Modulación dependiente del ligando colinérgico del acoplamiento fosforilado oxidativo en células neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

Summary

Presentamos un protocolo para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, permitiendo la administración dirigida de sustratos e inhibidores para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en células cultivadas, superando las barreras de transporte de la membrana plasmática que normalmente dificultan dichos análisis. Utilizando esta técnica, demostramos cómo la función de OXPHOS es modulada por agonistas y antagonistas muscarínicos.

Abstract

El objetivo de este estudio fue evaluar la función de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) en células cultivadas utilizando combinaciones definidas de sustrato–inhibidor, manteniendo al mismo tiempo la estructura celular y el contexto citosólico perdidos en preparaciones mitocondriales aisladas. Debido a que las células intactas son poco permeables a varios intermedios del ciclo de Krebs, la evaluación directa de la respiración soportada por sustrato a través de puntos de entrada específicos de la cadena de transporte de electrones (ETC) es limitada. Para superar esto, aplicamos permeabilización selectiva de membrana plasmática mediada por la digitonina y realizamos ensayos de acoplamiento y flujo electrónico basados en analizadores de flujo de flujo extracelular en células neuroblastoma BE(2)-C. Para determinar la dependencia del tipo celular, la digitonina se tituló empíricamente en células HEK293 y en neuronas ganglionares primarios de la raíz dorsal de rata (DRG) utilizando succinato + rotenona para aislar la respiración impulsada por el complejo II–IV.

La respiración apoyada por succinato con inhibición del Complejo I mostró un aumento en el consumo de oxígeno (O₂) impulsado por el Complejo II–IV en células permeabilizadas en comparación con las no permeabilizadas, lo que es compatible con un mejor acceso de un sustrato impermeable a la membrana a las mitocondrias. En cambio, la respiración soportada por sustratos que entran por vías de transporte endógenas (por ejemplo, piruvato/malato) mostró diferencias menores entre condiciones. Utilizando esta plataforma para analizar ligandos muscarínicos, observamos diferencias asociadas a agonistas frente a antagonistas en el consumo de O₂ en el ensayo de acoplamiento, mientras que el ensayo de flujo electrónico reveló efectos mínimos asociados a ligandos bajo las condiciones probadas. Estos hallazgos indican que los efectos detectables de los ligandos fueron más prominentes a nivel de estados respiratorios definidos por acoplamiento que la capacidad máxima de transferencia electrónica. En general, la permeabilización selectiva amplía la accesibilidad del sustrato en ensayos bioenergéticos de células cultivadas y permite el análisis de la modulación farmacológica de la respiración mitocondrial.

Introduction

El mal funcionamiento o reprogramación del metabolismo energético mitocondrial es central en un amplio espectro de trastornos, incluyendo neurodegeneración, cáncer, enfermedades inflamatorias, condiciones cardiometabólicas y diversos trastornos genéticos. Para comprender mejor el papel del metabolismo mitocondrial en la patogénesis de enfermedades, se han desarrollado varias estrategias analíticas. Estas incluyen mediciones de la tasa de consumo de_O2 (OCR), tasa de acidificación extracelular (ECAR), cuantificación de ATP, utilización de sustratos, perfilado o análisis de metabolitos del ciclo de Krebs, y trazado^{isotópico 1}. Entre estas técnicas, la OCR es un indicador clave de la respiración mitocondrial y puede evaluarse utilizando instrumentos como la Respirometría de Alta Resolución (HRR; por ejemplo, Oroboros_{O 2}k)², el electrodo tipo Clark o el analizador de flujo extracelular

El sistema Oroboros_O2k mide la concentración de_O2 en una cámara sellada utilizando el sensor polarográfico_O2 tipo Clark (POS^)3,4,5 y es adecuado para muestras como mitocondrias aisladas, células permeabilizadas y homogeneados tisulares. Consiste en un cátodo de oro/platino, un ánodo de plata y un yacimiento de electrolitos de KCl separados de la muestra por una membrana de etileno propileno fluorado (FEP) permeable y químicamente resistente a 25 μm_O2. El electrodo^{tipo Clark 3} también opera en una cámara cerrada, detectando cambios en la concentración de_O2 mediante un electrodo sensible al_O2, y se utiliza comúnmente para mitocondrias aisladas o suspensiones celulares. En cambio, el analizador de flujo extracelular cuantifica el OCR y la ECAR en células vivas adherentes o mitocondrias aisladas mediante sensores fluorescentes incrustados en microplacas, permitiendo un perfil metabólico de alto rendimiento. Una ventaja práctica de la plataforma de analizador de flujo extracelular es la evaluación automatizada y multiparamétrica en múltiples condiciones en paralelo, mientras que los sistemas de cámara cerrada (por ejemplo, HRR o electrodos tipo Clark) suelen proporcionar un menor rendimiento y requieren un manejo más manual.

