Method Article

Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

DOI:

10.3791/69814

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método para aislar ARN de regiones histológicas definidas de tejido hepático de ratón incrustado en compuesto de paraformaldehído y compuesto de Temperatura Óptima de Corte mediante microdissección por captura láser, permitiendo un análisis dirigido de expresión génica posterior.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microdisección de captura láser (LCM) proporciona acceso espacial a poblaciones celulares específicas dentro de tejidos complejos mediante visualización in situ y aislamiento. Para permitir el análisis transcriptómico de regiones histológicamente definidas en tejido fijo, se presenta un protocolo detallado de MCA para la extracción de ARN de secciones hepáticas de ratón con compuestos de paraformaldehído (PFA) y con Temperatura Óptima de Corte (OCT). El protocolo detalla la identificación y recogida de muestras a microescala (aproximadamente 1.000 células) mediante un flujo de trabajo que abarca fijación de tejidos, deshidratación de sacarosa, incrustación de OCT, criosección, tinción de hematoxilina y captura láser de áreas histológicas objetivo. Con este método, se obtuvo un ARN de alta pureza (A260/A280: 1,9-2,1). El número de integridad del ARN (RIN) fue de 6,7 ± 0,9, reflejando la fragmentación esperada asociada a la fijación de PFA. Sin embargo, la PCR cuantitativa para β-actina arrojó valores de Ct de 17-19, y la secuenciación de ARN realizada mediante preparación de bibliotecas optimizadas para fragmentación generó lecturas de alta calidad, con el >90% de las bases cumpliendo los umbrales Q20 y Q30, confirmando que el ARN es adecuado para análisis sensibles posteriores. Por ello, este protocolo permite un análisis espacial y dirigido de expresión génica al proporcionar ARN de pureza e integridad definidas de regiones histológicas específicas del tejido hepático fijado con PFA.

Introduction

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La adquisición precisa de perfiles de expresión génica espacialmente resueltos es crucial para comprender la heterogeneidad tisular en salud y enfermedad. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) ofrece una alta resolucióncelular 1,2, pero pierde el contexto espacial nativo y puede alterar los perfiles transcripcionales durante la disociacióntisular 3,4. Para tipos celulares que carecen de marcadores específicos identificados públicamente, obtener poblaciones puras mediante clasificación basada en inmunofluorescencia o aislamiento inmunomagnético sigue siendodifícil 5,6. Las tecnologías de transcriptómica espacial como Visium y GeoMx permiten la captura in situ de datos de expresión génica de alto rendimiento, pero su resolución espacial está limitada a nivel de célula única o subcelular 7,8. Por el contrario, la transcriptómica espacial basada en imágenes puede alcanzar una resolución a nivel nanométrico pero tiene un rendimiento limitado de deteccióngénica 9. Esto pone de manifiesto una laguna persistente en el análisis basado en hipótesis de regiones morfológicas específicas.

La microdisección por captura láser (LCM) permite la selección y aislamiento guiada por microscopio de células específicas a partir de secciones de tejido o cultivos celulares vivos basándose en un fenotipo observable. Este enfoque preserva la estructura celular y la información espacial10. Esta técnica se ha aplicado extensamente en la investigación de enfermedades hepáticas para análisis posteriores. Por ejemplo, la LCM se ha utilizado para recoger células epiteliales biliares de biopsias hepáticas y así dilucidar su función inmunoreguladora en la colangitis biliarprimaria 11. Además, se ha utilizado para aislar tejido positivo a γ-glutamiltransferasa (GGT) de modelos experimentales para confirmar la expresión genéticaGgt1 específica de sitio 12. Pero estos estudios se han centrado principalmente en tejidos frescos congelados, que a menudo carecen de anotaciones clínicas o de seguimiento a largoplazo 13. En cambio, los tejidos fijados químicamente ofrecen ventajas para el diagnósticohistopatológico 14. Aunque la secuenciación de ARN basada en LCM (RNA-Seq) se ha aplicado con éxito a especímenes de hígado archivados, a gran escala, fijados en formalina y parafina(FFPE) 15. Sin embargo, falta un protocolo robusto de perfilado de expresión génica basado en LCM, específicamente para muestras a microescala de tejidos hepáticos embebidos compuestos con paraformaldehído (PFA) y compuestos con Temperatura Óptima de Corte (OCT).

