Method Article

Secuenciación de ARN unicelular para el perfilado de segmentos de colon ganglionar y aganglionar de pacientes con enfermedad de Hirschsprung

DOI:

10.3791/69825

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May 22nd, 2026

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1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un flujo de trabajo de secuenciación de ARN unicelular para analizar la infiltración de células inmunitarias y las diferencias transcripcionales específicas de tipo celular entre segmentos colonísticos ganglionares y aganglionares en la enfermedad de Hirschsprung.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Hirschsprung (HSCR) es un trastorno congénito de motilidad intestinal caracterizado por la ausencia de neuronas entéricas en el intestino distal. En comparación con la secuenciación de ARN a granel, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) permite el perfilado de expresión génica a nivel de célula única, resolviendo la heterogeneidad celular que se oculta en análisis promediados por población. Se estableció un flujo de trabajo estandarizado de SCRNA-seq para caracterizar el paisaje transcripcional de segmentos ganglionares y aganglionares de pacientes con HSCR. Se recogieron tejidos de colon y se realizó tinción de hematoxilina y eosina para identificar regiones ganglionares y aganglionares. Los tejidos se disociaron enzimática y mecánicamente en suspensiones de célula única, seguidas de filtración, evaluación de viabilidad y construcción de bibliotecas de transcriptomas unicelulares. Las bibliotecas que pasaban el control de calidad se secuenciaban y los datos en bruto se procesaban para cuantificación de celdas y filtrado de calidad para eliminar celdas de baja calidad y artefactos técnicos. Tras la normalización y reducción de dimensionalidad, las células se agruparon y anotaron en función de genes marcadores establecidos. Los análisis posteriores compararon la composición de tipos celulares entre tejidos ganglionares y aganglionares e identificaron genes expresados diferencialmente dentro de subconjuntos clave de células inmunitarias. Los resultados revelan diferencias sustanciales en el microambiente inmunitario entre los segmentos ganglionares y aganglionares en HSCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La enfermedad de Hirschsprung (HSCR) es uno de los trastornos congénitos de motilidad intestinal más comunes, con una incidencia de aproximadamente 1 de cada 5.000 nacidos vivos en todoel mundo. La enfermedad surge debido a la incapacidad de las células de la cresta neural entérica (ENCCs) para migrar al intestino distal durante las semanas embrionarias 5–12, lo que resulta en la ausencia de ganglios entéricos en los segmentosafectados 2. El segmento aganglionar presenta contracción espástica persistente y peristaltismo alterado, lo que conduce a dilatación intestinal proximal. Clínicamente, esto se manifiesta como obstrucción funcional, causando estreñimiento, distensión abdominal y vómitos, y puede ser potencialmente mortal en casos graves. La resección quirúrgica del segmento aganglionar sigue siendo el tratamiento principal para la HSCR; Sin embargo, una proporción considerable de los pacientes experimenta complicaciones postoperatorias, incluyendo estreñimiento, enterocolitis y contaminación fecal, que comprometen significativamente la calidadde vida 3. Además, el síndrome de intestino corto (SBS) puede aparecer tras una extensa resección intestinal, lo que resulta en una absorción deteriorada de nutrientes y en un aumento de los desafíos clínicos en la gestión. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos subyacentes de la HSCR y la identificación de nuevos objetivos terapéuticos siguen siendo necesidades clínicas críticas.

En los últimos años, la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) se ha aplicado ampliamente para investigar mecanismos moleculares asociados a enfermedades. A diferencia de la secuenciación convencional de ARN a granel, el scRNA-seq permite el análisis de expresión génica a resolución de célula única, lo que permite identificar la heterogeneidad celular y subpoblaciones raras que se ocultan en análisismasivos. En consecuencia, el scRNA-seq ha surgido como una herramienta poderosa para diseccionar la heterogeneidad celular y la comunicación intercelular, impulsando la investigación en biología ymedicina 5. Este enfoque ha revelado nuevos mecanismos patógenos y dianas terapéuticas en enfermedades complejas, incluyendo Alzheimer6, artritis reumatoide7, cáncer de pulmón8 y diabetestipo 2 9.

