com/nl/nl/p/kn95- mascarilla-facial-desechable-ffp2-x-1-máscara s-kn95-wegwerp-gezichtsmasker-ffp 2-x-1mondkapjes/930000000131403 0/? Referrer=NLGOOFS&; utm_source =google& utm_medium=free_shopping
Conector hembra	qosina	17642	https://www.qosina.com/female- Conector-de-candado a luer-femenina-17642
Filtro 0,45 & micro; m	Whatman	10462650	https://us.vwr.com/store/product/1394 3097/whatmantm-puradisc-aqua-30-m m-jeringe-filter-0-45-m-whatman- products-cytiva
Aislamiento flexible (manguera)	Celsis	4600000198	https://www.celsisbv.nl/k-flex-plaati solatie-op-rol-st-10e-1x10mtr-10mm .-bl-s3-d0/4600000198?gad_source =1& gclid=Cj0KCQjw8MG1BhCoARI sAHxSiQknvLK3RcqgqXwR1Ma7V PznSz8IasKUGvLo0SySzLiff2o_kK Vjip0aAtATEALw_wcB
Tubo flexible	Avantor	MFLX06491-14	https://www.avantorsciences.com /de/en/product/38670173/bev-a- línea-v-transfer-pump-tubing
Kit de reducción de caudal	LICOR	7800-113	https://www.licor.com/support /Analizadores-de Traza-Gas/temas/re duced-flow-rate-kit-7800-113.html
Terminal portafusibles	Elektramat	401144228	https://nl.mouser.com/ProductD etail/Phoenix-Contact/3270200? qs=zdVlZaK%252BC241RFTPi Xj4mA%3D%3D& mgh=1&; utm_i d=20328035028& gad_source=1 & gclid=CjwKCAjw8fu1BhBsEiwA wDrsjBg9elAMYS9bWJ1Bd086J 7fGBWvcRWZ51okdr2qJgOlOTd BdrUZ_rBoCvuUQAvD_BwE
Analizador de gases	LICOR	LI-7815	https://www.licor.com/env/ productos/gas-traza/LI-7815
Frascos de vidrio con tapas 60 mL	Cole-Parmer	GZ-99535-25	https://www.coleparmer.com/i/ Cole-Parmer-Precleaned-EPA- Viales-Cristal-Transparente-60-ML-72-Cs/9953525
Cable verde/amarillo	RS	721-0636	https://nl.rs-online.com/web /p/cable-conectado/7210636
Asas	RS	456-539	https://nl.rs-online.com/web/p/ manillas-armario-han dles/0456539
Varas calefactoras	RS	860-6984	https://www.reichelt.com/nl/nl/shop /producto/verwarmingspatroon_hotr od_20_0x250_mm_1250_w_230_ v_-317248? PROVID=2809&; gad_s ource=1& gad_campaignid=22415 164764& gbraid=0AAAAADwnxtY mY6n2NPja4HF_ftn_kJY-U& gcli d=CjwKCAjwiNXFBhBKEiwAPSa PCaYMjfVMKQazvkQk_deE2koc XA9SZ_ltbPIefniuRsmzBwN_oQ rfQhoCegUQAvD_BwE
Bisagras	RS	448-1497	https://benl.rs-online.com/ Telara/P/Bisagras/4481497
Manguera	Wildkamp	750568	https://www.slangenboer.nl/wat erslang-cristal-al-961?channabl e=41cdee736b7500534230313 0353131333924& bg_source=ga & bg_campaign=21584331548& bg_kw=pla-2939467777986-mi-1 09646330-pi-SB01051139-ppi- 293946777986& bg_source_id= 709628610149& gad_source=1 & gad_campaignid=215843315 48& gbraid=0AAAAADegGXwz 91MJFzGxBRxjCSRew10eG& gclid=CjwKCAjwiNXFBhBKEiw APSaPCZNCdBEfvnV2pYYPeV SQaiG_UKP0q_eknv0lC_N_0Y WIIZQvze8TEhoCzPUQAvD_BwE
Barbilla de manguera	Wildkamp	11000357	https://www.wildkamp.nl/pro conducto/slangtule-RVS-316L-Lost-W AX-buitendraad-X-Slangtule-BS P-X-10-0-mm/11000357