Para abordar esta necesidad no cubierta, se optimizó un protocolo integral utilizando criosecciones fijas en PFA y incrustadas en OCT. Este protocolo aborda las limitaciones de los flujos de trabajo FFPE (por ejemplo, procesamiento prolongado y productos químicos agresivos) para aplicaciones sensibles deLCM-ARN 16. En cambio, el proceso de fijación e incrustación de muestras fijadas en PFA y incrustadas en OCT es relativamente más sencillo y flexible, permitiendo la preparación rápida de secciones de alta calidad que preservan tanto la integridad del ARN como la morfología tisular. Además, este protocolo se realiza mediante un sistema LCM láser de ultravioleta (UV). En comparación con los sistemas infrarrojos, el UV-LCM proporciona una resolución de corte más fina y permite la recogida directa y sin contacto, minimizando la contaminación y haciéndolo adecuado para el aislamiento preciso de regiones a microescala de arquitecturas tejidoscomplejas 17,18. Por lo tanto, el valor operativo de este protocolo radica en su capacidad para realizar capturas que preservan la morfología de regiones a microescala (~1.000 células) a partir de secciones hepáticas fijadas con PFA. Produce ARN adecuado para análisis dirigido de expresión génica, permitiendo una correlación directa entre características histopatológicas y perfiles transcriptómicos locales.

Aquí describimos un protocolo para la microdisección por captura láser de tejido a microescala (~1.000 células) a partir de secciones hepáticas de ratón fijadas con PFA e incrustadas en OCT, seguido de la extracción de ARN y el análisis posterior mediante PCR de transcripción inversa cuantitativa y secuenciación de ARN. Estos procedimientos pueden completarse en un plazo de cinco días.

Para guiar a los lectores en la evaluación de la aplicabilidad de este protocolo, se resumen a continuación el alcance y las limitaciones clave. Este protocolo está específicamente optimizado para el muestreo guiado por hipótesis y morfología de regiones histológicas específicas de tejidos fijados en PFA y incrustados en OCT, con una aplicación principal en hígado de ratón. Es adecuado para investigadores que necesitan correlacionar datos transcriptómicos resueltos espacialmente con características histopatológicas precisas preservadas en muestras fijas. El flujo de trabajo es especialmente valioso cuando se trabaja con tejidos fijos archivados o clínicamente anotados donde no hay muestras recién congeladas disponibles. Sin embargo, este protocolo no es ideal para estudios que requieren ARN no fragmentado de alta integridad (por ejemplo, número de integridad del ARN (RIN) > 8), ya que la fragmentación inherente a la fijación química limita su uso en aplicaciones que dependen de transcritos de longitud completa.

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Protocol

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Todos los procedimientos para el manejo y cuidado de animales se realizaron conforme a las directrices éticas y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica del Sur. El método descrito utilizó ratones machos adultos C57BL/6J y se mantuvo con una dieta alta en grasas, alta en azúcar y deficiencia en colina para modelar la esteatohepatitis asociada al metabolismo (MASH). Antes de extraer tejido hepático, los animales eran sacrificados por decapitación.