En este estudio, se aplicó scRNA-seq para caracterizar el paisaje transcripcional de las células inmunitarias y los patrones de infiltración en tejidos colónicos ganglionares y aganglionares de pacientes con HSCR. El flujo de trabajo constaba de tres pasos principales: preparación y evaluación de calidad de suspensiones unicelulares, construcción de bibliotecas de RNA-seq unicelular 3′ y análisis bioinformático posterior. Las muestras de tejido se conservaron en una solución dedicada de preservación unicelular inmediatamente después de la resección y se disociaron enzimáticamente en suspensiones unicelulares en un plazo de 48 horas. La viabilidad celular superó el 80%, y la concentración celular final se ajustó a 700–1.500 células/μL antes de la preparación de la biblioteca. Se comparó la infiltración de células inmunitarias entre los segmentos ganglionares y aganglionares, y se identificaron subpoblaciones de células inmunitarias que presentaban diferencias transcripcionales pronunciadas. Estos análisis delimitan las alteraciones de las células inmunitarias asociadas con la patología del colon en HSCR.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Zunyi (Número de aprobación: KYLL-2024-030). El estudio cumple con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado (oral y escrito) de todos los participantes y sus tutores. La Tabla 1 presenta la información sobre pacientes con HSCR.

Recoger tejidos de colon, incluidos segmentos ganglionares y aganglionares, de pacientes con HSCR diagnosticados y sometidos a cirugía en el Departamento de Cirugía Pediátrica del Hospital Adscrito de la Universidad Médica de Zunyi. Incluye segmentos ganglionares y aganglionares de dos pacientes masculinos con HSCR. La información clínica detallada se proporciona en la Tabla 1. Todos los reactivos, productos químicos, equipos y software están listados en la Tabla de Materiales.

1. Tinción de hematoxilina y eosina

  1. Recogida y fijación de tejidos
    1. Fijar muestras de tejido intestinal en una solución de fijación de paraformaldehído al 4% durante al menos 24 horas.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y libera vapores de formaldehído. Realiza todos los procedimientos en una campana extractora química y utiliza el equipo de protección individual adecuado.
    2. Recorta los pañuelos a aproximadamente 5 × 5 × 2mm 3 usando un bisturí. Coloca los pañuelos en casetes de inserción y enjuaga bajo agua del grifo corriente durante 24 horas.
      NOTA: Retira los bordes de tejido y prepara bloques con al menos una superficie plana. Si no es uniforme, coloca un papel de seda entre los papeles de filtro después de enjuagar.
  2. Deshidratación graduada por etanol
    1. Sumergir los tejidos secuencialmente en soluciones de etanol: 70% etanol durante la noche, 80% etanol durante 3 horas, 90% etanol durante 2 horas, 95% etanol I durante 2 horas, 95% etanol II durante 1 hora, 100% etanol I durante 1 hora y 100% etanol II durante 30 minutos.
      NOTA: Diluir etanol (≥99,7%) con agua ultrapura a las concentraciones indicadas.
      PRECAUCIÓN: Realiza la manipulación de etanol en una campana extractora química.
    2. Retira la cesta de deshidratación y drena bien entre pasos.
  3. Claro
    1. Transfiere los tejidos al xileno durante 30 segundos para lograr transparencia.
  4. Infiltración y incrustación de parafina
    1. Funde la cera de parafina a 60 °C con un día de antelación. Someter la cera fresca a tres ciclos de congelación-descongelación para eliminar las burbujas. Filtra la parafina derretida a través de papel de filtro después del tercer ciclo.
    2. Infiltra tejidos en cera de parafina pura (cera de parafina I) durante 1 hora.
    3. Infiltra tejidos en la mezcla de parafina (cera de parafina II; cera pura de parafina: cera de abeja = 8:1) durante 2 horas.
      NOTA: Derrite completamente la cera de abeja y filtra antes de usarla.
    4. Vierte cera de parafina II en moldes de incrustación. Coloca los bloques de tejido en posición vertical y plana, inserta etiquetas y deja que se solidifiquen.
  5. Seccionamiento
    1. Recorta los bloques de parafina para obtener superficies lisas sin cortar el tejido.
    2. Monta bloques en un microtomo. Ajusta la orientación y elimina el exceso de parafina. Corta secciones en serie con un grosor de 4 μm. Flota las secciones en un baño maria a 50 °C y transfiere a los deslizadores de cristal.
    3. Desliza en seco en un horno a 60 °C para eliminar la humedad residual.
      NOTA: Secciones secas durante 12–48 horas.
  6. Deparafinización
    1. Realiza incubación secuencial: xileno I (15 min), xileno II (15 min), 100% etanol I (5 min), 100% etanol II (5 min), 90% etanol (5 min), 80% etanol (5 min), 70% etanol (5 min) y agua destilada (5 min).
  7. Tinción de hematoxilina
    1. Mancha secciones con hematoxilina durante 50 segundos.
    2. Enjuaga bajo agua del grifo corriente durante 10 minutos.
  8. Tinción por eosina
    1. Tinte secciones con eosina durante 40 segundos.
  9. Deshidratación
    1. Sumergir secciones secuencialmente en etanol I al 95% (30 s), II al 95% (30 s), 100% etanol I (30 s) y II al 100% (30 s).
  10. Claro
    1. Transfiere las secciones al xileno I durante 10 minutos y al xileno II durante 10 minutos.
  11. Montaje y observación
    1. Añade medio de montaje. Cubre con una cubierta de cristal y elimina las burbujas de aire.
    2. Deja que el medio de montaje se solidifique. Examina secciones bajo un microscopio óptico.

