Seguimiento síncrono multiarticular basado en aprendizaje profundo para la cuantificación objetiva de la cinemática locomotora de las extremidades posteriores en ratas

Summary

Este protocolo establece una cadena de evaluación cinemática de la extremidad posterior de rata utilizando una prueba de cinta sin marcadores con autoetiquetado de trayectorias multiarticular impulsado por aprendizaje profundo, que permite la cuantificación reproducible del movimiento.

Abstract

La evaluación precisa y objetiva de la marcha de las ratas es esencial para los campos de investigación en neurociencia y kinesiología. Los sistemas convencionales dependen frecuentemente de la imagen de huella para la inferencia indirecta de la marcha, que no puede capturar completamente la cinemática multiarticular de la extremidad posterior. Este estudio establece un sistema de análisis de la marcha basado en cinta de correr sin marcadores para roedores, integrando algoritmos personalizados de aprendizaje profundo con una cinta de soporte programable para permitir el seguimiento en tiempo real de múltiples articulaciones de las extremidades inferiores y la cuantificación cinemática multidimensional. El sistema extrae automáticamente parámetros del ciclo de marcha, trayectorias articulares, patrones de distribución de fuerzas y suavidad de movimiento bajo condiciones de velocidad modulada (0-300 mm/s), inclinación (±gradiente de 30°) y soporte de peso graduado (0-500 g), proporcionando una herramienta objetiva de evaluación para la investigación del comportamiento neuromuscular. Utilizando modelos de lesión medular (LME), los resultados demuestran la sensibilidad del sistema para detectar diferencias multidimensionales en el rango de movimiento articular, la continuidad de la trayectoria, la fuerza propulsora y la suavidad del movimiento entre roedores sanos y lesionados, validando sus capacidades de discriminación y clasificación de enfermedades. En comparación con las puntuaciones subjetivas tradicionales o los métodos de huella, esta plataforma elimina el sesgo personal y las limitaciones de datos de baja dimensión, a la vez que combina una arquitectura impulsada por aprendizaje profundo y ventajas de recogida de datos de alto rendimiento. Es aplicable a investigaciones que involucran lesiones nerviosas centrales o periféricas, enfermedades neurodegenerativas, trastornos musculoesqueléticos y procesos de envejecimiento. Mediante la integración síncrona de los módulos de neuroelectrofisiología, el sistema permite además el acoplamiento temporal de las señales de marcha y neuronales, estableciendo un marco metodológico para analizar mecanismos de control central-periférico y desarrollar estrategias neuromoduladoras.

Introduction

En la neurociencia contemporánea y la investigación locomotora, la cuantificación objetiva de la marcha es ahora imprescindible para diseccionar funciones neuralmusculares, dilucidar los mecanismos de la enfermedad y evaluar estrategias^{de rehabilitación.} Su alta resolución espaciotemporal permite captar sutiles variaciones en las sinergias entre comandos neuronales, perfiles de activación muscular y mecánica esquelética, estableciendo así una base empírica para investigar la coordinación de vías supraespinales, retroalimentación periférica y contextos mecánicos. Las métricas cinemáticas reproducibles aumentan la sensibilidad a la detección de lesiones, cambios degenerativos y efectos terapéuticos, acelerando la cadena de desarrollo de fármacos^{y dispositivos 2}.

Plataformas convencionales de evaluación como CatWalk, DigiGait o análisis simplificados de huella insinúan indirectamente cinemática articular basada en patrones de contacto plantares. Estos enfoques producen métricas de baja resolución e inconsistentes que no capturan la complejidad cinemática multiarticular de las extremidades^{posteriores 3,4}. El objetivo general de nuestro método es establecer un sistema de análisis de marcha de alta precisión, sin marcadores y con soporte de peso, diseñado específicamente para modelos de roedores. Por ello, establecemos un marco novedoso que: (i) mantiene a los roedores en postura erguida bajo carga axial controlada (0-100% del peso corporal) durante la imagen continua de múltiples articulaciones, (ii) localiza directamente los hitos anatómicos del plano sagital desde análisis de vista lateral hasta aprendizaje profundo para generar trayectorias espaciales 2D, (iii) exporta ángulos articulares resueltos en el tiempo y cinemática segmentaria para modelado^{estadístico 5}. Fundamentalmente, este marco se basa en la aplicación del aprendizaje profundo a tareas de visión por ordenador, lo que permite una extracción robusta de características conjuntas a partir de datos de vídeo.