1. Preparación de la muestra fijada con PFA

  1. Fija muestras frescas de tejido hepático (lóbulos individuales, de 5 mm o menos de grosor) en 30 mL de PFA al 4% frío (recién preparado) a 4 °C durante 24 horas.
    NOTA: Se recomienda perfundir el hígado con solución de solución fisiológica con suero tampón de fosfato (PBS, 1×, normalmente compuesto por 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na₂HPO₄ y 1,8 mM de KH₂PO₄, pH 7,4) a concentración de 1× durante 5 minutos, seguido de una fijación por perfusión con PFA al 4% durante 5 minutos. Alternativamente, el tejido también puede fijarse en una solución de formol al 10%.
    PRECAUCIÓN: El fijador de PFA es tóxico. Todos los residuos de la PFA deben recogerse en un contenedor de residuos químicos designado y debidamente etiquetado, cumpliendo con la normativa institucional y local.
  2. Lava las muestras de tejido fijas 3× veces durante 5 minutos con una solución de PBS 1× libre de RNasa.
  3. Coloque el tejido hepático fijo en un tubo de 50 mL lleno con 50 mL de sacarosa al 30% (recién preparado en PBS estéril de 1×). Mantén las muestras a 4 °C durante 10-12 horas.
  4. Retira las muestras de tejido de la solución de sacarosa. Recorta las muestras para obtener bloques fáciles de manejar (aproximadamente 5 mm × 3 mm × 5 mm), luego incrusta las muestras en un criomold (7 mm × 7 mm × 5 mm) que contiene compuesto OCT.
    NOTA: Ajusta la orientación del tejido con pinzas si es necesario.
  5. Añade compuesto OCT encima para cubrir completamente las muestras de tejido y luego coloca inmediatamente el bloque de tejido incrustado en OCT sobre nitrógeno líquido o hielo seco para congelar rápidamente el compuesto OCT y formar un bloque sólido. Esta rápida congelación es esencial para obtener criosecciones de alta calidad.
    PRECAUCIÓN: Usa guantes resistentes a la criogénica para proteger las manos al manipular materiales criogénicos.
  6. Coloca los bloques incrustados en OCT a -80 °C hasta la criosección.

2. Criosección para microdisección por captura láser

  1. Expone las láminas de membrana de polietileno naftalato (PEN) a la luz UV durante 30 minutos, luego recubre las láminas con 0,1 mg/mL de poli-L-lisina, y después seca al aire. Luego, sella los bordes de la corredera de membrana del PEN con un medio de montaje neutro.
    NOTA: La irradiación UV y el tratamiento con poli-L-lisina de las láminas de membrana PEN pueden mejorar la adhesión de las muestras de tejido a las láminas de membrana PEN. Sellar el perímetro con un medio de montaje neutro previene la infiltración de agua o la formación de burbujas bajo la membrana, lo cual es fundamental para mantener la eficiencia del LCM.
    PRECAUCIÓN: Protege la piel y los ojos de la luz ultravioleta. Lleva gafas de seguridad que bloqueen los rayos UV o una pantalla facial (homologada para protección UV), así como bata de laboratorio, guantes de nitrilo y mangas largas para cubrir la piel expuesta.
  2. Limpia todas las superficies accesibles del criostato y todas las herramientas con un agente de descontaminación RNasa, y limpia el cepillo con etanol al 75%.
    PRECAUCIÓN: Desechar las toallitas y soluciones de etanol usadas conforme a los protocolos locales de salud y seguridad ambiental institucional.
  3. Permite que el instrumento alcance y se estabilice a −20 °C.
  4. Extrae las muestras de hígado a -80 °C y colócalas en el criostato durante un mínimo de 15 minutos.
  5. Aplica una capa fina (2-3 mm) de compuesto OCT sobre la superficie de la etapa de la muestra. Coloca la etapa de la muestra en una repisa de congelación rápida (o en la cámara de criostatos) para presolidificar la capa OCT.
  6. Aplica una pequeña cantidad de OCT sobre la capa de OCT presolidificada en la etapa de muestra. Recupera el bloque de tejido equilibrado (del paso 2.4) y coloca inmediatamente el bloque horizontalmente sobre este OCT, mantenlo en su sitio durante 10-15 segundos para permitir la congelación parcial y la adhesión. Una vez asegurado, montar la etapa de la muestra (con el bloque de tejido adjunto) sobre la cabeza de la muestra criostatada.
  7. Inserta cuidadosamente la hoja entre las placas de sujeción y las placas traseras por un lado del criostato, y luego aprieta la palanca de sujeción.
  8. Ajusta el grosor del criostado a 10 μm.
    NOTA: Ajusta el grosor del corte según sea necesario para el tejido, pero mantén el grosor entre 5-15 μm19.
  9. Corta y monta las secciones directamente sobre las láminas de membrana PEN pretratadas dentro de la cámara criostocática mantenida a -20 °C.
    NOTA: Cada portaobjetos de membrana PEN puede alojar entre 6 y 8 secciones de tejido. Se recomienda que todo el proceso de seccionamiento se complete en un plazo de 1 hora. Limitar el tiempo de sección minimiza la exposición del tejido a condiciones ambientales, reduciendo así los riesgos de degradación del ARN, deshidratación tisular y artefactos morfológicos, que son fundamentales para preservar la calidad del ARN y la integridad histológica para el LCM y el análisis posterior.