2. Secuenciación de ARN unicelular

  1. Preparación de la suspensión de celda única
    1. Tritura los tejidos intestinales en fragmentos de ~1mm 3 con tijeras.
    2. Incubar fragmentos de tejido en el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco que contienen 1 mg/mL de colagénasa II y 0,1 mg/mL de DNasa I a 37 °C durante 30 minutos con una suave agitación sobre una plataforma de mecedor (60 rpm).
    3. Terminar la digestión añadiendo un volumen igual de DMEM frío que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS).
    4. Filtra la suspensión a través de un colador de celda de 70 μm. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C.
    5. Descarta el sobrenadante y conserva la pastilla celular. Lávate una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA).
    6. Disociar los grupos celulares mediante un pipeteo suave para obtener una suspensión unicelular.
    7. Filtra la suspensión a través de un colador de celda de 40 μm.
    8. Centrifugar a 300 × g durante 5 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante y recoge la bola.
    9. Resuspender células en DMEM que contienen un 10% de FBS y un 1% de penicilina–estreptomicina (P/S).
    10. Determinar la viabilidad y densidad celular usando exclusión de azul de tripán. Utiliza muestras con viabilidad >80% y ajusta la concentración a 700–1.500 células/μL.
      NOTA: Mezcla la suspensión celular con azul de tripán (1:1) y cuenta las células viables usando un hemocitómetro.
  2. Preparación de la biblioteca
    1. Carga aproximadamente 15.000 celdas por tirada para la preparación de la biblioteca.
      NOTA: En microgotas de perlas en emulsión en gel (GEM), el ARNm se hibrida en oligonucleótidos poli(dT) sobre las perlas de gel.
    2. Realizar transcripción inversa y amplificar el ADNc mediante PCR (95 °C durante 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 35 s, 72 °C durante 25 s; extensión final a 72 °C durante 25 s). Utiliza ADNc amplificado para la construcción de bibliotecas de SCRNA-seq 3′.
      NOTA: Durante la síntesis de ADNc se añade un sobresaliente CCC que se empareja con la secuencia de oligonucleótidos de conmutación de plantilla (TSO).
    3. Rompe emulsiones y recupera ADNc de las GEMs.
  3. Control de calidad de la biblioteca y secuenciación
    1. Cuantificar la expresión génica y evaluar la distribución del tamaño de los fragmentos.
    2. Realizar una cuantificación precisa utilizando un instrumento fluorescente qPCR.
      NOTA: Asegúrate de que la biblioteca tenga concentración ≥10 nM.
    3. Bibliotecas de secuencias usando un instrumento de secuenciación.
      NOTA: Estructura de lectura: Lectura 1 (26 pb), Lectura 2 (91 pb), índice i7 (8 pb); Profundidad objetivo ~50.000 lecturas por celda.
  4. Control de calidad de datos
    1. Alinea las lecturas en bruto con la base de datos de referencia. Realiza el recuento UMI y genera una matriz célula por gen.
    2. Importar resultados en formato AnnData (Datos Anotados) para análisis posteriores.
    3. Realiza filtrado de control de calidad basado en UMIs, recuento de genes y lecturas mitocondriales.
      NOTA: Quitar jubones (Scrublet); excluyamos células con <200 o >5.000 genes, total_counts >40.000 o mt_ratio >20%.
  5. Reducción de dimensionalidad y anotación