En comparación con los sistemas existentes, esta plataforma ofrece cuatro ventajas clave. Su funcionamiento sin marcador elimina etiquetas reflectantes o implantadas, al tiempo que reduce significativamente la complejidad procesal y los artefactos de movimiento⁶. El sistema integrado de suspensión con retroalimentación de fuerza permite un soporte preciso y graduado del peso corporal (0-100%), facilitando una evaluación integral de la marcha a lo largo de todo el continuo de carga a descarga, algo que está ausente en las cintas de correr^{comerciales 7}. La arquitectura de aprendizaje profundo permite un reentrenamiento rápido para cepas, edades o condiciones patológicas novedosas, superando el seguimiento manual en^{escalabilidad 8}. Y las coordenadas espaciales multiarticulaciones de alta precisión permiten un análisis detallado de la cinemática interarticular junto con un perfil cuantitativo de patrones de marcha aberrantes.

Este protocolo es ampliamente aplicable. Permite investigar el control supraespinal, los bucles de retroalimentación propioceptiva y las sinergias musculares bajo demandas mecánicas^{moduladas 9}. Fisiopatológicamente, suministra biomarcadores locomotores sensibles para lesiones medulares (LME), ictus, neurodegeneración, neuropatías periféricas y trastornos neuromusculares ^8,10. Terapéuticamente, apoya la evaluación longitudinal de intervenciones farmacológicas o basadas en dispositivos con un mayor poder estadístico gracias a cinemática de alta^{resolución 11}. La arquitectura modular permite una integración fluida con plataformas complementarias, por ejemplo, electromiogramas (EMG) o señales cerebrales, facilitando la decodificación mecanicista de correlatos neuronales en el movimiento de extremidades inferiores.

Protocol

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Instituto de Investigación Cerebral de Pekín y cumplieron con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. No se observaron eventos adversos relacionados con el procedimiento.

1. Preparación del equipo

1. Enciende la fuente de alimentación del sistema de cinta y selecciona el botón de Control de Velocidad en la pantalla táctil.
2. Deja que la correa funcione a baja velocidad durante 30 segundos para observar si la cinta de la cinta se desvía.
3. Selecciona el botón de Control de Inclinación , luego pon la inclinación en 0°, haz clic en Cero y confirma que el valor mostrado coincide con la burbuja de nivel.
4. Entra en la interfaz de suspensión , cuelga un peso de 10 g y comprueba si la lectura de tensión está cerca de 0,10 N.
5. Enciende el Ordenador Personal Industrial (IPC) e introduce el software de adquisición y análisis de vídeo.
6. Crea un directorio del experimento del día, incluyendo información como el nombre del experimento, identificación del animal, grupo experimental, velocidad, inclinación y porcentaje de reducción de peso.
7. Fija la cámara industrial de alta velocidad (UC70, resolución: 1280X1024, tasa de fotogramas: 60 fps), equipada con un objetivo de enfoque manual (f = 12 mm), sobre un soporte de perfil de aluminio. Coloca la lente de la cámara perpendicular al eje longitudinal de la cinta para captar una vista estrictamente lateral, manteniendo una distancia horizontal de trabajo de 15 cm desde el plano de la cinta de la cinta.
8. Coloca la lente horizontalmente usando un nivel de burbuja y asegúrate de que el torso de la rata ocupe los dos tercios centrales del marco. Ajusta el enfoque y la apertura hasta que las líneas de escala en la regla trasera (cuadrícula de 1 cm) sean claramente visibles.
9. Haz clic en Vista previa para confirmar que no hay relevo y que el brillo de fondo es uniforme. Si la imagen es demasiado oscura, se utiliza una luz de fondo de diodo emisor de luz (LED) para aumentar el brillo; Si está sobreexpuesta, reduce la ganancia y estrecha la apertura adecuadamente.
10. Haz clic en Iniciar grabación para comprobar la calidad de la grabación de datos. Haz clic en Detener la grabación y establece la ruta de almacenamiento de datos. Tras completar las pruebas de equipo anteriores, comienza las pruebas en animales.