3. Tinción de hematoxilina para microdisección por captura láser

  1. Descongela los deslizadores a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos antes de usarlos.
  2. Lava las láminas con PBS 1× libre de RNasa (3 veces, 10 s cada una).
  3. Sumergir las láminas de tejido en la solución filtrada de hematoxilina de Mayer (compuesta por 1,0 g/L de hematoxilina, 0,2 g/L de yodato de sodio, 50 g/L de sulfato de aluminio amonio dodecahidrato, 50 g/L de cloral hidrato y 1,0 g/L de ácido cítrico) durante 5-10 segundos.
    NOTA: Pasa la solución de trabajo de hematoxilina a través de una membrana filtrante de jeringuilla de 0,22 μm antes de teñir.
  4. Lava las láminas con agua sin RNasa (3 veces, 10 s cada una) para eliminar la solución residual de hematoxilina.
  5. Evalúa la calidad de la tinción bajo un microscopio.
    NOTA: Los núcleos teñidos de forma óptima deben parecer nítidos de un azul púrpura sobre un fondo claro. La tinción insuficiente produce núcleos tenues, mientras que la sobretinción oculta los detalles celulares. Solo las diapositivas que cumplan estos criterios óptimos de tinción deben pasar al siguiente paso.
  6. Seca las láminas con papel absorbente y luego seca completamente al aire (10-15 minutos).
    NOTA: Asegúrese de que las láminas estén completamente secas antes de proceder con la LCM. Luego coloca las láminas en los tubos de la centrifugadora de 50 mL y guárdalas temporalmente sobre hielo hasta que se realice la LCM.

4. Microdisección por captura láser

NOTA: La duración del experimento LCM para cada lámina debe mantenerse entre 30 minutos y 1 hora. Se recomienda que todo el experimento de LCM se complete en un plazo de 4 horas. Este límite se establece para minimizar la degradación del ARN en RT y para evitar la evaporación del buffer de recogida en la tapa del tubo, lo cual es crucial para una recuperación eficiente de la muestra. En la práctica, el rendimiento objetivo de aproximadamente 1.000 células de regiones definidas morfológicamente puede cosecharse de forma fiable en un plazo de 4 horas.

