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Inyección intratecal lumbar de SOD1-ASO para la dirección precisa del SNC y la eficacia predictiva en ratones humanos SOD1-G93A ALS

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DOI:

10.3791/69788

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24 de febrero de 2026

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1Biogen

En este artículo

Resumen

Este artículo detalla métodos de administración intratecal para terapias dirigidas al SNC en ratones adultos, centrándose en la precisión del protocolo y en la posibilitación de inyecciones repetidas. Incluye hallazgos de un estudio de validación en el que los oligonucleótidos antisentido redujeron la expresión mutante de SOD1 en ratones modelo SOD1-ALS, lo que respalda la utilidad del enfoque en la investigación preclínica sobre enfermedades neurodegenerativas.

Resumen

La administración intratecal (IT) de terapias dirigidas al sistema nervioso central (SNC) ofrece una vía mínimamente invasiva para la administración directa de fármacos en el líquido cefalorraquídeo (LCR), facilitando una mayor especificidad y el compromiso del objetivo. Aunque la cateterización IT es estándar para un parto sostenido en ratas, su aplicación en ratones está limitada por limitaciones anatómicas y un mayor riesgo de complicaciones relacionadas con el procedimiento, incluyendo lesiones y infecciones medulares. Para superar estas limitaciones, empleamos una técnica aguda de punción con aguja para la administración de fármacos IT en ratones adultos, proporcionando una alternativa reproducible y menos invasiva, compatible con regímenes de dosificación única o repetidos. En un modelo transgénico de ratón de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) que alberga la mutación SOD1-G93A, logramos una administración eficiente de TI de oligonucleótidos antisentido (ASOs) dirigidos al gen SOD1. Este enfoque redujo eficazmente la expresión de SOD1 mutante y mejoró significativamente el fenotipo de la enfermedad, como demuestran evaluaciones electrofisiológicas y de biomarcadores. Estos resultados validan tanto el método de administración de TI como la eficacia terapéutica, con resultados comparables a la administración intracerebroventricular (ICV). Lo más importante es que la técnica refleja los procedimientos utilizados en estudios clínicos en humanos, ofreciendo una fuerte relevancia y utilidad traslacional en la evaluación preclínica de intervenciones dirigidas por el SNC. Aunque se requiere experiencia técnica para garantizar la coherencia y evitar efectos fuera del objetivo, esta estrategia de entrega de TI representa una metodología robusta, reproducible y clínicamente relevante para avanzar en el desarrollo terapéutico en modelos animales pequeños.

Introducción

En este estudio, describimos un protocolo de inyección intratecal lumbar (IT), lo comparamos con la administración intracerebroventricular (ICV) y evaluamos los resultados farmacodinámicos y la tolerabilidad para guiar el desarrollo de terapias dirigidas al sistema nervioso central (SNC). Las terapias dirigidas al ARN, especialmente los oligonucleótidos antisentido (ASOs), representan una modalidad prometedora para las enfermedades del SNC al permitir la modulación post-transcripcional de la expresión génica. Estos enfoques son especialmente relevantes para los trastornos neurodegenerativos, donde la pérdida neuronal progresiva subraya la necesidad de intervenciones precisas, localizadas y oportunas para modificar potencialmente la progresión de la enfermedad. Aquí, comparamos directamente la eficacia del protocolo de inyección de TI con la administración de ICV para terapias ASO.

En estudios preclínicos, se han utilizado inyecciones intratecales lumbares en ratones adultos (machos o mujeres, de 30 a 70 días, peso de 13-20 g) para administrar agentes farmacológicos o vectores biológicos directamente al líquido cefalorraquídeo (LCR) para el sistema nervioso centraldirigido a 1,2. Los volúmenes de inyección de 5-10 μL se administran típicamente de forma lenta para limitar los aumentos transitorios de presión de LCR y el reflujo, lográndose el acceso intratecal a través del espacio intervertebral L5-L6 1,2. El éxito del procedimiento depende de una técnica cuidadosa para evitar lesiones neurológicas, ya que la edad y el peso corporal influyen en el volumen y el manejo del LCR. El uso de agujas de calibre fino (por ejemplo, una aguja de 27-30 g acoplada a una jeringuilla Hamilton de 25 μL) permite una administración fiable2. Los principales desafíos técnicos incluyen minimizar las pérdidas de espacio muerto, prevenir inyecciones y fugas epidurales, y reducir la variabilidad dependiente del operador que puede afectar la precisión de la dosificación y la distribución del LCR.

Desarrollar terapias eficaces para los trastornos del SNC sigue siendo un gran desafío debido a la complejidad estructural y la heterogeneidad celular del SNC. Estas características dificultan la administración dirigida de fármacos y restringen la biodistribución a través de múltiples barreras anatómicas y fisiológicas, lo que requiere estrategias especializadas de administración. Un obstáculo clave surge de barreras fisiológicas y anatómicas en todo el SNC que restringen la penetración de fármacos. El cerebro y la médula espinal están envueltos en tres capas meníngeas: la duramadre madre, la aracnoidea y la pía mater, que, junto con la barrera hematoencefálica (BBB), proporcionan una defensa formidable contra los tratamientos circulantes y otras moléculas en la sangre. Aunque son vitales para mantener la estabilidad del SNC, estas barreras dificultan significativamente la administración de grandes moléculas hidrofílicas como los ASOs, anticuerpos monoclonales y vectoresvirales 1,2,3,4. La administración de TI ofrece una forma de eludir estas restricciones introduciendo los tratamientos directamente en el LCR dentro del espacio subaracnoideo. Esta vía de administración facilita la distribución de fármacos a través de los compartimentos del SNC, promoviendo una penetración más amplia de los tejidos y, de este modo, permitiendo un compromiso efectivo con objetivos expresados en diversos tipos celulares dentro del SNC. Desde su uso inicial por Hylden y Wilcox en 1980 para la administración de morfina enratones 1, las inyecciones de IT se han convertido en un método cada vez más utilizado para administrar una variedad de agentes terapéuticos, incluyendo moléculas pequeñas, biológicos, vectores de terapia génica y ASOs 5,6,7,8,9,10.

Los ASO son oligonucleótidos de cadena simple diseñados químicamente para unirse a secuencias complementarias de ARN y modular la expresión génica mediante mecanismos como la degradación mediada por RNasa H, la modulación por empalme y la inhibición estérica de la traducción 11,12,13,14,15. Mejoras químicas como modificaciones en la columna vertebral fosforotioace, sustituciones de 2'-O-metoxietilo (2'-MOE) y residuos etílicos restringidos aumentan su estabilidad, afinidad de unión y resistencia anucleasas 6. Estas propiedades han apoyado su aplicación en el ataque a genes patógenos implicados en trastornos neurogenéticos. Los tratamientos basados en ASO administrados intratecalmente han demostrado beneficio clínico en enfermedades como la atrofia muscular espinal (SMA) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)12,13,14,15. Por ejemplo, Nusinersen (Spinraza) mejora la inclusión del éxón 7 en transcritos SMN2 para compensar la pérdida de SMN1 en SMA 7,14. Estrategias similares dirigidas a transcritos de huntingtina mutante también se exploraron en la enfermedadde Huntington 12,13. Aunque estos ensayos se concluyeron a principiosdel 16, subrayan el interés continuo en los enfoques ASO dirigidos por el SNC.

