$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
El flujo experimental para evaluar la eficacia de inoculantes microbianos en la mejora de la tolerancia al estrés hídrico en la lechuga romana (Lactuca sativa L. var. Paspartu) se resume en la Figura 1. El protocolo integraba el monitoreo continuo de regímenes precisos de riego con adquisición periódica de datos fisiológicos y térmicos. Se utilizaron dos productos microbianos distintos: (I) consorcio microbiano, un consorcio complejo de 67 cepas que comprenden PGPR, actinomicetos y hongos beneficiosos, diseñado para actuar como un amortiguador fisiológico mediante la colonización radicular y la secreción de exopolisacáridos (EPS); y (II) Trichoderma harzianum, un inoculante de una sola cepa de Trichoderma harzianum destinado a inducir resistencia sistémica y modificar la arquitectura radicular. Los reactivos, equipos y software utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Inoculación microbiana
Se implementó un régimen de inoculación estandarizado para ambos tratamientos microbianos, compuesto por seis aplicaciones empapadas en suelo dirigidas a la rizosfera utilizando micropipetas de alta precisión para simular dosis a escala de campo. La primera fase ocurrió durante la fase de plántulas, a los 5 y 15 días después de la siembra (DAS). A los 30 DAS, las plántulas se trasplantaron en bandejas de cavidades más grandes, realizándose la segunda fase de inoculaciones 1 día después del trasplante (DAT), seguida de aplicaciones sucesivas en 7, 15 y 20 DAT.
Para el consorcio microbiano, las dosis se ajustaron según la fenología vegetal: las dos primeras aplicaciones se aplicaron a 500 g/ha (3 mL/planta), seguidas de una dosis de alta concentración de 2 kg/ha en el trasplante, y concluyeron con tres dosis de mantenimiento de 300 g/ha. De manera similar, T. harzianum se aplicó a 1 L/ha durante las dos primeras etapas, 3 L/ha en el trasplante y 1 L/ha en las tres últimas aplicaciones. Este enfoque por fases fue diseñado para asegurar una colonización radicular robusta y mantener el papel de la población microbiana como amortiguador fisiológico durante los periodos críticos de crecimiento e inducción de estrés.
2. Preparación de cultivos
Las semillas certificadas de lechuga romana (Lactuca sativa L. var. Paspartu) germinaron en bandejas de poliestireno con 311 cavidades (11 mL por cavidad) utilizando un sustrato profesional a base de turba a una profundidad de 1 cm. La germinación se realizó en una cámara bioclimática controlada mantenida en un rango de temperatura de 15 °C a 22 °C y una humedad relativa del 60%–70%. Al alcanzar el 90% de germinación (aproximadamente 3–5 días después de la siembra), las plántulas se trasplantaban en bandejas más grandes con una capacidad de 55 mL de bola de raíces para permitir un desarrollo radicular sin restricciones (Figura 2 y Figura 3). El ensayo se organizó en un diseño completamente aleatorizado (CRD), con 9 unidades experimentales (bandejas) y 20 plántulas por bandeja. Esta configuración estaba estructurada para acomodar una disposición factorial de 3 × 3 (3 tratamientos microbianos × 3 regímenes de riego). Las propiedades físico-químicas detalladas del sustrato y la programación específica de cámarasbioclimáticas 14se proporcionan en la Figura 3, la Tabla Suplementaria 1, la Tabla Suplementaria 2 y la Tabla Suplementaria 3.
Las bandejas experimentales se distribuyeron utilizando una disposición completamente aleatoria dentro de la cámara bioclimática para eliminar los efectos de borde y asegurar una exposición uniforme. La cámara fue programada para simular condiciones dinámicas similares a un campo, utilizando un régimen de alta temperatura para replicar el esfuerzo térmico en campo abierto. Durante la etapa vegetativa, los parámetros ambientales se mantuvieron dentro de un rango variable de humedad relativa, y se proporcionó un fotoperiodo de 9 horas mediante iluminación LED de alta intensidad (ajustada por encima del 50% de la capacidad máxima para asegurar una radiación fotosintética activa adecuada)15. Tras la fase de establecimiento, el programa ambiental se ajustó para reflejar los requisitos crecientes de los tratamientos por déficit hídrico, como se ilustra en las transiciones atmosféricasescalonadas 15 (Figura 4 y Figura 5). Los puntos de ajuste diurnos/nocturnos específicos para temperatura, humedad e intensidad luminosa se detallan en la Tabla Suplementaria 1 y la Tabla Suplementaria 2 para agilizar el protocolo principal.
La estrategia de fertilización fue diseñada para satisfacer los requerimientos fenológicos específicos de la lechuga romana, manteniendo un flujo de nutrientes equilibrado durante todo el ciclo vegetativo. Durante la fase de plántula (12 a 24 DAS), se suministraron nutrientes mediante aplicaciones específicas de Nitrato de Potasio (KNO3), Fosfato de Monopotásio (KH 2PO4) y Nitrato de Calcio (Ca(NO3)2). Para mejorar el establecimiento temprano, se suplementó con un bioestimulante comercial durante los primeros 24días 16.
Desde 26 DAS hasta la evaluación final en 76 DAS, el programa de fertigación pasó a un régimen de mantenimiento donde se eliminó el bioestimulante para aislar los efectos específicos de los inoculantes microbianos. Todas las aplicaciones se calibraron para mantener una conductividad eléctrica (CE) y pH óptimos dentro de la rizosfera. El calendario cronológico completo de concentraciones minerales y los volúmenes específicosde dosificación 16se detallan en la Tabla Suplementaria 3.