  1. Limpia las superficies del banco de laboratorio usando el agente de descontaminación RNasa.
  2. Enciende el controlador y deja que el microscopio complete su proceso de inicialización.
  3. Gira la tecla en sentido horario desde la posición Apagado hasta la Encendida para iniciar el sistema láser.
    NOTA: El sistema láser requiere unos 10 minutos para calentarse.
  4. Enciende el ordenador y abre el software LCM, luego espera a que termine el proceso de inicialización.
  5. Inserta un tubo PCR estéril de 0,2 mL (tubo de recogida) en el dispositivo de recogida.
  6. Añadir 10 μL de un tampón de digestión K de la proteinasa (véase la Tabla de Materiales) a la tapa del tubo de PCR.
    NOTA: El volumen total del buffer de digestión de la proteinasa K se reducirá a 150 μL en un paso posterior (véase el Paso 5.4.1) como parte del procedimiento completo de lisis.
  7. Carga el dispositivo de recogida en el soporte para muestras del microscopio.
  8. Dentro de la ventana de Dispositivo Colector de Cambios , primero seleccione el botón Mover a Punto de Referencia . Después, ajusta el enfoque de la cámara para asegurar una vista clara del punto de referencia. Si es necesario, utiliza las flechas de la ventana para centrar el punto de referencia en el campo de visión.
  9. Carga una sección de tejido en el soporte de la muestra, asegurándote de que la sección esté orientada boca abajo y que la etiqueta esté a la derecha.
  10. Seleccione el 10× lente objetivo, identifique y delinee regiones de interés que presenten características patológicas específicas, como la esteatosis microvesicular (caracterizada por hepatocitos con numerosas vacuolas citoplasmáticas pequeñas y claras y núcleos centrales). Luego, ve al menú Láser y haz clic en el botón Calibrar . Confirma el mensaje en pantalla seleccionando Sí y procede con la calibración.
    NOTA: La lente objetivo del 10× no es exclusiva para la microdisección; Otras lentes de aumento (por ejemplo, 20×) pueden seleccionarse en función de la nitidez de la muestra y la resolución deseada.
  11. En el panel de control láser, se ajustan los parámetros de corte a: Potencia láser = 50, Apertura (diámetro del haz láser) = 5 y Velocidad = 9.
    NOTA: Los valores de parámetros mencionados anteriormente sirven como referencia para el sistema UV-LCM con las muestras de tejido utilizadas en este protocolo. Los usuarios de otros sistemas UV-LCM deberían considerar estos como punto de partida y probablemente tendrán que ajustar la configuración empíricamente. Los ajustes óptimos pueden variar según el tipo de tejido, el grosor de la sección y otros sistemas de LCM.
  12. Dibuja un círculo alrededor del área objetivo usando la barra gráfica. Selecciona la Forma Única, haz clic en el botón Start Cut para realizar LCM y luego coloca el dispositivo de recogida para recoger el tejido disecado.
    NOTA: El desprendimiento exitoso se indica mediante la separación del área seleccionada, a menudo con un hueco visible o movimiento de fragmentos. Para mayor consistencia, recoge de un número predefinido de regiones de tamaño similar por muestra. Si el área objetivo no se desprende automáticamente, haz clic en el botón Mover y Cortar para cortar la muestra manualmente usando el ratón. Para una estimación más precisa del número de celda, el software LCM puede registrar automáticamente el área total de corte. Este valor puede dividirse por el área media de la sección transversal de una celda objetivo para aproximar el número total de celdas capturadas.
    PRECAUCIÓN: Durante el proceso LCM, no mires directamente al haz láser para evitar la exposición a radiación láser.
  13. Opcionalmente, captura una imagen Antes y Después del sitio de disección seleccionando el comando Guardar imagen como en el menú de Archivo . En el cuadro de diálogo, elige una ubicación, nombre de archivo y guarda en un formato preferido (por ejemplo, .tif).
  14. Al recoger el número deseado de celdas, haz clic en el botón Descargar para retirar el colector del escenario. Antes de sellar el tubo PCR, verifica que el volumen de buffer de digestión K de la proteinasa en la cápsula se mantenga en 10 μL; reponer el tampón si se produjo evaporación durante la LCM (véase el Paso 4.6).
    NOTA: Añadir 10 μL del tampón garantiza que la superficie de la tapa esté completamente humedecida, lo que facilita la transferencia eficiente del pellet de tejido microdisecado durante la centrifugación en el paso 4.16.
  15. Haz un vórtice de los tubos de recogida a fondo.
  16. Gira brevemente los tubos de recogida y almacena los tubos de muestra a -80 °C hasta la extracción de ARN.
    NOTA: Repite los pasos 4.5 a 4.16 para la siguiente muestra. El protocolo puede pausarse hasta la extracción de ARN.