La ELA es un trastorno neurodegenerativo fatal caracterizado por una degeneración progresiva tanto de las neuronas motoras superiores como inferiores. La enfermedad, que afecta entre 6 y 9 individuos por cada 100.000 habitantes en todo el mundo y que ocurre a una tasa aproximada de 2 casos por cada 100.000 personas-año, presenta un empeoramiento gradual de la debilidad muscular y la espasticidad, con la mayoría de los pacientes sucumbiendo a insuficiencia respiratoria neuromuscular en un plazo de 2 a 3 años tras el inicio delos síntomas a los 17. Aunque la mayoría de los casos son esporádicos (sAL), alrededor del 10% son familiares (fALS), lo que ofrece información sobre los factores genéticos que impulsan la enfermedad. Entre los genes más estudiados está la dismutasa superóxida de Cu/Zn 1 (SOD1), que representa entre el 15 y el 20% de la fALS, menos del 2% de la sALS, y se hereda de manera autosómicadominante 18. SOD1 codifica una enzima antioxidante citoplasmática que desintoxica especies reactivas de oxígeno convirtiendo los radicales superóxidos en peróxido de hidrógeno. Las formas mutantes de SOD1, como G93A, A4V y H46R, presentan inestabilidad conformacional, lo que conduce a la agregación de proteínas y a una ganancia tóxica de función que contribuye al estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y excitotoxicidad 19,20,21,22,23,24,25. Además, la patología de la ELA se agrava por mecanismos autónomos no celulares que involucran la microglía y los astrocitos, que contribuyen a un ambiente inflamatorio crónico y a una lesión neuronalprogresiva 26,27,28,29. Por tanto, silenciar la expresión de SOD1 mediante ASOs presenta una vía terapéutica prometedora para mitigar la patogénesis de la enfermedad.

El modelo transgénico de ratón SOD1-G93A (cepa Jax #: 004435), que expresa la forma mutante humana G93A de SOD1 bajo el control del promotor endógeno humano de SOD1, recapitula de cerca las características clínicas de la ELA, incluyendo déficits motores tempranos, neurodegeneración medular y supervivenciareducida 30. Estudios preclínicos previos han demostrado que administrar ASOs específicos de SOD1 mediante un parto intraventricular sostenido utilizando bombas osmóticas en ratas SOD1-G93A al día posnatal 65, con una dosis diaria de 100 μg durante 28 días consecutivos, resulta en una supresión significativa de los niveles de SOD1, reducción de las respuestas neuroinflamatorias, aparición tardía de signos clínicos y mejora del rendimiento motor.. Además, la reducción mediada por ASO de SOD1 en personas que viven con SOD1-ELA se ha asociado con reducciones en los niveles de cadena ligera de neurofilamentos (NfL), un biomarcador sanguíneo indicativo de dañoaxonal 32. En esta investigación, administramos ASOs dirigidos a SOD1 mediante inyección de IT en ratones SOD1-G93A y evaluamos su impacto en lecturas moleculares, electrofisiológicas y de biomarcadores. El análisis cuantitativo del tejido medular reveló reducciones significativas en los niveles de ARNm SOD1. Las evaluaciones electrofisiológicas de los potenciales de acción muscular compuestos (CMAPs) demostraron la función neuromuscular preservada. Al mismo tiempo, los niveles séricos de NfL disminuyeron, reflejando una mitigación de la lesión neuronal continua.

Para evaluar la distribución espacial y la eficacia relativa de métodos alternativos de administración del SNC, incluimos un brazo comparativo que emplea inyección intracerebroventricular (ICV), en el que el agente terapéutico se introduce en los ventrículos laterales para su difusión mediante flujo de LCR a lo largo de los espacios ependimosos yperivasculares 33. Al comparar las vías de administración de TI y ICV, pretendimos delimitar diferencias en los resultados farmacodinámicos y la segmentación tisular, refinando así las estrategias de administración de terapias ASO dirigidas por el SNC. Además, para evaluar la viabilidad traslacional, realizamos estudios independientes de tolerabilidad que incluyeron hasta cuatro inyecciones de ITs por animal con un intervalo de ocho semanas. En todos los regímenes probados, no se observaron signos evidentes de malestar o morbilidad, lo que apoya la tolerabilidad de la dosificación de ASO de ITs en el contexto de la supervivencia. Estos resultados son consistentes con informes previos que demuestran la tolerabilidad de inyecciones intratecales repetidas enratones 34.

La relevancia clínica de la entrega de ASO en TI se ve reforzada por las recientes aprobaciones regulatorias de tofersen (QALSODY®) para la ELA35 asociada a SOD1. Los estudios clínicos demostraron un compromiso robusto de los objetivos, reflejado en reducciones en la proteína SOD1 del LCR, seguidas de disminuciones en los niveles de la cadena ligera de los neurofilamentos, un biomarcador de la lesión neuroaxonal. Aunque el objetivo principal no se alcanzó en el ensayo inicial de fase 3 de VALOR, análisis integrados, incluida la extensión abierta, sugirieron posibles beneficios de iniciar el tratamientomás temprano 35.

En conjunto, los datos aquí demuestran que la entrega de ASOs dirigidos a SOD1 en el modelo murino SOD1-G93A ALS logra un knockdown molecular efectivo, mejora de biomarcadores y preservación funcional con tolerabilidad favorable. Estos resultados apoyan la entrega de ASO de TI como un enfoque racional y clínicamente viable para los trastornos genéticos del SNC y proporcionan un marco preclínico sólido para el desarrollo traslacional continuo.

Protocolo

Todos los procedimientos aquí fueron aprobados y realizados de acuerdo con los protocolos aprobados por la IACUC y las directrices institucionales de higiene química y bioseguridad.
NOTA: Realizar estudios en ratones transgénicos C57BL/6J (JAX #000664) y SOD1-G93A (JAX #004435) alojados bajo condiciones estándar (ciclo claro/oscuro de 12 horas, 22-24 °C, acceso ad libitum a alimentos y agua).

1. Aplicación de ASOs químicamente modificados para atacar SOD1 humano

  1. Emplear oligonucleótidos antisentido validados (ASOs) para dirigirse específicamente a los nucleótidos 613-629 dentro de la región no traducida 3' (UTR) del gen SOD1 humano (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*G*T*ToToA*T*C
  2. Incluir modificaciones químicas validadas para mejorar la estabilidad y eficacia, incorporando MOE (2'-O-Methoxyethyl) (indicado en fuente normal), cEt (etil restringido) (cursiva), ADN (negrita), enlaces fosfatados (o) y fosforotioiato (*), como se informópreviamente 36. El Archivo Suplementario 1 presenta la química de la ASO con la correspondiente codificación de colores.
  3. Preparar un ASO de control no dirigido, sin complementariedad a genomas humanos o de roedores, siguiendo el mismo esquema de modificación para su uso como control: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*AoGoGoA*A

2. Preparación y manejo de soluciones ASO en condiciones estériles

  1. Reconstituir ASO en líquido cefalorraquídeo artificial estéril (aCSF; Tabla 1) a una concentración de 10 mg/mL en condiciones estériles, con un volumen final de inyección de 10 μL (100 μg) por animal.
  2. Mezcla la solución suavemente con una pipeta estéril para mantener la integridad molecular, luego haz un vórtice suave durante 5-10 segundos para asegurarte de que está bien mezclada.
  3. Filtra la solución diluida a través de un filtro de jeringuilla estéril de 0,2 mm para eliminar partículas y contaminantes.
  4. Asépticamente alicuota la solución final en tubos estériles de microcentrífuga y almacena a 4 °C en una unidad controlada y controlada por temperatura durante hasta 1 semana, evitando ciclos de congelación y deshielo para mantener la estabilidad.