3. Tratamiento con microorganismos
Para evaluar la eficacia de las intervenciones biológicas contra el estrés hídrico, se establecieron tres tratamientos distintos: (I) consorcio microbiano, un consorcio microbiano de alta diversidad que comprende 67 cepas beneficiosas, incluyendo Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR), Actinomicetos y hongos; (II) T. harzianum, una formulación especializada de una sola cepa de Trichoderma harzianum; y (III) un Control no inoculado. Estos tratamientos se seleccionaron en función de su potencial para la tolerancia sistémica inducida (IST), principalmente mediante mecanismos como la modificación de la arquitectura radicular, la producción de ACC-desaminasa y la secreción de exopolisacáridos (EPS).
La inoculación siguió un enfoque estratégico por fases. La aplicación inicial (3 mL por planta) se realizó mediante micropipeta de alta precisión directamente en la rizosfera en la segunda etapa verdadera de la hoja para asegurar una colonización temprana de raíces. Las aplicaciones posteriores se calibraron a equivalentes a escala de campo (simulando una densidad de 75.000 plantas/ha). Para T. harzianum se aplicó una concentración de 2 L/ha, mientras que el consorcio microbiano se administró a 1 kg/ha. Estas formulaciones se disolvían en el agua de riego y se aplicaban cada 15 días para mantener una población microbiana estable como amortiguador fisiológico durante todo el ciclovegetativo 17.
4. Diferentes tratamientos de riego
Para evaluar la plasticidad fisiológica y agronómica de L. sativa bajo condiciones hídricas variables, se implementaron tres regímenes de riego basados en la sustitución de la evapotranspiración de cultivos (ETc). El contenido volumétrico de agua se calibró en función de la capacidad de campo (FC) del sustrato para asegurar una inducción precisa de tensiones. Los regímenes se definieron de la siguiente manera: (I) Control/Irrigado en pozo (CC-100% ETc), donde se reponía la evapotranspiración completa; (II) Déficit Hídrico Moderado (75% ETc), diseñado para inducir limitaciones hidráulicas intermedias; y (III) Déficit Hídrico Severo (50% ETc), destinado a generar estrés hídrico crítico. Se administró riego diariamente tras capturar imágenes térmicas con pipetas graduadas para asegurar la reposición precisa del volumen de agua perdido porevapotranspiración 18.
5. Grabación de datos e imágenes
Para evaluar la distribución térmica y el estado del agua de las plantas, se capturaron imágenes térmicas infrarrojas diariamente de lunes a viernes durante todo el periodo experimental. Todas las grabaciones fotográficas se realizaron entre las 12:00 y las 14:00 para estandarizar las mediciones durante el periodo de máxima transpiración e intensidad solar. Es fundamental tomar estas imágenes inmediatamente antes de los tratamientos diarios de riego para registrar el estrés hídrico acumulado que experimentan las plantas durante el ciclo previo de 24 horas. Para la adquisición de imágenes, la cámara térmica infrarroja se conectaba a un dispositivo móvil y mantenía una orientación perpendicular respecto a la parte trasera de las plantas de lechuga a una distancia constante de 60–70 cm. El software estaba configurado con una paleta térmica multicolor en la que los gradientes de temperatura se representan de menor a mayor: empezando por púrpura (el más frío), pasando por azul real, turquesa, verde (punto medio), amarillo, naranja y finalmente rojo (el más caliente). Dentro de la interfaz de software, se seleccionaba manualmente el área específica de la bandeja que contenía el dosel de la planta para capturar los datos térmicos. Esta escala de color sirve como indicador fisiológico: las plantas bien hidratadas presentan temperaturas de dosel más frescas (púrpura/azul) debido a la transpiración activa, mientras que las plantas deshidratadas muestran temperaturas de dosel más altas (naranja/rojo) debido al cierre de los estomas y a la reducción del enfriamiento por evaporación. Posteriormente, estas imágenes de alta resolución se procesaron utilizando la función de medición de tres puntos sobre regiones específicas de interés (ROI) para extraer valores precisos de temperatura del dosel (Tc) para el cálculo del Índice de Estrés Hídrico de Cultivos (CWSI).
Si CWSI es:
0, entonces el cultivo no está bajo estrés hídrico
1 entonces el cultivo está bajo un fuerte estrés hídrico
Donde:
Tc es la temperatura del dosel del cultivo, medida mediante imágenes infrarrojas. Tw es la temperatura del dosel en condiciones que no requieren estrés hídrico. Td es la temperatura del dosel bajo condiciones de máximo estréshídrico 19.
Los indicadores de crecimiento, desarrollo y condición fisiológica de las plantas, como la altura, el número de hojas y la temperatura de las hojas, evaluados mediante termografía infrarroja, se muestran en la Tabla Suplementaria 4 junto con las variables del estudio y las definiciones conceptuales y operativas utilizadas en el experimento. La combinación de estas variables permitió una evaluación exhaustiva del impacto de los tratamientos experimentales en el rendimiento y desarrollo fisiológico de cada planta.
6. Análisis de datos
Se analizaron datos fisiológicos y morfológicos utilizando una ANOVA unidireccional para cada régimen de riego para determinar el efecto de los diferentes tratamientos microbianos. Todos los procedimientos estadísticos se realizaron mediante software estadístico. Antes de realizar el análisis inferencial, se verificaron los requisitos fundamentales para la estadística paramétrica para garantizar la fiabilidad de los resultados. La normalidad de los residuos se confirmó mediante la prueba de Anderson-Darling (p > 0,100), indicando normalidad. Además, se validó la homogeneidad de las varianzas mediante la prueba de Levene (p = 0,989), confirmando una alta homoscedasticidad entre grupos. Dado que se cumplieron ambas suposiciones, se utilizó la prueba post-hoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) para identificar diferencias significativas (p < 0,05) entre las medias del tratamiento. La planta individual se definió como la unidad experimental para todas las evaluaciones estadísticas.
