Artículo de método

Perfilado de accesibilidad de la cromatina en larvas completas de Caenorhabditis elegans L4

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DOI:

10.3791/69791

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17 de abril de 2026

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1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo ATAC-seq rápido y sencillo para implementarse en un gusano completo de la etapa L4 de Caenorhabditis elegans usando solo 30 μL de pellet de gusano.

Resumen

La accesibilidad a la cromatina desempeña papeles esenciales en la transcripción, la reparación del ADN y la segregación cromosómica. Las regiones hiperaccesibles suelen correlacionarse con promotores y potenciadores activos, facilitando la unión a factores de transcripción y la actividad reguladora. El ensayo para cromatina accesible por transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq) permite un perfilado genómico de la accesibilidad a la cromatina con muy pocas células. Sin embargo, su implementación en Caenorhabditis elegans está limitada por la rica cutícula colágeno del nematodo, que complica la disociación celular. Aquí presentamos un protocolo optimizado para realizar ATAC-seq en gusanos completos en la etapa L4. El procedimiento comienza con cultivos sincronizados e implica la alteración de las cutículas, la disociación enzimática y la preparación de la suspensión celular. Los núcleos permeabilizados se someten luego a la transposición de Tn5, seguida de la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la purificación de bibliotecas listas para secuenciación de nueva generación (NGS). Este protocolo requiere 30 μL de pastilla de gusano, puede completarse en un día y genera entre 5.000 y 9.000 picos de accesibilidad en la cepa de referencia Bristol N2. Este flujo de trabajo simplificado puede adaptarse a otras etapas del desarrollo o a poblaciones celulares purificadas por FACS. Al reducir las barreras técnicas para ATAC-seq en C. elegans, este método amplía las oportunidades para estudiar la accesibilidad de la cromatina a nivel genómico en respuesta a perturbaciones genéticas y ambientales en un contexto de organismo completo.

Introducción

Los genomas eucariotas están densamente empaquetados dentro del núcleo celular. Para hacer frente a las restricciones espaciales, el ADN está estrechamente envuelto alrededor de nucleosomas, complejos multiproteicos compuestos por ocho histonas altamente conservadas en diferentesfilos 1. Los patrones de accesibilidad a la cromatina varían según el estado celular en un tejido, y los patrones específicos de genes 2,3,4. La accesibilidad a nucleosomas está fuertemente correlacionada con la transcripción activa, especialmente en los promotores y regiones reguladoras distales como los potenciadores, que son accesibles para los factoresde transcripción 5. Las regiones de cromatina abierta también desempeñan papeles importantes en la reparación, replicación y segregación cromosómicadel ADN 3. En cambio, la accesibilidad reducida suele correlacionarse con la heterocromatina silenciada y secuenciasrepetitivas 6,7.

El mapeo de la accesibilidad a la cromatina ha sido un enfoque poderoso para comprender la regulación génica. Se han empleado diferentes técnicas para analizar la accesibilidad de la cromatina. Entre los métodos más antiguos, la micronucleasa (MNasa) y la digestión de DNasa I se utilizaron para mapear la posición y accesibilidad de nucleosomas en lociespecíficos 8,9. Estas técnicas se implementaron posteriormente para estudios genómicos a nivel genómico cuando se combinaron con secuenciación de nueva generación (NGS)10,11. Sin embargo, estas técnicas requieren una calibración cuidadosa de la concentración enzimática y el tiempo de reacción, junto con un número considerable de células, para su implementación exitosa.

En 2013, el laboratorio Greenleaf estableció el ensayo para cromatina accesible por transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq) para mapear de forma fluida la accesibilidad a la cromatina a nivel genómico utilizando un bajo número decélulas 12. ATAC-seq aprovecha la transposasa Tn5 disponible comercialmente para insertar preferentemente secuencias cortas de ADN (es decir, códigos de barras) en regiones abiertas de cromatina, normalmente desprovistas de nucleosomas, y se correlaciona con promotores y potenciadores activos. El protocolo requiere permeabilización celular y aislamiento de núcleos, seguido de una digestión limitada con Tn5 para la etiqueta de la cromatina hiperaccesible. Posteriormente, se incorporan índices complementarios durante la PCR, facilitando la multiplexación de muestras antes de NGS13. ATAC-seq ha demostrado ser un protocolo robusto que también permite la huella del factor de transcripción in silico y se ha implementado para la resolución de célulaúnica 14,15,16,17. Además de muestras de ratones y humanos, ATAC-seq se ha implementado en varios sistemas, incluyendo pez cebra e invertebrados como Drosophila y el nematodo Caenorhabditis elegans 18,19,20.