3. Preparación del ratón antes de la inyección intratecal

  1. Pesar cada ratón hasta los 0,1 g más cercanos usando una balanza digital, luego transfiere a un cono nasal e inducir anestesia con isoflurano a una concentración del 2-2,5% en oxígeno; Monitoriza la profundidad continuamente y confirma el plano quirúrgico por la pérdida del reflejo pedal.
  2. Prepara una almohadilla térmica controlada por termostática y ajustala a 37 °C para soportar a los ratones durante la preparación y recuperación.
  3. Aplica lubricante oftálmico en ambos ojos inmediatamente después de la inducción de la anestesia para evitar la desecación corneal. Luego coloca al ratón en reclinación ventral sobre la almohadilla térmica para evitar la hipotermia, minimizar el estrés fisiológico y apoyar las funciones cardiovasculares y respiratorias normales durante todo el procedimiento.
  4. Administrar buprenorfina suspensión inyectable de liberación prolongada (1,3 mg/mL) por vía subcutánea a 3,25 mg/kg usando una jeringuilla estéril con una aguja de 25 g e inyectar 0,05 mL por cada 20 g de peso corporal antes del procedimiento.
  5. Afeita la zona lumbar desde la mitad del flanco hasta la cintura pélvica, luego desinfecta la zona usando muestras alternas de alcohol isopropílico y povidona-yodo, repite tres veces y deja que el lugar se seque completamente al aire.

4. Inyección intratecal directa

  1. Tras la anestesia y la preparación del sitio quirúrgico, mueve al ratón a una zona limpia de inyección y colócalo en posición ventral reclinada sobre la almohadilla térmica.
  2. Coloca al ratón en una posición que arquee la columna para facilitar la palpación e inyección.
    1. Inserta una espátula curva bajo el abdomen en la parte torácica inferior a la parte lumbar superior para inducir una flexión lumbar leve y ensanchar los espacios intervertebrales lumbares entre la quinta y sexta (L5-L6, preferida) o la cuarta y quinta lámina (L4-L5).
    2. Avanza el bisel de la aguja entre las láminas para entrar en la cisterna lumbar y acceder al espacio subaracnoideo evitando el contacto directo con el hueso para mejorar la seguridad y precisión de la inyección.
  3. Estabiliza la cintura pélvica sujetando suavemente la cintura pélvica entre el pulgar y el índice de una mano y palpando la línea media dorsal con la otra para localizar el espacio intervertebral objetivo entre L4-L5 o L5-L6.
  4. Alinear una jeringuilla estéril de insulina de 0,3 mL equipada con una aguja de 29-G, 1/2 pulgada, perpendicular a la superficie dorsal de la piel o en un ángulo de 70-80°, con el bisel orientado cranealmente. Avanza la aguja hasta que encuentre una ligera resistencia al penetrar la duramadre, y luego continúa hacia el espacio intratecal.
  5. Inserta de forma constante hasta que la punta entre en el espacio intratecal, confirmado por un reflejo de movimiento de cola que indica entrada intratecal exitosa.
  6. Si se encuentra una resistencia significativa o no se observa reflejo de movimiento de cola, retirar la aguja, reidentificar los puntos anatómicos y ajustar la posición de la aguja antes de intentar de nuevo la inyección. Si el intento inicial se realizó en el espacio intervertebral L5-L6, realiza el intento posterior en el espacio intervertebral L4-L5.
  7. Inyectar 10 μL de la solución ASO lentamente (durante 10 s) para minimizar los cambios de presión y evitar el reflujo de LCR. La aguja puede mantenerse en su lugar durante 10 segundos adicionales después de la inyección.
  8. Retira cuidadosamente la aguja vertical y suavemente para evitar daños en los tejidos y reflujos.
  9. Vigila al ratón de forma continua durante el periodo de recuperación, observando la respiración, la función motora, la postura y cualquier signo de dolor o malestar.
  10. Asegúrate de que el ratón recupere la movilidad y el comportamiento normales antes de devolverlo a su jaula de origen.
  11. Documentar todos los detalles procedimentales relevantes, incluyendo el lugar de inyección, la dosis de ASO, el volumen de inyección y cualquier observación conductual o fisiológica durante y después del procedimiento, de acuerdo con los protocolos de IACUC.

5. Monitorización de ratones y apoyo a la recuperación tras la inyección

  1. Colocar a cada ratón en un compartimento individual o bien espaciado dentro de una cámara de recuperación precalentada mantenida a 37 °C.
  2. Mantén la temperatura de la cámara controlada durante la recuperación de la anestesia para evitar la hipotermia.
  3. Monitoriza continuamente la frecuencia y el patrón respiratorio, la postura y la capacidad de respuesta a estímulos táctiles.
  4. Observa al ratón hasta que recupere el reflejo de enderezarse y muestre un movimiento coordinado.
  5. Evita el hacinamiento para asegurar una visibilidad clara y evitar interferencias.

6. Determinar los criterios para volver a la jaula de origen

  1. Confirma que el ratón está estable con movimiento espontáneo coordinado.
  2. Asegúrate de no haber signos de malestar, incluyendo respiración dificultosa o irregular, vocalizaciones y falta de respuesta prolongada.
  3. Proporciona un soporte nutricional suave, como un suplemento de dieta en gel nutricionalmente completo, para ayudar a mantener la hidratación y la ingesta calórica con un esfuerzo mínimo.

7. Realizar observaciones posteriores a la recuperación de ratones

  1. Verifica comportamientos normales como exploración, acicalado y interacción social si los ratones están en un grupo de viviendas.
  2. Vigila continuamente la aparición de cualquier signo de recuperación anormal, como postura inusual, debilidad o parálisis, respiración irregular o disminución de la capacidad de respuesta, y reevalúa rápidamente si estos síntomas se presentan.
  3. Busca intervención veterinaria si la recuperación se retrasa o se ve comprometida.

8. Inyección intracerebroventricular en el ventrículo lateral mediante cirugía estereotáxica y cuidados postoperatorios

NOTA: Incluir un brazo comparativo que utilice inyección intracerebroventricular (ICV) para evaluar la distribución espacial y la eficacia relativa, introduciendo ASOs en los ventrículos laterales para la diseminación mediada por LCR y comparación con la administración intratecal. Realizar las inyecciones de ICV según protocolos bien establecidos y estandarizados para ratones37.