2. Preparación animal y realización de pruebas

1. Transfiere a la rata junto con su jaula original a la sala experimental y déjala reposar durante 10 minutos. Durante este periodo, permite el acceso libre a alimentos y agua.
2. Registra el peso corporal usando una báscula electrónica (con precisión de 0,1 g). Incluye ratas con pesos corporales iguales (±10 g) para minimizar los efectos de confusión del tamaño corporal.
3. Si el color del pelaje de las patas traseras no contrasta lo suficiente con el fondo, utiliza una afeitadora eléctrica para eliminar suavemente una tira de pelo de 1 cm de ancho en la parte exterior del muslo y la parte trasera de la pierna inferior para mejorar la precisión del reconocimiento articular.
4. Luego utiliza una cinta blanda para medir la distancia en línea recta desde la cadera hasta el tobillo (mm), que servirá de base para la posterior normalización de la zancada.
5. Ponte guantes, agarra a la rata y pasa la correa elástica del pecho alrededor de la axila delantera, sujetándola al raíl ajustable. Asegúrate de que la correa esté lo suficientemente suelta como para insertar un dedo sin afectar la respiración del animal.
6. Gira lentamente la maneta del brazo de suspensión mientras observas el valor de tensión en la pantalla, aumentando gradualmente hasta la relación de reducción de peso objetivo. Confirma que las patas traseras de la rata siguen en contacto total con el suelo.
7. Ajusta la altura de la barra de agarre. Afloja el pomo superior y coloca la barra de agarre delantera ligeramente por debajo de la punta de la nariz de la rata cuando estés erguido, asegurando que el animal pueda agarrarla fácilmente sin tener que inclinar la cabeza hacia atrás en exceso o inclinarse.
8. En la pantalla táctil, ajusta la velocidad a 150 mm/s y la inclinación a 0°. Realiza una sesión de aclimatación de 10 minutos para adaptar al animal al nivel específico de soporte del peso corporal. Vigila a la rata en busca de signos de estrés, por ejemplo, congelación, defecación.
   1. Si la marcha sigue siendo irregular (definida como [>3 interrupciones/min]), extiende la duración en incrementos de 2 minutos, hasta un máximo de 20 minutos.
9. La aclimatación se considera exitosa cuando la rata mantiene una zancada continua y uniforme durante al menos 60 segundos sin arrastrar la pata, y la cola cuelga de forma natural sin rigidez. Excluir a los animales que no cumplan estos criterios después del periodo máximo de aclimatación.
10. Introduce los parámetros requeridos para el experimento formal. Introduce secuencialmente la velocidad deseada (cualquier valor entre 0-300 mm/s) y la inclinación (−30° a +30°) en la pantalla táctil, y selecciona la dirección de la correa de la cinta.
11. Después de empezar la cinta, observa la postura de la rata al caminar. Si se desvía del área central de 1/3, da un golpecito suave en la pared derecha una vez con el nudillo. La mayoría de los animales corregirán su posición por sí mismos. Si dos correcciones consecutivas no son efectivas, reposiciona la rata y vuelve a grabar el ensayo.
12. Tras la estabilización, haz clic en Iniciar Grabación y captura continuamente al menos cinco ciclos completos de marcha.
13. Al final de cada prueba, reduce inmediatamente la velocidad a 0, desengancha la correa del pecho y devuelve a la rata a su jaula correspondiente.
14. Administra agua durante el descanso, con al menos 3 minutos entre pruebas.
15. Registra al menos tres ensayos bajo las mismas condiciones. Si un animal corre de forma continua más de seis pruebas, añade un descanso adicional de 2 minutos para evitar fatiga acumulada.
16. Realiza el preentrenamiento durante cinco días consecutivos antes del experimento formal: camina 10 minutos diarios a 150 mm/s, inclinación de 0° y cero reducción de peso, observando la marcha.