El analizador de flujo extracelular es especialmente útil para evaluar la función mitocondrial en células adherentes intactas o en células en suspensión que se asientan en la base de la microplaca. En ensayos que utilizan células adherentes intactas, el metabolismo energético mitocondrial puede perfilarse utilizando sustratos como glucosa o^{piruvato 6}. Alternativamente, los ensayos que utilizan pequeñas cantidades de fracciones mitocondriales enriquecidas permiten la medición secuencial de la respiración basal, la respiración estimulada por ADP (Estado 3), la respiración en reposo (Estado 4) y la respiración estimulada por desacoplador utilizando combinaciones de sustratos e inhibidores⁷. Sin embargo, en sistemas celulares intactos, los metabolitos del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) que no son permeables a las células no pueden utilizarse para evaluar su metabolismo directamente. Mientras que las mitocondrias aisladas permiten el uso de estos metabolitos debido a la ausencia de barreras plasmáticas en la membrana. El análisis del enfoque de bioenergética mitocondrial enriquecida aislada tiene limitaciones: la estructura mitocondrial puede alterarse durante el aislamiento, y los factores citosólicos que influyen en el metabolismo mitocondrial y el transporte de metabolitos están reducidos o ausentes. Por ello, los enfoques de permeabilización selectiva se utilizan a menudo como un compromiso que puede conservar aspectos de la arquitectura celular y permitir un acceso controlado a las mitocondrias. Para superar las limitaciones de usar células intactas o mitocondrias aisladas para ensayos metabólicos, este protocolo describe un método para permeabilizar células adherentes de neuroblastoma (BE(2)-C) utilizando digitonina. Este enfoque facilita la importación de metabolitos que de otro modo no serían persemágicos celulares a través de la membrana plasmática, manteniendo al mismo tiempo respuestas mitocondriales funcionales a sustratos e inhibidores definidos.

La selectividad de la digitonina se basa en las diferencias en la composición lipídica de la membrana: la membrana plasmática es rica en colesterol, mientras que las membranas mitocondriales—especialmente la interna mitocondrial—contienen muy poco colesterol⁸. En concentraciones bajas, la digitonina (o saponina) permeabiliza selectiva y completamente la membrana plasmática debido a su alto contenido de colesterol, mientras que las membranas mitocondriales solo se ven afectadas en concentraciones^{más altas 9,10}. La digitonina se une al colesterol y forma poros en la membrana plasmática, permitiendo que pequeñas moléculas como los intermediarios del ciclo TCA entren en el citosol sin alterar la estructura o función mitocondrial cuando se optimizan correctamente. Este enfoque es más adecuado para células cultivadas que pueden ser reproducidas como monocapas adherentes en una microplaca analizadora de flujo extracelular y requiere una titulación empírica de la concentración de digitonina para cada tipo celular y densidad de siembra. Los indicadores operativos de la integridad mitocondrial preservada incluyen respuestas robustas y sensibles al TOC (por ejemplo, disminuciones esperadas con rotenona/antimicina A y respiración intravenosa compleja intacta con ascorbato/TMPD), junto con la ausencia de colapso del POC que señalaría sobrepermeabilización. Por lo tanto, la optimización de la digitonina debe realizarse antes de las comparaciones experimentales y repetirse siempre que cambien las condiciones de cultivo o la densidad celular. Además, la concentración óptima de digitonina varía según el tipo celular y debe determinarse empíricamente para establecer una ventana de permeabilización que permita la entrada de sustratos impermeados (por ejemplo, succinatos) manteniendo al mismo tiempo la función mitocondrial sensible a los inhibidores. En este estudio, ilustramos este principio optimizando la digitonina no solo en células BE(2)-C, sino también en células HEK293 y en neuronas ganglionares dorsales primarias de rata (DRG).

Este protocolo se demostró utilizando células de neuroblastoma BE(2)-C, que originalmente fueron aisladas del cerebro de un paciente masculino con neuroblastoma. Las células BE(2)-C expresan varios receptores muscarínicos, en particular el receptor colinérgico muscarínico tipo 1 (CHRM1). En nuestros estudios previos, demostramos que CHRM1 está asociada con mitocondrias tanto en los cuerpos celulares como en neuritas de neuronas ganglionares dorsales de ratas cultivadas, así como en células^{HEK293 transfectadas con CHRM1 11}. Además, la deleción genética de Chrm1 en ratones altera múltiples aspectos de la estructura y función mitocondrial^12,13. Por ello, planteamos la hipótesis de que las células BE(2)-C pueden utilizarse para investigar los efectos moduladores de los ligandos muscarínicos en la función de OXPHOS. En esta demostración, examinamos los efectos de los agentes muscarínicos —incluyendo el agonista acetilcolina, el antagonista sesgado pirenzepina¹⁴ y el antagonista atropina— sobre la respiración mitocondrial en presencia de succinato o piruvanato/malato como sustratos y comparamos su impacto.