  1. Anestesiar al ratón con isoflurano a una concentración del 2-2,5 % en oxígeno para evitar la inmovilidad y colocar al ratón en reclinancia ventral sobre la almohadilla térmica, para luego administrar subcutáneamente una suspensión inyectable de liberación prolongada de buprenorfina (1,3 mg/mL de cloruro de buprenorfina) a 3,25 mg/kg utilizando una jeringuilla estéril de 1 mL con una aguja de 25 g a 0,05 mL por 20 g de peso corporal antes del procedimiento. Afeita el cuero cabelludo del ratón con una máquina de cortar la cabellera.
  2. Realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo anestesia. Mantén un campo aséptico estéril durante toda la cirugía de ICV. Utiliza solo instrumentos estériles y manéchalos con cuidado para evitar el contacto con superficies no estériles.
  3. Asegura el ratón en un marco estereotáxico con una consola digital en posición estándar boca abajo. Coloca los dientes delanteros en la barra dental del adaptador del ratón para inmovilizar la cabeza, luego asegura el adaptador con los tubos de inhalación y extracción que administran isoflurano. Inserta las barras de los auriculares en los auriculares y aprieta los tornillos para estabilizar firmemente la cabeza.
  4. Desinfecta la zona usando muestras alternas de alcohol isopropílico y povidona-yodo, repetidas tres veces, y realiza una incisión en la línea media con un bisturí estéril para exponer el cráneo. Utiliza una punta de algodón estéril para eliminar los tejidos blandos y asegúrate de que el bregma se vea claramente.
  5. Marca el bregma en el cráneo. Coloca la jeringuilla que contiene ASO con la aguja (26-G, 26s/2"/2, tipo punta) justo encima del bregma. Alinea la aguja con las coordenadas objetivo: AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm de la superficie del cráneo. Marca el cráneo en las coordenadas AP y ML.
  6. Crea un agujero de rebala en las coordenadas marcadas y luego utiliza un marco estereotáctico para bajar la aguja de la jeringuilla a una profundidad de -3 mm desde la superficie del cráneo. Inyectar la solución a una tasa de 10 μL/min hasta que se haya administrado un volumen total de 10 μL. Después de terminar la inyección, mantén la aguja en su sitio durante 4 minutos y luego retírala poco a poco para minimizar el reflujo.
  7. Sutura la incisión del cuero cabelludo, coloca al ratón en una cámara de recuperación precalentada a 37 °C hasta que esté completamente despierto y devuélvelo a la jaula de casa tras confirmar la estabilidad. Proporcionar un suplemento de dieta en gel nutricionalmente completo y monitorizar continuamente signos de recuperación anormal, como postura inusual, debilidad o parálisis, respiración irregular o disminución de la capacidad de respuesta; Reevalúa con urgencia si alguno de estos síntomas se presenta.

9. Evaluaciones electrofisiológicas de potenciales de acción musculares compuestos (CMAP)

  1. Asegurarse de que los experimentadores estén ciegos tanto al genotipo como al grupo de tratamiento de cada ratón para eliminar sesgos durante la recogida y análisis de datos.
  2. Anestesiar al ratón con isoflurano para mayor inmovilidad y comodidad, y mantener la temperatura corporal en 37 °C.
  3. Confirma la anestesia adecuada asegurando la pérdida del reflejo pedal.
  4. Utiliza electrodos monopolares desechables de 28 G tanto para estimulación como para grabación. Inserta el electrodo de grabación 1 mm en el músculo tibial anterior.
  5. Estimular el nervio ciático cerca de la muesca ciática usando pulsos monofásicos de onda cuadrada de 0,1 ms cada 2 segundos, comenzando en 1,0 mA y aumentando en incrementos de 0,5 mA hasta lograr una respuesta supramáxima (típicamente 1,5-3,5 mA).
  6. Una vez determinado el umbral supramáximo, registrar respuestas CMAP a 0,5 mA por encima de ese nivel. Mide la amplitud CMAP (pico a pico) a 0,8 ms post-estímulo para excluir la latencia y promedia las amplitudes de las patas izquierda y derecha para cada ratón.

10. Medición de los niveles séricos de pNFH

  1. Recoger 100 μL de sangre total mediante punción venosa facial utilizando tubos capilares de extracción de sangre que contienen activador de coágulos y gel de separación sérica en los momentos designados.
  2. Centrifugar muestras de sangre a 2000 g durante 10 minutos a 4 °C para aislar el suero.
  3. Cuantificar los niveles de cadena pesada de neurofilamentos fosforilados séricos (pNFH) utilizando reactivos de inmunoensayo validados para la medición de la pNFH en muestras biológicas en un analizador inmunológico microfluídico totalmente automatizado y basado en cartucho.

11. Aislamiento de ARN y realización de RT-qPCR

  1. Pulverizar los tejidos espinales cervical/torácicos del ratón usando una perla de acero de 6 mm en un molino oscilatorio oscilatorio de alta energía criogénico y programable para pulverización de muestras a 1.000-1.200 movimientos por minuto durante 30-40 segundos.
  2. Homogeneizar el tejido pulverizado (15 mg) usando perlas cerámicas de 2,8 mm en lisis y extracción de ARN a base de fenol-guanidinio de 700 μL y extracción de ARN mediante un homogeneizador mecánico programable de alta velocidad basado en perlas a 5,62 m/s durante dos ciclos de 30 segundos.
  3. Extrae ARN total usando el tratamiento con DNasa en columna, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  4. Sintetiza ADNc utilizando un sistema de reactivos de transcripción inversa de alta capacidad para la síntesis de ADNc.
  5. Para la detección de qPCR, diseña conjuntos personalizados de cebadores/sondas para detectar el gen de interés que apunta al exón 4 del gen SOD1 humano:
    cebador hacia adelante (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′),
    cebador inverso (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    sonda (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Usa GAPDH del ratón (ID del ensayo TaqMan: Mm99999915_g1) como gen de mantenimiento del hogar.
  7. Realizar qPCR en un instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de alto rendimiento utilizando 20 ng de ADNc por reacción, una mezcla maestra qPCR basada en sondas de ciclo rápido, cebadores específicos de genes y sondas de hidrólisis marcadas con fluorescencia para la detección de transcritos de mantenimiento doméstico (VIC/MGB) y blanco (FAM/MGB).

12. Análisis estadístico de los datos

  1. Presentar datos de medidas en la vida (CMAP), pNFH sérico y análisis de expresión génica como media ± desviación estándar (DS).
  2. Evalúa la significación estadística entre medias de grupo utilizando ANOVA unidireccional, seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, considerando p < 0,05 como estadísticamente significativo.
  3. Utilice el software de análisis estadístico adecuado para generar gráficos y realizar todos los análisis, de acuerdo con los realizados en el estudio.

Resultados

Para caracterizar rigurosamente la precisión y eficiencia de la administración intratecal (IT) en ratones adultos, primero realizamos experimentos fundamentales de validación utilizando el tinte azul de Evans (0,5%) como trazador visual del flujo de LCR y la permeación tisular. Los ratones adultos tipo salvaje tipo C57BL/6J (cepa #000664; peso 25-30g) fueron anestesiados con isoflurano (2-2,5%) en oxígeno para eliminar artefactos de movimiento, y la región lumbar se preparó en condiciones asépticas. Las inyecciones de ITI se realizaron mediante punción lumbar en el espacio subaracnoideo a dosis ascendentes individuales de 20 μL, 30 μL y 50 μL para evaluar dosis/volumen y la relación intensidad de la tinción. La colocación correcta de la aguja se confirmó observando un movimiento de cola o resistencia negativa durante la inyección.