Aguja de inyección	Merkala	303262	https://www.merkala.nl/bd-mic rolance-injectienaalden-18g-ro ze-1-2x40mm-100-stuks.html? gclid=CjwKCAjw_Na1BhAlEiw AM-dm7DrC9mGkmpNN8krYe CmkvpEeSv4CuH3I2Px71KJxY YSm-vjVu2LclRoCwuwQAvD_BwE
Analizador de gases de tubo de inyección 1/4"	VWR	MFLX06491-12	https://us.vwr.com/store/pr Oducto/39537334/Bev-A-Line- V-Transfer-bomba-tubo
Material aislante	Technische Unie	3603842	https://www.technischeunie. nl/product/prd1899911190
Acoplamientos de rodilla	Kramp	MMI9006K	https://www.kramp.com/shop-nl/ NL/P/Haakse-Koppeling-Instelbaa R-BU-BU-3-8-BSP--MMI9006K
Tubo de gran diámetro 3/8"	Avantor	39213360	https://www.avantorsciences.co m/us/en/product/39213360/mast erflex-transfer-tubing-flexible- vinyl-avantor
Tornillos M6, Hex	RS	281-120	https://nl.rs-online.com/web/p/so cket-screws/0281120?srsltid=Afm BOorVGq-ZyA2yrJG1kU7SHGiZ EblaRz0nDmX7MwhzIRjcc6P4YIYE
Caja principal de conexiones	RS	Revisa a Dia.	https://nl.rs-online.com/w eb/p/general-purpose-enclo sures/2896320?gb=s
Conector macho	qosina	12090	https://www.qosina.com/male- a-macho-luer-lock-connector-12090
Luer masculino	Alternado	BPC04M	https://www.waltersmedical.co. uk/product/nibp-connector-male-luer-slip/
MCB - Siemens SENTRON	RS	3RF2320-1AA02	https://nl.rs-online.com/we b/p/mcbs/2383188?gb=s
Alimentación PE/DND	RS	687-9411	https://uk.rs-online.com/we b/p/din-rail-terminal-blocks/ 6879411?searchId=c9a9c1 b1-3def-40d0-8b14-b792f8269615& GB=S
LED de indicación de energía	RS	909-2437	https://uk.rs-online.com/ web/p/pilotos/9092437?gb=s
Suministro eléctrico	Antratek	X-2902992	https://nl.rs-online.com/web/ p/din-rail-power-supplies/054 0731?srsltid=AfmBOoqMPIO Av7bZd1Qu_Acy3KMFR0-x OD_Hkw3NeQCYyzKJLzEGXzxQ
Puentes de director de quintíples	RS	803-6713	https://uk.rs-online.com/web /p/din-rail-terminal-blocks/80 36713?searchId=7de6627a- 3634-42ed-a600-2e3ce8974fe7&; GB=S
Cable rojo	RS	361-822	https://nl.rs-online.com/web /p/cable-conectado/0361822
Terminal anular 2,5 mm²	RS	534-569	https://uk.rs-online.com/ web/p/terminales de anillo/0534569
Sensores	Antratek	X-DTS-S3C	https://www.antratek.nl/dig sensor-temperatura-ital-cable 1m
Septa Red Butyl	HomeGreen	A255	https://www.homegreen.nl/la b-benodigdheden/septa-rood -butyl-20-mm?srsltid=AfmBO ooStonU5v9Q9j7i_RgQMJ9F m6ZVbPbIRU0cD1_47-BEVmb1r5I5
Paso de conductor único	Elektramat	401167865	https://www.elektramat.nl/ catalogsearch/result/?q=401167865
Cable de alimentación monofásico	RS	626-6694	https://nl.rs-online.com/w eb/p/cables de alimentación/6266694?gb=s
Cable monofásico	RS	775-6123	https://uk.rs-online.com/web /p/cable-power/7756123?gb=s
Caja de conexiones pequeña	RS	498-5387	https://nl.rs-online.com/web/p /recintos de uso general/4985387