3. Extracción de datos de marcha

1. Primero, extraer segmentos que contienen la marcha objetivo, normalmente alrededor de 10 s, lo que debería incluir al menos 10 ciclos de marcha estables analizables.
2. Importa el archivo .mov al software de análisis y registra la información individual de las ratas, incluyendo número de identificación, grupo y condiciones experimentales.
   NOTA: El sistema emplea la arquitectura YOLO-NAS Pose, una red neuronal de última generación optimizada para la estimación de poses de alto rendimiento.
   Construcción de conjuntos de datos: El modelo se entrenó con un conjunto de datos robusto de 6.000 fotogramas de vídeo. Estos marcos se anotaban manualmente con las coordenadas de cinco articulaciones clave de las extremidades posteriores (cresta ilíaca, cadera, rodilla, tobillo y punta) utilizando la interfaz gráfica de DeepLabCut para garantizar una precisión exacta en el terreno.
   Entrenamiento: La red pasó por aprendizaje por transferencia en una GPU NVIDIA RTX 3080 para adaptar los pesos de la postura YOLO-NAS a las características específicas de la extremidad trasera del rata.
   Inicialización: En el software, selecciona el modelo preentrenado 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' y establece el umbral de confianza en 0,8 para excluir puntos clave de baja certeza.
   Durante la fase de análisis, el modelo YOLO-NAS Pose procesa el flujo de vídeo fotograma a fotograma. A diferencia de los métodos tradicionales de visión por ordenador que dependen de la resta de fondo, esta arquitectura de aprendizaje profundo localiza directamente la rata y predice coordenadas conjuntas dentro de la caja delimitadora.
   Postprocesamiento: El algoritmo extrae las coordenadas x e y de los mapas de probabilidad. Para mitigar el jitter de alta frecuencia, se aplica un filtro mediano (tamaño de ventana: 3 fotogramas) a las trayectorias brutas.
   Salida: El sistema fija con éxito las cinco articulaciones objetivo dentro del fotograma de vídeo, generando coordenadas espaciales resueltas en el tiempo para toda la secuencia de marcha. Estos datos se exportan automáticamente como archivos .csv para cálculo cinemático. Utilizando la regla de tablero (cuadrícula de 1 cm) capturada simultáneamente, el sistema establece una relación de conversión, calcula automáticamente el factor de escalado y convierte por lotes las coordenadas del píxel en milímetros.
3. Exporta las coordenadas de posición espacial de cada articulación a lo largo del tiempo como un archivo .csv para el cálculo posterior del índice.
   NOTA: El software calcula automáticamente la longitud de la zancada, la frecuencia de los pasos y la altura del pie, y exporta los cambios en la posición espacial y los ángulos de las cinco articulaciones de las extremidades inferiores a lo largo del tiempo. En función de la altura de los dedos, el software divide automáticamente cada paso en fase de swing y fase de postura, y calcula la proporción entre la fase de swing y la fase de postura dentro de cada ciclo de marcha.

4. Comparaciones cinemáticas intergrupales

1. Normaliza cada ciclo de marcha dentro del grupo desde 0% (contacto con los pies) hasta 100% (el mismo contacto con los pies) para unificar las diferentes longitudes del ciclo, facilitando el promedio y la comparación entre grupos. Los tipos de imágenes que pueden generarse para ilustrar la dinámica de la marcha se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.