Durante décadas, C. elegans ha sido un sistema modelo poderoso en campos como el desarrollo, la biología celular y la neurociencia, lo que ha llevado a descubrimientos fundamentales como la identificación de microARN y la interferencia de ARN (ARNi)21,22. Tiene un genoma compacto de 100 MB con ~20.000 genes codificantespara proteínas, 23. La regulación génica ocurre mediante la actividad del promotor así como de potenciadores distales, que han sido mapeados mediante ATAC-seq en diferentes tejidos, etapas de desarrollo y puntos de envejecimiento24,18. El perfilado de accesibilidad a la cromatina se ha convertido así en una herramienta valiosa para comprender la regulación génica en C. elegans. En consecuencia, ATAC-seq tiene un potencial particular para estudiar paisajes epigenéticos en diferentes condiciones ambientales o aislados salvajes para descubrir diversas respuestas transcripcionales. Además, podría aportar información sobre la arquitectura de la cromatina de otros nematodos patógenos y no patógenos.

Uno de los principales retos metodológicos en C. elegans es la presencia de una cutícula rica en colágeno que debe disociarse para obtener una suspensión celular homogénea de gusanosenteros 25. Para abordar este desafío, compilamos y optimizamos diferentes protocolos para desintegrar los nematodos y luego realizamos ATAC-seq en C. elegans18,26. Se prefiere utilizar la etapa larval L4, ya que los animales en este punto de desarrollo poseen una línea germinal activa transcripcionalmente, que se traduce en cromatina abierta, proporcionando una fuente consistente e informativa de acceso a la cromatina en células somáticas. Aquí presentamos un protocolo rápido y eficiente para la disociación de gusanos y la generación de suspensión celular, habilitando ATAC-seq en C. elegans. Nuestro método está optimizado para gusanos de la etapa L4 y requiere tan solo 30 μL de pellet de gusano, con potencial para adaptarse a otras etapas de desarrollo o a muestras más pequeñas, como las células purificadas por FACS. Este protocolo puede realizarse en diferentes cepas y condiciones de C. elegans, permitiendo identificar picos de accesibilidad de 5.000–9.000 de cromatina en la cepa de referencia Bristol-N2, sentando las bases para análisis posteriores de accesibilidad a la cromatina.

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Protocolo

Se recomienda llevar guantes en todo momento.

NOTA: Día 1: Preparando la población sincronizada de gusanos. Todas las lombrices se cultivaron en placas NGM sembradas con E. coli OP50. Cosas necesarias antes de empezar: (por muestra o cepa), Una placa de gusano adulto de 90 mm o dos de 60 mm, una placa de 90 mm o dos de 60 mm con comida, Tampón estérilM9 27 (3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O a 1 L. Esterilizar por autoclave)

1. Colección de gusanos

  1. Toma una placa de 90 mm (o dos de 30 mm) con la población adulta del gusano.
  2. Recupera los gusanos con buffer M9 y transfiere a un tubo centrífuga de 15 mL.
  3. Repite el paso anterior para recuperar todos los gusanos de la(s) placa(s).
  4. Deja que los gusanos se asienten en el tubo de 15 mL durante un minuto y retira cuidadosamente el buffer M9.
  5. Asegúrate de tener ~1 mL de gusanos.

2. Blanqueamiento

  1. Añadir 5 mL de tampón M9 + 650 μL de NaOH 5M + 1.300 μL de lejía doméstica (solución al 5% de NaClO).
  2. Vórtice a velocidad máxima durante 1–2 minutos (no más de 2,5 minutos).
  3. Centrifuga a 1.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente (RT).
  4. Quita el sobrenadante y añade 9 mL de buffer M9.
  5. Repite las secciones 2.3 y 2.4 cinco veces más.
  6. Resuspende los embriones en 7 mL de tampón M9.
    NOTA: El protocolo de blanqueo puede variar en eficiencia dependiendo de la temperatura y el tipo de lejíacomercial 28.

3. M9 (líquido) eclosión nocturna de los huevos

  1. Asegúrate de que el tubo de recogida con los huevos blanqueados esté bien cerrado.
  2. Coloca el tubo en movimiento lento a 20 °C (por ejemplo, en un agitador dentro de una habitación a 20 °C).
  3. Los gusanos eclosionarán durante la noche y se detendrán en L1.
    NOTA: No dejes el tubo más de 12 horas.