5. Extracción total de ARN de muestras microdisecadas

  1. Limpia las superficies del banco de laboratorio usando el agente de descontaminación RNasa.
  2. Transfiere las muestras de LCM del congelador a -80 °C a un baño de hielo. Si se desea, agrupa diferentes lotes de las mismas muestras capturadas.
  3. Incuba los tubos de muestra micro-disecados boca abajo a 42 °C durante 30 minutos.
    NOTA: Esta inversión garantiza que cualquier tejido que quede adherido a la tapa tras una breve centrifugación (Paso 4.16) se libere en el tampón de digestión. Esto garantiza la máxima transferencia de la muestra al buffer antes del ajuste de volumen y la centrifugación a alta velocidad en el Paso 5.4.1.
  4. Aislar ARN total de muestras de LCM utilizando un kit estándar de extracción de ARN optimizado para tejidos fijos (véase la Tabla de Materiales).
    1. Ajusta el volumen en cada tubo de muestra a un final de 150 μL con el buffer de digestión de la proteinasa K (véase la Tabla de Materiales). Centrifuga los tubos a 11.000 × g (1 min) y luego transfiere las muestras a un tubo estéril de 1,5 mL.
    2. Añade 10 μL de proteinasa K (20 mg/mL) por tubo y luego mezcla suavemente las muestras mediante pipeteo repetido. Esto da lugar a un volumen final de 160 μL y una concentración final de proteinasa K de aproximadamente 1,25 mg/mL en la reacción digestiva por muestra.
    3. Realiza una incubación de muestra en dos pasos: primero a 56 °C durante 15 minutos, seguido de 15 minutos a 80 °C. Durante cada incubación, haz un vórtice breve en los tubos cada 5 minutos.
      NOTA: Para un flujo de trabajo óptimo, utiliza dos baños maria precalentados. Si usas un solo baño, haz una pausa tras la incubación a 56 °C: mantén las muestras en RT mientras el baño se calienta a 80 °C y luego procede.
    4. Colocar las muestras durante 3 minutos sobre hielo, seguido de centrifugación a 20.000 × g ( 15 min).
    5. Aspira el sobrenadante clarificado a un tubo nuevo de 1,5 mL, teniendo cuidado de evitar el pellet.
    6. Añadir 16 μL de tampón de incubación de DNasa y 10 μL de enzima DNasa I (2,73 unidades/μL, véase la Tabla de Materiales) a cada muestra. Luego, mezcla bien el contenido invertiendo suavemente los tubos. Esto da como resultado un volumen final de 186 μL y una concentración final de DNasa I de aproximadamente 0,15 unidades/μL en la reacción digestiva por muestra.
    7. Realiza un giro rápido para recoger líquido residual de las paredes del tubo.
    8. Incuba los tubos de muestra en RT durante 15 minutos.
    9. Transfiere 320 μL de tampón de lavado con alto contenido de sal (véase la Tabla de Materiales) a cada muestra y mezcle las muestras a fondo. Esto da como resultado un volumen final de 506 μL por muestra.
    10. Transfiere 720 μL de etanol absoluto a cada tubo, mezcla las muestras pipeteando (sin centrifugación) y procede inmediatamente. Esto da lugar a un volumen final de 1.226 μL por muestra.
      PRECAUCIÓN: El etanol absoluto es altamente inflamable. Recoge etanol de residuos en un contenedor designado para residuos orgánicos no halogenados para su correcta eliminación.
    11. Transfiere 700 μL de la mezcla de la muestra a una columna de purificación (colocada en un tubo de recogida de 2 mL, véase la Tabla de Materiales). Cierra suavemente la tapa y centrifuga a 8.000 × g ( 15 s).
    12. Descarta el flujo del tubo de recogida. Conserva la columna de purificación.
    13. Repite los pasos 5.4.11 a 5.4.12.
    14. Añade 500 μL de tampón de lavado a base de etanol (véase la Tabla de Materiales) a cada tubo de muestra. Cierra suavemente las tapas y centrifuga a 8.000 × g ( 15 s). Luego, descarta el flujo de paso del tubo de recogida.
    15. Repite el Paso 5.4.14 en su totalidad, con la única modificación de aumentar el tiempo de centrifugación a 2 minutos a 8.000 × g.
    16. Transfiere cada columna de purificación a un tubo nuevo de 2,0 mL. Centrifuga a 14.000 × g (5 min) con la tapa abierta, luego descarta el tubo y el líquido residual.
    17. Transfiere cada columna de purificación a un tubo nuevo de 1,5 mL. Pipetear 16 μL de agua libre de RNasa sobre la membrana, cerrar la tapa y centrifugar a 14.000 × g ( 5 min) para facilitar la elución del ARN total.
      NOTA: Mantenga todas las muestras de ARN eluído sobre hielo para los pasos 5.5 y 5.6 para evitar la degradación.
  5. Cuantifica las muestras de ARN y comprueba la pureza (relación A260/A 280 ) mediante espectrofotometría.
    NOTA: La medición de concentración y pureza (relaciónA 260/A 280 ) en este paso, junto con la evaluación de integridad en el Paso 5.6, sirve como el punto de control cuantitativo definitivo para la recuperación exitosa del ARN. Se espera un eluado de ARN claro.
  6. Realizar electroforesis en gel de agarosa con una concentración de gel del 1% y determinar el número de integridad del ARN (RIN) utilizando un sistema bioanalizador para evaluar la calidad del ARN.
  7. Almacena las muestras de ARN a -80 °C hasta realizar qRT-PCR o RNA-Seq.