Relé de Estado Sólido	RS	467-4762	https://nl.rs-online.com/web/p /relés de estado sólido/4674762
Taladro en espiral	Ericks	10471300	https://shop.eriks.nl/nl/gereed schappen-verspanende-geree dschappen-boren-hss-en-hsse -boren-cilindrische-schacht/spir aalboor-din340-hsse-geslepen- type-ti-5-80mm-12592599/?srslt id=AfmBOoopMLgX1mtyuUxkU KU7jW4fYY1bY5wSTvSGQUkO zTc6E2wdxUZQ
Carcasa y tapa de acero inoxidable	247 Tailore steel		https://247tailorsteel.com/nl/?ut m_term=24%207%20steel& utm _campaign=B+-+NL+-+247tailo rsteel+-+NL+-+Doelvertonings percentage+%3E+Conv.+Waa rde+met+Doel-ROAS&; utm_so urce=adwords& utm_medium= ppc& hsa_acc=2007690635 & h sa_cam=783787418& hsa_grp =118504886580& hsa_ad=67 1662182959& hsa_src=g&; has _tgt=KWD-374862287021&; hs a_kw=24%207%20steel& has _mt=p& hsa_net=adwords& has _ver=3& gad_source=1&; gclid= Cj0KCQjw8MG1BhCoARIsAHx SiQnhmktBk_3c_wobSJobrTVp4 _nqiW26Zt7XzSkHdK-htW8medy NCcQaAjbrEALw_wcB
Conmutador de dos vías	RS	746-9336	https://nl.rs-online.com/web/p /manillas-interruptor-de leva/7469336
Puente terminal	Elektramat	401043503	https://www.elektramat.nl/phoenix-c ontact-doorverbindingsbrug-voor-rijg klem-2-polig-5-2-mm-rood-fbs-2-5/?c hannable=0141ac6964003330383936 ec& utm_source=google-surfaces&; utm _medium=organic& bg_source=ga& bg_ campaña=19011971421& bg_kw=-mi-9 214030-pi-401043503-ppi-& bg_source _id=&; gad_source=1&; gclid=CjwKCAjw 8fu1BhBsEiwAwDrsjE2kRcDZUHPupfy haLoTzWLqM9v8HKaiI67st4UOmUXIN 9OaI25ALRoCvmUQAvD_BwE
DAQ del termostato	Antratek	X-300-I	Temperaturaü Berwachung & Termostato (+X-DTS-S3C) von ControlByWeb (antratek.nl)
Fresadora universal	Mach4Metal	MACH-ID 7580	https://mach4metal.com/en /fresadoras/cnc/fehlm ann-picomax-p54-2
Paso conductor Wago 3	RS	803-6713	https://nl.rs-online.com/web/ p/din-rail-terminal-blocks/80 36713?cm_mmc=NL-PLA-D S3A-_-google-_-CSS_NL_N L_Pmax_0525-_-803671 3& tipo de coincidencia=&; & gclsrc=aw.d s& gad_source=1&; gad_campa ignid=22555696009& gbraid=0 AAAAADkeWNNXeREaDmJ5n yYqYMqp-c7A6& gclid=CjwKCAj wtfvEBhAmEiwA-DsKjilXxL8uO 4Jo6XyDesHGaQkoz6Ggi4ATI6 FUInWV9TxmIX519DGIZBoCh9 YQAvD_BwE
Conector Wago	RS	883-7557	https://uk.rs-online.com/ web/p/standard-terminal-b locks/8837557?gb=s
Fundas de extremo de cable (100 pc)	Elektramat	401173609	https://www.elektramat.nl/solar -adereindhuls-geisoleerd-2-5mm 2-hulslengte-8mm-blauw-per-100 -stuks-1505145/?channable=014 1ac6964003430344a4& utm_source =google-surfaces& utm_medium =organic& bg_source=ga& bg_c ampaign=17673967332& bg_kw= -mi-9214030-pi-401173609-ppi-& bg _source_id=&; gad_source=1&; gclid= CjwKCAjw8fu1BhBsEiwAwDrsjNms VYTNZ5TuXEHtsF34hcY-T5kLFnhi zir1fUsR3UYcG9bxmugqJRoCp_Y QAvD_BwE