4. Día 2: crecimiento de gusanos: recuperación de gusanos L1 .

  1. Saca el tubo del agitador y corrobora bajo el microscopio que hay gusanos L1 .
  2. Deja que el tubo se asiente verticalmente durante aproximadamente 1 hora en la RT.
  3. Retira el sobrenadante y transfiere ~300 lombrices L1 a una placa de 90 mm o dos platos de 30 mm con comida.
  4. Colócalos en una incubadora a 20 °C y déjalos crecer durante 26 horas hasta alcanzar la etapa L4.

5. Día 3: Preparación de soluciones de stock: Las siguientes soluciones deben estar preparadas para crear soluciones frescas en el día 4

NOTA: Esto se puede hacer en el día 2 o 3.

  1. 1 mL de SDS al 10%.
  2. 50 mL de 1M HEPES pH 8 (autoclave).
  3. 250 mL de sacarosa al 20 % (autoclave).
  4. 100 mL de NaCl 2M: prepara (autoclave).
  5. 50 mL de 2M KCl (autoclave).
  6. 10 mL de 1MCaCl 2 (autoclave).
  7. 10 mL de 1MMgCl 2 (autoclave).
  8. 100 mL de 1M Tris, pH 7,4.
  9. 5 mL de NaCl 5M (autoclave).
  10. 500 μL de 10% Tween-20.
  11. 500 μL de 10% de Nonidet P40/IGEPAL.
  12. 100 μL de Digitonina al 5% (necesita calentarse a 65 °C para disolverse).
  13. 500 μL de 10% de BSA (filtro con 0,22 μm) almacenados a 4 °C.
    Día 4: Gusanos en fase L4 para ATAC
    NOTA: Antes de empezar, asegúrate de tener una incubadora a 25 °C, una centrífuga a 4 °C lista, calientar la Digitonina a 65 °C (para la preparación de tampón fresco), tener tampón estéril M9, H2O estéril y filtros de 20 μm.

6. Preparación de la solución

  1. Preparar soluciones frescas (véase la Tabla 1). Siempre manipula L-15, FBS al 10% y el buffer de huevo en condiciones estériles y mantenlos fríos.

Tabla 1: Culatos para la preparación de soluciones frescas. Recetas para la preparación del stock para la disociación de nematodos y el protocolo de suspensión celular (secciones 6 y 7). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

7. Protocolo de disociación de nematodos y suspensión celular

NOTA: Se necesitará una placa de 90 mm o dos de 30 mm con una población de gusanos sincronizados L4.

  1. Tras 26 horas en la incubadora a 20 °C, corrobora bajo el microscopio que la mayoría de los gusanos están en la etapa L4.
  2. Recupera todos los gusanos de las placas con buffer M9 y colócalos en un tubo centrífuga de 1,5 mL.
  3. Lava 5 veces con 1 mL deH2Oestéril dejando que los gusanos se asienten por gravedad.
  4. Transfiere el tubo con los gusanos a una incubadora a 25 °C durante 30 minutos para eliminar los restos de comida intestinal.
  5. Toma 50 μL de la pellet de gusano y colócala en un tubo nuevo.
  6. Añade 200 μL de tampón fresco SDS-DTT y mézclalo en un rotador de tubo exactamente durante 5 minutos (no más).
  7. Añade 1 mL de buffer frío para huevos y da una vuelta a un picofuge para eliminar el sobrenadante. Repite 6 veces.
  8. Añade 80 μL de pronasa fresca preparada (15 mg/mL).
  9. Con una pipeta de 200 μL (con puntas filtradas), mezcla 70 veces la mezcla de gusanos pronasas e incuba durante 15 minutos en RT.
  10. Añade 800 μL de medio L-15 al 10% de FBS y centrifuga 5 minutos a 500 x g a 4 °C.
  11. Añade 1 mL de medio L-15 al 10% FBS y repite la centrifugación.
  12. Repite el paso anterior dos veces más.
  13. Retirar el sobrenadante y volver a suspender en 900 μL de medios L-15 al 10% de FBS.
  14. Filtra con un filtro de 20 μm.