En menos de 5 minutos tras la administración del contraste, los ratones fueron perfundidos transcárdicamente con suero salino tamponado con fosfato frío (PBS) para eliminar el contraste residual de la vasculatura. Después, las médulas espinales se extrajeron suavemente y se fotografiaron bajo iluminación estándar sobre un fondo neutro. La inspección visual reveló una distribución consistente y uniforme de azul dorsal-ventral en todos los ratones que recibieron tinte. Volúmenes de inyección más altos se correlacionaron con una saturación intensificada del colorante a lo largo del eje rostrocaudal, aunque incluso el ratón inyectado con el volumen de 20 μL también mostró una tinción robusta. En cambio, los ratones que no recibieron el tinte azul de Evans (grupo control inyectado con solución fisiológica estéril) no mostraron coloración visible ni tinción de fondo en el tejido de la médula espinal (Figura 1). Estos hallazgos demuestran que las inyecciones de IT en ratones permiten una entrega rápida y reproducible de solutos a lo largo de la médula espinal. Las limitaciones de estos experimentos incluyen la falta de evaluación cuantitativa de la distribución del contraste y la ausencia de análisis de distribución de colorantes en el volumen de inyección de 10 μL utilizado para la administración de ASO. Sin embargo, la cuantificación se realizó en mediciones posteriores de compromiso de objetivos a nivel de expresión génica en ratones humanos SOD1-G93A utilizando análisis de expresión génica específica de SOD1 humano. El volumen de inyección de 10 μL utilizado en experimentos posteriores para la administración de ASO fue seleccionado para garantizar una dosificación segura y bien tolerada en ratones y se espera que proporcione una exposición adecuada al SNC según estudiosprevios 38.

A partir de esta validación anatómica, evaluamos a continuación la relevancia funcional de la entrega de TI utilizando ASOs dirigidos a SOD1 mutante, una estrategia terapéutica validada en modelos SOD1-ALS. Los ratones transgénicos hemicigotos SOD1-G93A, que albergan el gen mutante humano SOD1 , presentan una degeneración predecible de la neurona motora y un deterioro neuromuscular, lo que los convierte en un modelo preclínico consolidado. A las 5 semanas de edad, antes del inicio sintomático, los ratones recibieron un único bolo de TI de un ASO específico para SOD1 a una concentración de 100 μg en 10 μL. Esta dosis fue seleccionada en base a estudios de optimización previos realizados con la administración de ICV en ratones, según informaron McCampbell et al. (2018)36. Para comparar la eficacia entre la administración de TI y la ICV, un grupo separado recibió inyecciones de ICV de la misma dosis de ASO utilizando la administración estereotáctica. Los controles recibieron ASO inactivo (control no apuntado) a través de la ruta de TI.

Cinco semanas después del tratamiento (a las 10 semanas de edad), los ratones se sometieron a pruebas de potencial de acción muscular compuesto (CMAP) bajo anestesia ligera de isoflurano. Los registros de CMAP de la musculatura de la extremidad posterior, provocados por protocolos estandarizados de estimulación del nervio ciático, revelaron una preservación significativa de la amplitud tanto en grupos tratados con TI como con ICV en comparación con controles inactivos tratados con ASO (p < 0,0001 mediante ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey). Es importante destacar que la preservación de amplitud no difirió significativamente entre los métodos de administración de TI y ICV (p > 0,05), lo que indica una protección neuromuscular comparable (Figura 2A).

Para evaluar biomarcadores sistémicos de integridad neuronal, se midieron los niveles séricos de cadena pesada de neurofilamentos fosforilados (pNFH) mediante un ensayo electroquimioluminiscencia altamente sensible. Las muestras de sangre obtenidas en el periodo de 5 semanas tras la inyección demostraron una reducción del >40% en la concentración de pNFH en ratones tratados con ASO en comparación con los controles tratados con vehículo (p < 0,0001), sin observar diferencias significativas entre las modalidades de TI y CI (Figura 2B). La respuesta uniforme de biomarcadores moleculares corrobora los datos electrofisiológicos, sugiriendo que la administración de TI mitiga eficazmente los procesos neurodegenerativos en este modelo de ELA.

Para evaluar el compromiso del objetivo de SOD1-ASO a nivel molecular, realizamos la PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR) en tejidos diseccionados de la médula espinal cervical y torácica. El ARN total se extrajo mediante un protocolo basado en columnas, asegurando alta pureza (A260/A280>1,8), seguido de la síntesis de ADNc con cebado aleatorio de hexámeros. La amplificación cuantitativa por PCR dirigida a transcritos humanos de SOD1, normalizada a GAPDH, reveló una caída media del 60% tras la entrega de TI y del 35% tras la entrega de ICV, ambos significativos en relación con controles ASO inactivos (p < 0,0001 en ambos). La comparación directa entre rutas de parto mostró un knockdown significativamente mayor con la entrega de TI (p < 0,0001), lo que indica un compromiso más efectivo del objetivo en la médula espinal mediante acceso directo a la columna vertebral (Figura 3). Se necesitan más estudios para evaluar el compromiso de objetivos en otras regiones del SNC.

En conjunto, estos datos completos ofrecen una validación convincente de las inyecciones de TI como una técnica precisa, reproducible y mínimamente invasiva para administrar ASOs al sistema nervioso central (SNC) en modelos murinos. La administración de TI demostró una eficacia terapéutica comparable a la administración de VCI en un amplio espectro de medidas de resultado, incluyendo la preservación sostenida de la función neurológica (CMAP), la normalización de biomarcadores relevantes para la enfermedad (pNFH) y la reducción molecular robusta de transcritos humanos de SOD1 en regiones específicas del SNC. Estos hallazgos subrayan la versatilidad de la administración de TI como vía clínicamente traducible para terapias ASO dirigidas al SNC, ofreciendo una eficacia equivalente a la ICV manteniendo la simplicidad del procedimiento y una menor invasividad. Así, la administración de TI y la ICV son enfoques igualmente viables para intervenciones dirigidas al SNC, ofreciendo flexibilidad en entornos preclínicos dependiendo de la accesibilidad anatómica, la viabilidad procedimental y el contexto terapéutico. Esto posiciona la entrega de TI como una plataforma prometedora de traducción para futuras terapias dirigidas al SNC. Para apoyar los esfuerzos traslacionales, sugerimos realizar más estudios preclínicos para evaluar la distribución farmacocinética en el líquido cefalorraquídeo, las diversas regiones del SNC y la captación de células diana utilizando técnicas como la hibridación in situ con fluorescencia o inmunofluorescencia.