6. Análisis de ARN

NOTA: la qRT-PCR se describe en los Pasos 6.1 y 6.2, y la RNA-Seq se describe en el Paso 6.3.

  1. Prepara la mezcla de reacción de transcripción inversa y añade 50 ng de ARN total por reacción sobre hielo. Proceda con la reacción de transcripción inversa usando un ciclador térmico según las instrucciones proporcionadas (véase la Tabla de Materiales).
  2. Sobre hielo, prepara mezcla maestra cuantitativa por PCR para β-actina según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de Materiales para secuencias de cebadores). Realizar amplificación por PCR en tiempo real en un sistema cuantitativo de PCR utilizando el protocolo de ciclo recomendado por el fabricante con 10 ng de ADNc por reacción.
  3. Utilizando un kit de cadenas de baja entrada (véase la Tabla de Materiales), construye bibliotecas de RNA-Seq a partir de 50 ng de ARN total. Determinar el tamaño y la concentración de la biblioteca con un sistema bioanalizador (véase la Tabla de Materiales) y luego realizar secuenciación de extremos emparejados en una plataforma de alto rendimiento (véase la Tabla de Materiales).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El flujo de trabajo experimental, que incluye fijación de PFA, deshidratación al 30% de sacarosa, incrustación y criosección de OCT, tinción de hematoxilina, identificación y recogida precisa de la región objetivo (~1.000 células) por LCM, lisis celular, aislamiento de ARN, métricas de control de calidad del ARN y las dos aplicaciones analíticas clave, se describe en la Figura 1. La sección hepática teñida con hematoxilina en la lámina PEN se muestra bajo el...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fortaleza de la MCL radica en su captura precisa e in situ de células o regiones tisulares seleccionadas, facilitando el estudio de áreas específicas dentro de un tejido heterogéneo. Pero su bajo rendimiento de muestras, el proceso que consume mucho tiempo, su alto coste y la necesidad de equipos especializados limitan la aplicación generalizada de esta técnica enlaboratorios 23. En este estudio, se estableció el protocolo LCM-ARN para superar limitaci...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82070589), la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (2022A1515010218) y el Proyecto del Plan de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (206077078001) al profesor Yan Wang. Estamos agradecidos al Centro de Investigación Biomédica de la Universidad Médica del Sur por el apoyo técnico y el acceso al sistema de microdisección por captura láser.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Tubos de pared fina de 0,2 mlAxygenPCR-02-CTubos para la colección de LCM
Tubo centrífugo de 1,5 mLAxygen339653
4% de paraformaldehídoLeageneDF0135
Tubo centrífugo de 50 mLThermoFisher Scientific339653
DEPC (pirocarbonato dietílico)SigmaD-5758