Protocol

1. Deshielo y chapado inicial

NOTA: El medio base para las células BE(2)-C es una mezcla 1:1 de medio esencial mínimo de Eagle formulado por ATCC y medio F12, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%.

1. Descongelar células BE(2)-C de un criovial en un baño maria a 37 °C. Una vez descongeladas, centrifuga las células 200 × g durante 5 minutos para eliminar el crioprotector.
2. Resuspende el pellet celular en un medio de crecimiento completo y coloca las células en un plato de cultivo celular de 10 cm. Incubar el cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂ en el aire hasta que las células alcancen la subconfluencia.

2. Subcultura

1. Subcultiva las células durante 2–3 pasajes para asegurar que alcanzan una fase de crecimiento exponencial estable.

3. Tripsinización y preparación de suspensión de célula única

1. Cuando el cultivo alcanza una confluencia del 60–80%, tripsiniza las células. Pasa la suspensión de la celda varias veces a través de pipetas de transferencia de punta fina con puntas pulidas para disociar grumos y lograr una suspensión de célula única.
2. Añade un medio fresco que contenga FBS para neutralizar la tripsina. Centrifuga las celdas a 200 × g durante 5 minutos para pelletarlas.

4. Protocolo de siembra celular para microplacas de cultivo celular de 24 pozos utilizadas en analizadores de flujo extracelulares

1. Resuspende el pellet en medio completo a una concentración final de 10.000 celdas por 100 μL por pozo.
2. Siembra las células con una densidad optimizada para asegurar que alcancen la confluencia completa en 1–2 días. Dejar vacíos los cuatro pozos de las esquinas o un solo pozo de esquina, dependiendo del diseño experimental. Estos pozos funcionarán como controles de fondo.
   NOTA: Esto puede requerir prueba y error, incluyendo ajustes en el volumen y el timing del medio.
3. Monitoriza el cultivo para detectar cambios en el color del medio: el amarillamiento indica una caída del pH y requiere una sustitución inmediata por un medio fresco para mantener la salud celular.

5. Preparación para un ensayo basado en analizador de flujo extracelular

NOTA: Los formatos de acoplamiento y ensayo de flujo electrónico utilizados aquí siguen los flujos de trabajo establecidos de respiración mitocondrial basados en^{microplacas 7}, con modificaciones que incluyen la permeabilización de células BE(2)-C mediante titulación de digitonina y condiciones de tratamiento con ligando muscarínico.

1. Preparar soluciones de base y 2 soluciones de ensayo mitocondrial (MAS). Prepara dos mezclas MAS y soluciones de reactivo de trabajo (sustratos e inhibidores) (véase Tabla 1, Tabla 2 y Tabla 3) con antelación.
2. Almacenar todas las soluciones y MAS en stock a -20 °C para uso futuro, permitiendo una configuración eficiente del ensayo.
   SEGURIDAD: La rotenona, la antimicina A, la oligomicina, la FCCP, la digitonina y la TMPD son peligrosas y deben manejarse conforme a las directrices de seguridad institucionales. Todas las soluciones de stock inhibidor deben prepararse y manipularse en una campana extractora certificada para productos químicos, mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes de nitrilo y protección ocular). Las soluciones que contienen estos reactivos, así como residuos que contienen DMSO, deben recogerse y eliminarse como residuos químicos peligrosos según la normativa institucional y local. Las superficies de trabajo deben descontaminarse tras su uso.
3. Hidratación del cartucho sensor
   1. La noche anterior al experimento, hidrata el cartucho sensor del analizador de flujo extracelular añadiendo 1 mL de buffer de calibración del cartucho sensor o solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a cada pozo. Deja reposar el cartucho sensor durante la noche (12–18 h) a temperatura ambiente (20–25 °C).
      NOTA: No es necesario incubar en una incubadora sin CO₂ a 37 °C, ya que el cartucho se equilibrará a temperatura ambiente durante el proceso de carga. Una vez colocado en el analizador de flujo extracelular para calibración, el cartucho alcanzará los 37 °C en aproximadamente 15 minutos.