8. Aislamiento de núcleos y etiquetado por cromatina

NOTA: Usa puntas filtradas con pipeta. Antes de empezar: Saca el tampón Tn5, deja que se descongele, pon un termobloque a 37 °C, saca el kit de purificación de productos PCR (Tabla de materiales), pon el tampón EB a 37 °C, la centrifugación de las columnas debe realizarse en RT.

  1. Centrifuga la suspensión de celda filtrada durante 5 minutos a 500 x g y a 4 °C.
  2. Quita el sobrenadante, dejando ~50 μL.
  3. Añade 45 μL de Lysis Buffer (recién preparado) y vuelve a suspender cuidadosamente.
  4. Añade cuidadosamente 50 μL de Wash Buffer (no mezclar).
  5. Centrifugar durante 5 min al 500 x g a 4 °C. Elimina el sobrenadante. Mantenlo en el hielo.
  6. Durante el centrifugado, prepara para cada reacción (Rx) la siguiente mezcla de Tn5 por muestra: 25 μL Tn5 Buffer29, 24,8 μL H2O libre de nucleasa, 0,2 μL enzima Tn5. Prepara una mezcla maestra para varias muestras.
  7. Tras la centrifugación, retira el sobrenadante. Mantén los núcleos en hielo. Añade 50 μL de mezcla de Tn5 al pellet de núcleos y pipetea lentamente siete veces. Incuba a 37 °C durante 30 minutos en un termobloque. Asegúrate de dar pequeños golpecitos en cada tubo cada 10 minutos.
    NOTA: Retire el kit de purificación PCR y coloque el tampón EB en una incubadora a 37 °C. Los siguientes 5 pasos usarán los buffers de este kit.
  8. Tras la incubación de Tn5, añade 300 μL de buffer PB (amarillo) del kit y mezcla un vórtice a máxima velocidad durante 25 s.
  9. Toma todo el volumen del tubo y transfiere a la columna de spin (morado, almacenado a 4 °C) y centrifuga 1 minuto a velocidad máxima en RT.
    NOTA: La columna contendrá el ADN, por lo que el sobrenadante puede descartarse con confianza.
  10. Añadir 750 μL de buffer PE a la columna de spin y centrifugar 1 minuto a velocidad máxima en RT.
  11. Descarta el sobrenadante con el tubo de recogida. Colocar la columna en un tubo nuevo de 1,5 mL y repetir la centrifugación; desecha el tubo de 1,5 mL.
  12. Coloca la columna en un tubo nuevo de 1,5 mL etiquetado y añade 10 μL de buffer EB a 37 °C en el centro de la columna. Asegúrate de no tocar la columna. Déjalo en RT durante 1 minuto.
  13. Centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad en RT; nunca a 4 °C.
  14. Repite los dos últimos pasos para un total de 20 μL de elusión en el tampón EB.
    NOTA: Pausa opcional: Si se detiene, se pueden almacenar muestras a -20 °C. Aquí, la cromatina etiquetada está en un volumen de 20 μL.

9. Amplificación de bibliotecas

  1. Para la amplificación de la biblioteca ATAC, es necesario realizar una PCR en tiempo real para estimar el número adecuado de amplificación del ciclo (véase la Tabla 2). Haz esto en una placa de PCR.
  2. Para estimar los números de ciclo para la amplificación final, se debe tomar el número de ciclo que corresponde al primer tercio de la curva de amplificación. Es ideal que el número de ciclo no supere 15. El número de ciclo debe estimarse para cada muestra.
    NOTA: Tras la qPCR, el ADN etiquetado está en un volumen de 18 μL. Pausa opcional: Si se quiere parar, las muestras pueden almacenarse a -20 °C.
  3. Amplificación final de la biblioteca ATAC:
    1. Cada muestra debe tener un cebador diferente para RV (toma notas).
    2. Cada muestra debe amplificarse para el número de ciclo (N) estimado para cada una.
    3. Realizar esta PCR en tubos de 200 μL (véase la Tabla 3).
    4. Aquí hay 8 μL de ADN etiquetado y 50 μL de bibliotecas ATAC amplificadas
    5. Pausa opcional: Si se quiere detenerse, se puede almacenar una muestra a -20 °C.

Tabla 2: Instrucciones para la primera amplificación de la biblioteca. Programa de recetas y PCR para la primera amplificación de la biblioteca (sección 9). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Instrucciones para la amplificación final de la biblioteca ATAC. Programa de recetas y PCR para la amplificación final de la biblioteca (sección 9). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

10. Purificación de bibliotecas

NOTA: Antes de empezar, saca las cuentas de selección de tamaño (AMPure, SPRIselect o bolitas calibradas caseras) de la nevera para que se ajusten a la temperatura ambiente. Mezcla las cuentas vigorosamente usando el vórtice cada vez antes de usarlas.