Conjunto digestivo DNasa IQiagen73504Componente del kit FFPE RNeasy incluye la solución de DNase I stock y el buffer DNase Booster
Etanol (100%)Thermo Fisher ScientificBP2818Purificado para biología molecular
Amortiguador de lavado a base de etanolQiagen73504RPE de búfer (componente del kit FFPE RNeasy)
Amortiguador de lavado con alto contenido de salQiagen73504RBC de búfer (componente del kit FFPE RNeasy)
Cuchillas de microtomo de perfil bajoLeica Biosystems819
Mayer' s hematoxilinaLeageneDH0001
Compuesto OCTSakura4583
Portaobjetos recubiertos de membrana PENLeica11505188
Solución salina tamponada con fosfatoLeageneCC0010Libre de DNasa/RNasa
Poli-L-lisinaMacklinP875131S
Buffer de digestión K de la proteinasaQiagen73504PKD de búfer (componente del kit RNeasy FFPE)
Columna de purificaciónQiagen73504Columna de spin RNeasy MinElute (componente del kit RNeasy FFPE)
Mezcla maestra cuantitativa por PCRBiografía de TakaraRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Kit de transcripción inversaQiagen205411Kit de transcripción inversa QuantiNova
Kit de extracción de ARNQiagen73504RNeasy FFPE Kit
Kit de secuenciación de ARN (Baja entrada, bloqueado)Biografía de Takara634412Kit SMARTer de RNA-seq total en cadena - mamífero con entrada pico v2
Agente de descontaminación de RNasaSolarbioSR0040Limpieza
SacarosaMacklinS818049
Animales y Dieta
Ratón: C57BL/6JCentro de Animales de Laboratorio de la provincia de Guangdong03
Especial y Fuerte Beber agua
Dieta alta en grasas y deficiente en colina (Dieta base)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MMacronutrientes: proteína, 14 kcal%; carbohidratos, 26 kcal%; grasa, 60 kcal%
Agua potable con azúcarMacklinN/A (preparado internamente)Se añadió una mezcla de D-glucosa (Macklin, Cat# F87500) y D-fructosa (Macklin, Cat# S818049) al agua potable autoclavada a una concentración final de 42 g/L, con una proporción glucosa-fructosa de 55:45 (p/w)
Ratón
β-actin (Adelante: AGAGGGAATCGTGCGTGAC)Secuenciación BGIPersonalizadoHPLC purificado
β-actin (reverso: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)Secuenciación BGIPersonalizadoHPLC purificado
Equipo
Microtomo criostatoLeica BiosystemsCM3050 S
Sistema de bioanalizadoresAgilentG2939BA
Plataforma de secuenciación de alto rendimientoIllumina; Inc.Sistema NovaSeq 6000
Sistema de microdisección por captura láserLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Sistema de PCR cuantitativaBiosistemas AplicadosSistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5
EspectrofotómetroThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Thermal CyclerBioRadT100
Software
Adobe Illustrator CC 2019 (versión 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (versión 8.3.0)GraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com

References

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