6. Día del experimento

NOTA: Prepara todas las soluciones frescas, ajusta el pH si es necesario y manténlas en hielo hasta el uso.

1. Descongela el sustrato congelado y 2x MAS a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 15–30 minutos o en baño maría a 37 °C durante 5–10 minutos.
2. Prepara todo el sustrato y las soluciones de inyección (véase la Tabla 4, Tabla 5, Tabla 6 y Tabla 7) y verifica que el pH esté en 7,4. Ajusta si es necesario y mantén las soluciones en hielo hasta que las uses. Utiliza la Tabla 4 y la Tabla 5 para el ensayo de acoplamiento. Para el ensayo de flujo de electrones, utiliza la Tabla 6 y la Tabla 7.
3. Carga los inhibidores y sustratos en los puertos de cartucho sensor apropiados y prepárate para ejecutar el ensayo. Dependiendo del tipo de ensayo —ensayo de acoplamiento o ensayo de flujo ^{de electrones 7} —, consulte la Tabla 4 y la Tabla 5 o la Tabla 6 y la Tabla 7, respectivamente, según sea necesario.
4. Preparar todas las soluciones de trabajo de sustrato e inhibidores a volúmenes finales definidos (mezclas a granel: 15 mL; mezclas de inyección de cartucho: 2 mL por puerto). Calcular las concentraciones para alcanzar las concentraciones finales deseadas en el pozo tras la inyección (volumen final del pozo: 700 μL después del puerto D).
5. Añadir 450 μL de la solución preparada del ensayo a cada pozo de la placa analizadora de flujo extracelular de 24 pozos que contiene ligandos muscarínicos (concentración final de ligandos: 1 μM; volumen total del pozo: 500 μL). Asegúrese de que cada pozo ya contiene 50 μL de 1x MAS buffer y celdas sumergidas.
   NOTA: Realiza este paso inmediatamente antes de cargar la placa en el analizador.
6. Carga 50 μL de cada reactivo preparado en el puerto de inyección correspondiente del cartucho sensor.

7. Programación instrumental y ejecución del ensayo

1. Encienda el analizador de flujo extracelular al menos 1–2 horas antes del experimento para permitir que la incubadora interna se estabilice a 37 °C. Mantén la recámara a 37 °C durante toda la calibración y la ejecución del ensayo.
2. Programar el analizador para realizar los ciclos adecuados de mezcla, espera y medición según la Tabla 8.
3. Etiquetar pozos y grupos experimentales en el software según el diseño experimental.
4. Empieza la prueba de ensayo. Permite que el instrumento calibre el cartucho sensor (~15 min).
5. Prepara la placa de ensayo para la carga durante la calibración del cartucho. Retrasar la carga si es necesario; el cartucho sensor permanecerá estable a 37 °C dentro del instrumento.
6. Completar el ensayo cuando termine el ciclo final de medición tras la inyección del Puerto D. Proceder inmediatamente a la normalización y análisis de datos post-ensayo.

8. Preparación de placas celulares para ensayo con analizador de flujo extracelular

1. Comienza a preparar la placa de celda inmediatamente después de colocar el cartucho sensor en el analizador para calibración. Añadir 700 μL de 1x MAS buffer a cada pozo que contenga celdas adherentes. Incuba a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 1 minuto.
2. Aspira cuidadosamente el tampón sin alterar las células adheridas. Repite el paso de lavado durante al menos 3 x 1 minuto para eliminar el medio residual de cultivo y completa todos los lavados en 10 minutos.
3. Añade 50 μL de buffer 1x MAS a un pozo de fondo designado (sin celdas) para establecer una referencia visual de volumen.
4. Aspirar el tampón de pozos experimentales, dejando aproximadamente 50 μL de tampón residual en cada pozo.
5. Incuba la placa a 37 °C en un baño maria, manteniendo la placa por encima de la superficie del agua para evitar la evaporación. Mantén a 37 °C durante 10 minutos (máximo 20 minutos) antes de cargar.
6. Inmediatamente antes de cargar la placa, añadir 450 μL de un tampón MAS 1x que contenga los sustratos adecuados a cada pozo para alcanzar un volumen final de 500 μL.
7. Inserta la placa en el analizador de flujo extracelular.

9. Fin del ensayo y análisis de datos

1. Retira la placa de celda y el cartucho sensor del analizador tras completar la prueba.
2. Normalizar los valores de OCR por pozo utilizando cuantificación total de proteínas o conteo total de células. Lisa las células con el buffer RIPA y cuantifica la proteína total usando el ensayo de Bradford u otro ensayo espectrofotométrico de proteínas.
3. Normaliza los valores de OCR usando el software de análisis y exporta los datos según sea necesario.
4. Aplicar los siguientes criterios de aceptación: confirmar la estabilidad basal del TOC (≤deriva del 15% a lo largo de dos ciclos de medición consecutivos) y confirmar ≥60% de reducción del OCR tras la inyección de rotenona, oligomicina o antimicina A.
5. Excluye las etapas que no cumplen estos criterios y reoptimiza la concentración de permeabilizadores o la densidad de siembra celular según sea necesario.