  1. Prepara 1 mL de etanol al 80% (grado molecular).
  2. Añade 25 μL (0,5 vol) de perlas al tubo de muestra (donde hay 50 μL) y mézclalo con la pipeta.
  3. Incubar en tiempo real durante 10 minutos.
  4. Coloca los tubos en el rack magnético durante 5 minutos.
  5. Transfiere el sobrenadante (70 μL) a un tubo limpio nuevo de 200 μL.
    NOTA: En este paso, se descartan los fragmentos de ADN de <200 pb.
  6. Añade 65 μL (1,3 vol) de cuentas y mezcla 10 veces.
  7. Incubar en tiempo real durante 10 minutos.
  8. Coloca los tubos en el rack magnético durante 5 minutos.
  9. Descarta el sobrenadante (sin sacar el tubo del soporte magnético).
    NOTA: En este punto, las perlas contienen fragmentos de ADN de >200 pb y <1000 pb.
  10. Con el tubo aún en la rejilla magnética, añade 200 μL de etanol fresco al 80% preparado directamente sobre las perlas y haz un pipete varias veces para lavarlas.
  11. Retira el etanol y repite el lavado con 200 μL de etanol.
  12. Tira el etanol y deja que las cuentas se sequen con la tapa abierta durante ~2–5 minutos (no las dejes secar demasiado).
  13. Saca la(s) muestra(s) del estante magnético. Resuspende 50 μL de H2Oestéril. Asegúrate de lavar todas las perlas de las paredes del tubo.
  14. Finalmente, incuba el/los tubo(s) en el estante magnético durante 5 minutos.
  15. Transfiere el sobrenadante a un tubo limpio nuevo. Aquí se almacenan las bibliotecas ATAC amplificadas y purificadas.
    NOTA: Las bibliotecas pueden almacenarse a -20 °C durante un corto periodo (hasta cuatro semanas) o durante períodos más largos a -80 °C.

11. Distribución del tamaño de los fragmentos

  1. Una vez realizada la amplificación final, se recomienda pasar una parte de la muestra por una electroforesis capilar para poder observar el patrón de distribución del tamaño del fragmento.

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Resultados

El control de calidad tras la etiquetación garantiza una preparación precisa de la biblioteca
Durante el protocolo, es importante prestar especial atención a la qPCR realizada tras la etiquetación de cromatina (sección 9), ya que es un paso vital para evaluar la calidad del ADN y el rendimiento del experimento. La Figura 1A muestra dos curvas de amplificación; El de la izquierda (menos de 15 ciclos) representa un material de buena calidad que demuestra que todo había teni...

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Discusión

Aquí describimos un protocolo optimizado para perfilar la accesibilidad de la cromatina a nivel genómico mediante ATAC-seq en gusanos completos de la etapa L4 de Caenorhabditis elegans . La accesibilidad a la cromatina influye directamente en la expresión génica, la reparación del ADN, la replicación y la recombinación, y aunque ATAC-seq se ha convertido en un enfoque estándar para muestras celulares y tisulares, su aplicación a organismos intactos plantea desafíos técnicos únic...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses. No se utilizó IA generativa en la redacción, análisis o preparación de este manuscrito.

Agradecimientos

J. Hersch-González recibió una beca doctoral del Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías, CONAHCYT (actualmente Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación, SECIHTI) (#CVU 846476). J Hersch-González contó con el apoyo de una beca CONAHCYT (ahora SECIHTI) (788519). Este proyecto fue apoyado por la subvención PAPIIT-UNAM IN217824 y la subvención SECIHTI CBF-2025-I-2275 a VJV. En el IFC, agradecemos a la UBM: Laura Ongay-Larios, Guadalupe Códiz Huerta y Minerva Mora Cabrera; la UBMI: Augusto César Poot-Hernández y Carlos Peralta Álvarez; y Unidad de Cómputo, Imagenología, Taller y Biblioteca. Agradecemos mucho al Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) por proporcionar las cepas utilizadas en este trabajo. El CGC está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación del NIH (P40 OD010440).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
250 mL, 0.22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10GPerjudicial
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML

Referencias

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