Figura 1
Figura 1: Visualización de la distribución del tinte azul de Evans tras la inyección intratecal en ratones adultos. El tinte azul de Evans (0,5%) se administró mediante inyección intratecal directa (IT) en ratones adultos para evaluar cualitativamente su distribución medular. Se administraron tres volúmenes diferentes de colorante de 20 μL, 30 μL y 50 μL en grupos experimentales separados (n = 1 ratón por condición de volumen). Tras la inyección, se extrajeron y enjuagaron las médulas espinales para evaluar la penetración del contraste según la intensidad de la tinción a lo largo del tejido. Las imágenes del tejido de la médula espinal muestran la extensión de dispersión del contraste asociada a cada volumen de inyección, demostrando un aumento dependiente del volumen en la cobertura y la intensidad de la tinción a lo largo de toda la médula espinal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: La terapia con oligonucleótidos antisentido dirigida a SOD1 restaura la función motora y reduce los niveles patológicos de neurofilamentos en ratones. Los ratones transgénicos adultos SOD1-G93A recibieron una dosis única de oligonucleótido antisentido activo dirigido a SOD1 (SOD1-ASO) mediante inyección intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV) a las 5 semanas de edad, o un ASO de control inactivo mediante inyección IT. El impacto terapéutico se evaluó a las 10 semanas de edad, correspondientes a las 5 semanas posteriores al tratamiento. (A) Se obtuvieron registros del potencial de acción muscular compuesto (CMAP) para evaluar la función neuromuscular en animales tratados. Los grupos tratados con SOD1-ASO (n = 5 - 6 por grupo) mostraron una reversión en el descenso del CMAP respecto al grupo control, lo que indica recuperación funcional. (B) Se cuantificaron niveles periféricos de cadena pesada de neurofilamentos fosforilados (pNFH), un biomarcador de neurodegeneración, a partir del suero recogido en la semana 10 (n = 5 - 8 por grupo). El tratamiento con SOD1-ASO condujo a una reducción significativa de los niveles circulantes de pNFH en comparación con el control, lo que sugiere una atenuación del daño neuronal asociado a la enfermedad. Todos los datos se presentan como media ± DS. La significación estadística se determinó mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, con valores p ≤ 0,0001 que indican diferencias robustas entre los grupos de tratamiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: La administración de SOD1-ASO suprime significativamente la expresión de ARNm de SOD1 humano en la médula espinal transgénica SOD1-G93A del ratón. Para evaluar la eficiencia de la dirección del oligonucleótido antisentido dirigido a SOD1 (SOD1-ASO) administrado mediante inyección intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), se analizó la sección cervical/torácica del tejido medular de ratones transgénicos SOD1-G93A eutanasiados a las 10 semanas de edad (5 semanas tras la administración) para la expresión humana de ARNm SOD1 utilizando la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR). Los niveles de transcritos SOD1 humanos se cuantificaron y normalizaron en relación con la expresión en el grupo inactivo tratado con ASO. La figura muestra el cambio de pliegue en el ARNm de SOD1 humano (normalizado a GAPDH) para cada grupo de tratamiento (n = 5-7 ratones por grupo), destacando una regulación a la baja sustancial en respuesta a la administración de SOD1-ASO. Los datos se presentan como media ± DS. Las diferencias estadísticas entre grupos se determinaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA), seguido por la prueba de comparación múltiple de Tukey, con valores p ≤ 0,0001 indicando diferencias robustas entre los grupos de tratamiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

ComponenteFWCantidad de suma (por L o kg)Unidades
Fosfato de sodio monobásico dihidrato0.034g
Dibásico fosfato sódico anhidro1420.111g
Cloruro de sodio58.448.766g
Cloruro de potasio74.560.224g
Dihidrato de cloruro de calcio147.020.206g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato0.163g
Agua (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tabla 1: composición de aCSF.

Figura suplementaria 1: Posición del ratón para inyección intratecal lumbar. Una espátula curva o scoopula colocada bajo el abdomen flexiona la columna, ensanchando el espacio intervertebral. La inyección apunta al nivel L4-L5 o L5-L6, con la alineación adecuada a lo largo del eje medial de la columna vertebral como se muestra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: secuencia y química ASO. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La técnica de inyección intratecal directa (IT) presentada aquí representa un método mínimamente invasivo pero altamente eficaz para administrar agentes terapéuticos al sistema nervioso central (SNC), especialmente en modelos de roedores pequeños como los ratones. Este procedimiento de punción ciega es técnicamente desafiante, pero ha demostrado ser tanto reproducible como clínicamente relevante cuando lo realiza un inyector entrenado. Este método utiliza una anatomía precisa y una técnica eficiente para proporcionar un acceso rápido al SNC sin necesidad de cateterización, una simplificación importante con beneficios sustanciales para la expansión de los estudios preclínicos; Sin embargo, su relevancia traslacional se beneficiará de una evaluación cuantitativa adicional y de una validación metodológicaestandarizada 5,8,10.

Una inyección exitosa de TI depende de varios pasos clave. La preparación meticulosa del animal es esencial: la anestesia se induce primero mediante una cámara y se mantiene con un cono nasal, seguida de la afeitada de la zona lumbar y la administración de analgésicos para garantizar la comodidad animal. La correcta posición del ratón se logra colocando una espátula curva bajo el abdomen, flexionando la columna para ensanchar el espacio intervertebral (Figura suplementaria 1). El objetivo de la inyección intratecal descrita aquí es posicionar el bisel de la aguja dentro de la cisterna lumbar avanzándolo entre las láminas al nivel vertebral adecuado. Es fundamental para acceder al espacio subaracnoideo 5,10 el segmento preciso del espacio intervertebral entre las láminas L4 y L5 o, preferiblemente, entre las láminas L5 y L6. El espacio subaracnoideo, también denominado espacio intratecal, se encuentra entre el aracnoide y la pia mater39. Debido a que la médula espinal es más corta que el canal vertebral, los segmentos caudales de la médula espinal se encuentran de forma más rostral en relación con sus niveles vertebrales correspondientes. Para evitar ambigüedades, los lugares de inyección se designan por el espacio intervertebral en lugar del nivel de la médula espinal. Cabe destacar que existe una variabilidad considerable en la segmentación vertebral lumbar en ratones, tanto dentro como a través de cepas40. La inyección debe realizarse a lo largo de la línea media de la columna para evitar desviaciones laterales, que pueden provocar paresia de la extremidad posterior o, en casos graves, parálisis debido a una lesión medular. Cuando se realiza en la ubicación anatómica correcta, el riesgo de lesión directa de la médula espinal es mínimo. Sin embargo, persiste un pequeño riesgo de irritación o daño en la raíz nerviosa, lo que subraya la importancia de una formación adecuada del operador y de una competencia procedimental para minimizar los resultados adversos. El reflejo de movimiento de cola sirve como un indicador útil de la colocación exitosa de la aguja, permitiendo al inyector medir la profundidad y evitar penetraciones superficiales o excesivamente profundas. Esta técnica requiere práctica para dominarla, ya que requiere un control constante de la profundidad, el ángulo y el volumen de inyección para evitar el reflujo y la fuga hacia los tejidos circundantes. Aunque recomendamos mantener el volumen de inyección ≤10 μL, hemos evaluado hasta 20 μL sin efectos adversos. Estudios previos han identificado un volumen de inyección intratecal de 10 μL como óptimo para la administración delfármaco 38. Aunque esto representa entre el 25 y el 30% del volumen total de LCR en ratones41,42, el volumen máximo tolerable de inyección intratecal en ratones adultos se ha reportado en 30 μL10. Volúmenes de inyección que superen los límites recomendados pueden alterar la dinámica del líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que puede provocar una alteración de la presión del LCR y un mayor riesgo de efectos adversos. El volumen total de LCR en ratones se estima entre 35 y 40 μL y gira entre 12 y 13 veces aldía 41,42, lo que corresponde a una renovación completa aproximadamente cada 1,8 h42,43. Teniendo en cuenta la rápida renovación del LCR y las observaciones empíricas, así como estudios previos que demuestran el uso seguro de volúmenes de inyección intratecal de hasta 20-30 μL sin complicaciones, no se espera que un volumen de inyección de 10 μL produzca efectosadversos 10,44.