10. Exportación de resultados

1. Inserta una memoria USB en el instrumento.
2. Exporta los datos del ensayo.

11. Procesamiento de datos

1. Analiza los datos usando el software del instrumento.
2. Exportar datos procesados en formatos compatibles con el software de análisis preferido para un análisis y visualización posteriores.

Results

Optimización de la concentración de digitonina para la permeabilización de células BE(2) C en ensayo de acoplamiento
Al principio de este protocolo, estandarizamos la concentración óptima de digitonina necesaria para una permeabilización celular eficaz sin comprometer la respiración mitocondrial. En este protocolo, probamos 5 μM y 10 μM de digitonina como concentraciones iniciales y realizamos un ensayo de acoplamiento. Este ensayo evalúa el grado de acoplamiento entr...

Discussion

Este estudio introduce un protocolo rápido y rentable para evaluar la modulación de OXPHOS mediada por ligandos muscarínicos en células de neuroblastoma cultivadas. Al emplear el permeable selectivo de membrana plasmática digitonina, en combinación con pares definidos de sustrato-inhibidor, permitimos la entrega dirigida de sustratos metabólicos como el succinato directamente a las mitocondrias in situ. Este enfoque supera las limitaciones de las membranas celulares intactas, qu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cloruro de acetilcolina	MilliporeSigma	A6625	Agonista muscarínico
ADP	MP Biomédicas, Inc	ICN19014901	Aceptor de electrones, sustrato para la síntesis de ATP.
Antimicina A	AAJ63522MA	Termo Científica	Inhibe el complejo mitocondrial III
Atropina	MilliporeSigma	1044990	Antagonista muscarínico
Celdas Be2C	Colección de Cultura de Tipo Americano	CRL-2268	Una célula neuroblasto aislada del cerebro de un paciente masculino con neuroblastoma, expresa receptores muscarínicos
Digitonina	MilliporeSigma	D141	Detergente suave, permeable de membrana.
D-Mannitol	Química Termocientífica	AA3334236	Un alcohol de azúcar no metabolizable, utilizado para la estabilización osmótica y la protección de membranas
EGTA	MilliporeSigma	E0396	La quelación de calcio previene la activación de proteasas dependientes del calcio y otras enzimas que podrían degradar proteínas mitocondriales.
BSA libre de ácidos grasos	MilliporeSigma	126575	Previene efectos descontrolados de ácidos grasos y estabiliza las mitocondrias
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Un protonóforo y desacoplador de la fosforilación oxidativa en las mitocondrias
HEPES	MilliporeSigma	391340	Amortiguación del pH, compatibilidad con la función mitocondrial
L-Ascorbate	TCI América	A053925G	Ciclo intermedio del TCA, sustrato de OXPHOS
Cloruro de magnesio	MilliporeSigma	M8266	Para el equilibrio iónico, soporte para la actividad enzimática
N1,N1,N1,N1-tetrametil-1,4-fenileno diamina (TMPD)			Donante de electrones al citocromo c, evaluación de la función IV compleja bypass los Complejos I y II, TMPD/ascorbato permite la medición directa del consumo de oxígeno dependiente del Complejo IV
Oligomicina	MilliporeSigma	1404-19-9	Inhibe la síntesis de ATP mitocondrial, Complejo V
Dihidrocloruro de pirenzepina	MilliporeSigma	P7412	Agonista sesgado por el muscarí
Ácido pirúvico	Química Termocientífica	AC132155000	Sustrato de ciclo TCA
Rotenone	MilliporeSigma	557368	Inhibe el complejo mitocondrial I
Microplacas de cultivo celular Seahorse XF24 V7 PS	Agilent	102340-100	Microplacas de cultivo celular
Analizador Seahorse XFe24	Agilent	S7801BR	Los analizadores Agilent Seahorse XFe24 miden la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de las células vivas en un formato de placa de 24 pozos.
Ácido succínico	Fisher Chemical	AC158742500	Ciclo intermedio del TCA, sustrato de OXPHOS
Buffer de calibración de cartuchos con sensor XFe24	Agilent	102340100	pH del tampón PBS 7,2
Cartuchos sensores XFe24	Agilent	102340-100	sensor para medición OCR y ECAR