5. Análisis estadístico

1. Realiza todos los análisis estadísticos utilizando el software GraphPad Prism.
2. Verifica la normalidad de la distribución de los datos usando la prueba de Shapiro-Wilk.
3. Para la validación cinemática y la comparación demostrativa del índice de masa corporal (IMC), presenta los datos como media ± SEM.
4. Evalúa las diferencias entre las dos condiciones experimentales utilizando un test t de Student no emparejado.
5. Definan los umbrales de significación estadística como *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,005. Cabe señalar que en este estudio piloto de validación se incluyeron un total de n = 3 ratas.

6. Incrustación del módulo electrofisiológico

1. Tras completar el modelado animal, implanta el dispositivo de registro electrofisiológico.
2. Para el registro neural, coloca electrodos en la superficie del cráneo, el espacio epidural o la corteza cerebral para registrar señales cerebrales.
3. Para el registro de la médula espinal, inserta electrodos de grabación en el espacio epidural del foramen intervertebral.
4. Para la grabación electromagnética, entierra cables de plata bipolares en los músculos para registrar la actividad eléctrica muscular.
5. Después de la implantación, permite que el animal se recupere durante 5-7 días, revisando la herida y la marcha diariamente para asegurarte de que no hay signos de infección o dolor antes de proceder al experimento en la cinta.
6. Completar el equipo y los preparativos animales tal y como se ha descrito anteriormente.
7. Sincroniza la colección de parámetros electrofisiológicos y vídeos de movimiento, asegurando que los datos electrofisiológicos y de vídeo compartan la misma marca temporal.
8. Tras la recogida de datos, alinear las señales neuronales con fotogramas de vídeo durante el análisis para observar intuitivamente los patrones electrofisiológicos en diferentes fases del ciclo de la marcha, proporcionando evidencia directa para explorar el mecanismo de acoplamiento central-periférico.

Results

El diagrama esquemático y la foto real de la estructura del sistema de cinta de correr se muestran en las Figuras 1A y B, respectivamente. El dispositivo es capaz de obtener imágenes laterales de alto contraste sin marcadores. La cinta permite ajustes para velocidad, inclinación, dirección y reducción de peso, y está equipada con un panel de control numérico. La interfaz de software que la acompaña incluye una interfaz de monitorización y ad...

Discussion

Este protocolo delimita un sistema de análisis de la marcha basado en cinta de correr para ratas y sus procedimientos operativos, proporcionando una herramienta de evaluación multidimensional y objetiva para la investigación en comportamiento neuromuscular. Como se demostró en las comparaciones intergrupales de parámetros de marcha entre LME y ratas sanas dentro del estudio ejemplar, el sistema adquiere coordenadas espaciales brutas de movimiento de las extremidades inferiores de los suj...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anotación y Anotación AI de Paso Software de adquisición	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI es el software integrado de análisis para la cinta de correr MOVEMETRICS, unificando la grabación de vídeo, el registro de metadatos y el análisis automatizado de la marcha en un único flujo de trabajo.
Impacto mecánico	Ciencias de la Vida de tracción trasera, Shenzhen, China
Sistema de registro lógico electrofisiológico multicanal	Kedou (suzhou) Compañía de Tecnología Informática y Cerebro Informático,	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A es un sistema compacto de adquisición electrofisiológica in vivo de 128 canales , diseñado para el registro neuronal de alta resolución en animales de laboratorio pequeños a grandes. Integrando headstages ligeros, plug and play (&le), conversión A/D de 16 bits y amplificadores programables, captura EEG, ECoG, LFP, picos, señales EMG y ECG desde 0,1 Hz hasta 30 kHz con ≤ 2.4 & micro; Ruido del sistema V y > 10 GΩ impedancia de entrada. RHD128A proporciona datos neuronales robustos y escalables por el usuario para acelerar estudios en interfaces cerebro-máquina, neurodegeneración y rehabilitación.
Cinta de correr	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MOVEMÉTRICAS	MOVEMETRICS es una cinta instrumentada de alta precisión para análisis avanzado de la marcha de roedores.