La escalabilidad es una ventaja significativa de esta técnica. Una vez dominados, los inyectores entrenados pueden tratar entre 10 y 12 animales por hora, facilitando estudios preclínicos de mayor envergadura sin las cargas logísticas de la implantación de catéteres o enfoques quirúrgicos más invasivos. El procedimiento evita instrumentación compleja, reduce el estrés animal y acorta los tiempos de recuperación en comparación con el cateterismo crónico, lo que lo hace adecuado para estudios longitudinales que requieren dosificaciones repetidas. Para simular los regímenes clínicos de dosificación, validamos las administraciones seriadas de TI en ratones, administrando hasta cuatro dosis con una separación de ocho semanas. Estas inyecciones fueron bien toleradas, sin signos de malestar, cambios de comportamiento ni signos de enfermedad, lo cual coincide con estudios previos que no reportaron cambios significativos en la dinámica del LCR ni en la arquitectura de la médula espinal tras múltiples tratamientos conTI 34,45. Por tanto, nuestros estudios confirman que la dosificación repetida de ITI es factible con intervalos adecuados, alineándose con los paradigmas de tratamiento humano donde es necesario un compromiso sostenido del objetivo para el beneficio terapéutico. En nuestra experiencia, estas inyecciones repetidas de ITI se realizaron con éxito en un amplio rango de edad de 5 a 29 semanas. Aunque el aumento de la edad y la masa corporal puede alterar ligeramente la accesibilidad de la médula espinal debido a un mayor tejido subcutáneo, una administración exitosa sigue siendo posible con un operador experto que domine la técnica y conozca la sensación de colocar la aguja. Sin embargo, observamos que varios factores más allá del sitio de inyección y el volumen de bolo, específicamente la velocidad de inyección y las propiedades físicas de la solución inyectada, como la densidad relativa al LCR, pueden influir sustancialmente en la distribución de solutos dentro del SNC. Aunque estos parámetros no fueron medidos ni manipulados directamente en el presente estudio, trabajos recientes de Linninger et al. (2023) demuestran mediante un modelo farmacocinético mecanicista que tales factores afectan significativamente la biodistribución y el objetivo tisular intratecal de los oligonucleótidos antisentido (ASO)46. Por ello, reconocemos esto como una limitación de nuestro estudio y destacamos la velocidad de inyección y las propiedades de la solución como variables importantes para futuras investigaciones que optimizen la entrega del SNC y la relevancia traslacional. En conjunto, estos resultados ponen de manifiabilidad y viabilidad de la dosificación repetida de IT en paradigmas preclínicos de dosis múltiples, apoyando su uso para la implicación sostenida de objetivos y la modelización traslacional de regímenes terapéuticos humanos.

El enfoque de TI también ofrece flexibilidad en las pruebas terapéuticas. Incluye una amplia gama de modalidades, incluyendo ASOs, moléculas pequeñas, péptidos y vectores virales, permitiendo la evaluación directa de intervenciones dirigidas al SNC. La capacidad de administrar volúmenes precisos y controlados de terapias en la cisterna lumbar garantiza una exposición eficaz de la médula espinal y una mayor exposición al SNC, limitando el desbordamiento sistémico. El reflejo tail-flick y otras señales procedimentales permiten la verificación en tiempo real del éxito de la entrega intratecal, mejorando aún más la reproducibilidad y reduciendo las tasas de fallo experimental 5,6,8,47.

Estudios previos en ratones SOD1-G93A mostraron que la patología de la enfermedad afecta de forma destacada a la médula espinal, especialmente a la región lumbar, más que en lacorteza 29,48. Por lo tanto, esta técnica es especialmente relevante en el contexto de SOD1-ELA, una forma genética de ELA causada por mutaciones en el gen superóxido dismutasa 1 (SOD1). Estas mutaciones producen agregados de proteínas SOD1 mal plegados que conducen a una ganancia tóxica de función dentro de las neuronas motoras, provocando un declive neuromuscularprogresivo 49,50. En este estudio, empleamos ASOs dirigidos a SOD1 para demostrar el compromiso exitoso con ARNm objetivo y la recuperación funcional. El análisis RT-qPCR reveló una supresión significativa de los transcritos SOD1 humanos en la médula espinal tras la administración de TI, mientras que los registros CMAP indicaron una reversión de la disfunción de la neurona motora. Además, el análisis sérico mostró una disminución en los niveles de cadena pesada de neurofilamentos fosforilados (pNFH), un biomarcador de la neurodegeneración, reforzando la eficacia de la estrategia terapéutica.

La relevancia clínica de este modelo queda subrayada por la reciente aprobación por parte de la FDA de tofersen (QALSODY®), un ASO diseñado para dirigir el ARNm SOD1 para el tratamiento de SOD1-ALS35. Tofersen se administra intratecalmente en personas que viven con SOD1-ELA y ha mostrado una clara actividad farmacodinámica, incluyendo reducciones en los niveles totales de proteína SOD1 del LCR (marcador indirecto de la activación del objetivo) y en el NfL plasmático (marcador de lesión axonal y neurodegeneración). En análisis integrados del estudio de fase 3 VALOR y su OLE, el inicio más temprano del tratamiento con tofersen se asoció con reducciones en el descenso de las medidas de función clínica, fuerza y calidad de vida, así como una reducción en el riesgo de eventos equivalentes a lamuerte 35. Estos datos validan la vía intratecal como una vía poderosa para la terapia ASO dirigida al SNC y aportan un fuerte peso traslacional a estudios preclínicos que emplean estrategias de administración similares.

Además de su utilidad en la ELA, la vía IT ha demostrado éxito en la atrofia muscular espinal (SMA)14,51,52, donde el ASO Nusinersen (Spinraza®) administrado por TI fue la primera terapiaaprobada 14,51,52. Las inyecciones de IT rodean la barrera hematoencefálica y permiten una biodistribución generalizada delSNC 53, que es fundamental para enfermedades caracterizadas por patología neuronal difusa. Aunque la dosificación repetida plantea desafíos logísticos y de tolerabilidad, los avances en las técnicas de formulación y administración siguen haciendo que la administración de TI sea más viable para tratamientos a largo plazo.

La administración de TI ofrece una mayor relevancia traslacional para la práctica clínica humana que las inyecciones de ICV. Las inyecciones de VI e ITA en ratones adultos difieren principalmente en su ubicación objetivo dentro del SNC y en la distribución y efectos resultantes de la sustancia administrada. Las inyecciones de VI administran sustancias directamente en el líquido cefalorraquídeo (LCR) dentro de los ventrículos laterales del cerebro, dirigiéndose principalmente a los sitios supraespinales. En cambio, las inyecciones de IT administran sustancias en el LCR dentro del espacio subaracnoideo espinal, dirigiéndose principalmente a la médula espinal. Aunque ambos métodos evitan la barrera hematoencefálica y permiten la administración directa del sistema nervioso central, la administración de TI puede llevar a una mayor duración de la acción54 para algunos compuestos y normalmente resulta en una transducción más fuerte en la médula espinal, mientras que la VCI puede alcanzar altas concentraciones locales en regiones cerebrales adyacentes al ventrículolateral 54. Sin embargo, es importante señalar que los compuestos administrados en el LCR espinal pueden llegar al cerebro, aunque la velocidad de transporte es muylenta. Estas diferencias también se reflejan en los riesgos procesales. Las inyecciones de ICV conllevan un mayor potencial de contaminación si la esterilidad se ve comprometida, mientras que las inyecciones de TI, aunque no están exentas de riesgos, presentan menos vulnerabilidades relacionadas con el dispositivo. Tras el procedimiento, las inyecciones de ITO pueden inducir molestias transitorias o reacciones relacionadas con las extremidades posteriores, mientras que las inyecciones de VI se asocian a molestias menos inmediatas, aunque la irritación craneal local sigue siendo posible.

Las aplicaciones futuras de esta técnica van más allá de los estudios preclínicos actuales. La entrega de TI puede aprovecharse para evaluar terapias de próxima generación dirigidas al SNC, incluyendo herramientas de edición genética (por ejemplo, sistemas CRISPR/Cas), modalidades de interferencia de ARN y terapias génicas basadas en vectores virales. El enfoque es adaptable para terapias combinadas que apuntan a múltiples vías del SNC, permitiendo la evaluación en tiempo real de las interaccionesfarmacodinámicas 55,56. Además, la administración de TI puede integrarse con modalidades de imagen para rastrear la distribución y el compromiso de objetivos in vivo, acelerando las canalizaciones traslacionales. La técnica también proporciona una plataforma para estudiar estrategias de medicina de precisión en modelos murinos definidos genéticamente de enfermedades neurológicas, facilitando el descubrimiento de biomarcadores, evaluaciones funcionales longitudinales y evaluaciones de seguridad antes de la traducción clínica.

En conclusión, la técnica de inyección directa de IT, utilizando anestesia con isoflurano y isofluano, representa un método mínimamente invasivo, rápido y clínicamente traducible para administrar terapias en el SNC murino. Su exitosa aplicación en modelos SOD1-ALS y su compatibilidad con la dosificación serial proporcionan una base sólida para un despliegue más amplio en la investigación en neurociencia traslacional. A medida que el campo avanza con un creciente énfasis en la modulación génica del SNC, terapias dirigidas al ARN y medicina de precisión, la vía de la TI seguirá siendo una estrategia clave de administración de fármacos, uniendo modelos preclínicos con el éxito clínico.

Divulgaciones

SM y S-C L son empleados actuales de Biogen, Inc., mientras que TC, DF, YL, JD y MZ son antiguos empleados de la empresa. Los oligonucleótidos antisentido discutidos en este artículo fueron proporcionados a los autores por Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) es un producto desarrollado conjuntamente por Biogen e Ionis Pharmaceuticals.

Agradecimientos

Queremos agradecer a Ionis Pharmaceuticals por suministrar los ASOs descritos en el artículo. Estamos agradecidos a Ryan Gamble, Steve Garafalo, Adria Martig, Isabel Isaza, Taras Tuczkewycz y David Koske de Biogen por sus contribuciones expertas, que enriquecieron significativamente el manuscrito gracias a sus revisiones sustantivas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringuilla de insulina de 0,3 mL 29 G, 1/2 pulgada para inyección de ITOSmiths Medical4429-3
Muela de taladro estéril de 0,5 mm de diámetroHerramientas Científicas Finas (FST), o equivalente1900705
Sutura monofilamento 5-0 ProleneEthicon 8870H 
Hisopos de alcoholDynarex1203
Hisopos de alcoholDynarex1203
Analgésico - Buprenorfina de liberación prolongadaReceta requerida
Cortador para animalesWahl08787-450A
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Applied BiosystemsFisher Scientific43-688-14
Homogeneizador de Ruptor de Cuenta 24Omni International, Inc.19-070
Extracción de sangre y tubos de separación séricaBeckton Dickinson (BD)365967
Dihidrato de cloruro de calcioJT Baker1335
Bomba digital de jeringuillaAparato de Harvard70-4507
Sistema Automatizado de Inmunoensayo EllaR& Sistemas D600-100
Pomada para los ojos - PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Germinator 500 Esterilizador en secoBraintree Scientific, o equivalenteGER 5287-120V
Jeringuilla Hamilton con aguja (26s/2"/2 (tipo puntiagudo)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                              26 puntos: 26 G;                                                                                                             2" de longitud;                                                                                                                             2: estilo de puntos
Mezcla homogeneizadora de tejidos duros 2,8 mm cerámica (tubos reforzados de 2 mL) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Proveedor: Revvity Health Sciences Inc
Almohadilla eléctricaK& H Fabricación1060
Plataforma ICVStoelting502063
Cámara de isoflurano con sistema de escavangingVetEquip901820
Cloruro de magnesio heahidratadoEMD Chemicals1.05832
Tijeras MetzenbaumHerramientas Científicas Finas (FST), o equivalente14016-14
ID del ensayo Mouse GAPDH TaqMan Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Electrodos de aguja para CMAP, 28 gNatus Medical (marca Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel: Nutrición completaBio ServNGB-2
Portaagujas Olsen-HegarHerramientas Científicas Finas (FST), o equivalente12502-12
Poloxamer 188Mutchler
Cloruro de potasioJT Baker3045
Preamplificador (para CMAP)Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)SYS-DAM50
Kit pNFH ProteinSimpleR& Sistemas DSPCKB-PS-000519
Palillos de prueba de probido-yoduroDynarex1201
QIAzol Reactivo de lisis Qiagen79306
Sistema QuantStudio 12K FlexBiosistemas Aplicados4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Electronic DesignNúmero de serie 061144CMAP Software 
Cámara de recuperación de animales pequeñosUnidades portátiles de cuidados intensivos animales Thermocare Modelo FW-1FW-1 
Marco estereotáxico de animales pequeños con consola de pantalla digitalKOPFModelo 940 
Ratones SOD1 G93AEl Laboratorio JacksonAcción # 004435
Cloruro de sodioEMD Chemicals1.16224
Dibásico fosfato sódico anhidroSigma Aldrich55136
Fosfato de sodio monobásico dihidratoSigma Aldrich3819
Bisturí desechable estérilMed Vet International, o equivalenteMIL4410
Drapeado estérilDynarex4410
Almohadillas de gasa estérilesDynarex, o equivalenteDRX-3354
Suero fisiológico estérilThermoFisher Scientific14190094
Guantes quirúrgicos estérilesAnsell, o equivalente20277290
Aislador de estímulo (para CMAP)Instrumentos de Precisión Mundial (WPI)SYS-A365D
Stoelting Micro Drill & nbsp;Stoelting58610
Pinzas curvas quirúrgicas (Pinzas Graefe - Titanio)Herramientas Científicas Finas (FST), o equivalente11652-10
Pinzas quirúrgicas de estrecho (Pinzas Graefe - Titanio)Herramientas Científicas Finas (FST), o equivalente11650-10
Cinta quirúrgicaDynarex, o equivalente3572
Jeringuilla para inyección subcutánea de analgésicoBD309582
TaqMan Mezcla Master Avanzada RápidaThermoFisher Scientific4444556
Agua (Milli-Q)
BásculaMettler Toledo                                        Modelo XSR2002S23-112795
Ratones tipo salvaje C57BL/6JEl Laboratorio JacksonAcción # 000664

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