    1. Normalizar el número de Identificadores Moleculares Únicos (UMI) a 10.000 por célula.
    2. Identifica genes altamente variables.
    3. Realizar análisis de componentes principales (PCA).
    4. Construyamos un grafo k-vecino más cercano.
    5. Realiza incrustación UMAP.
    6. Celdas de agrupamiento usando el algoritmo de Leiden en Scanpy (v1.9.3).
      NOTA: Utiliza sc.pp.neighbors y sc.tl.leiden (resolución = 0,5).
    7. Anotar tipos celulares utilizando una herramienta diseñada para la anotación automatizada y de alta precisión de tipos celulares en datos de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq).
  6. Análisis diferencial
    1. Realizar análisis diferencial de expresión génica en R (v4.2.2) usando Seurat (v4.3.0).
      NOTA: Utiliza la función FindMarkers con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.
    2. Realiza análisis de enriquecimiento GO usando clusterProfiler (v4.8.1) con enrichGO.
      NOTA: Incluye las categorías CC, MF y BP.
    3. Realizar análisis de enriquecimiento de vías KEGG usando clusterProfiler (v4.8.1) con enrichKEGG10.

3. Eliminación de residuos

  1. Recoge por separado los residuos que contienen paraformaldehído y xileno.
  2. Neutraliza las soluciones ácidas cuando sea apropiado o deséchalas como residuos peligrosos.
  3. Sigue las normativas institucionales de salud y seguridad ambiental (EHS).

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tinción de hematoxilina y eosina (HE) (Figura 1) reveló diferencias histológicas claras entre los segmentos ganglionares y aganglionares. En comparación con los segmentos ganglionares, los segmentos aganglionares mostraron una exfoliación mucosa aumentada, una reducción notable de células caliciformes y neuronas submucosas, y límites difusos entre las capas mucosa y muscular. En un subconjunto de secciones, la preservación tisular fue subóptima, con despr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se aplicó la secuenciación de ARN unicelular para perfilar características transcripcionales de tejidos colónicos resecados quirúrgicamente (segmentos ganglionares y aganglionares) de pacientes con enfermedades de Hirschsprung 4,5. Se prestó especial atención a la estrategia de disociación tisular, ya que los parámetros de disociación influyen en la recuperación celular, la representación de tipos celulares y la integridad del AR...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Guizhou (Fundación de Cooperación en Ciencia y Tecnología de Guizhou - ZK - [2024] General 344) (a X.F. Yang) y el Contrato del Proyecto de Ciencia y Tecnología Zunyi (Cooperación en Ciencia y Tecnología) (Cooperación en Ciencia y Tecnología de Zunyi HZ (2023) Nº). (a Y. Qu).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cera de abejaSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Cera de abejaSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Albúmina sérica bovinaThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
Albúmina sérica bovinaThermofisher30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
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Paquete de perfilador de clústerBioconductorv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
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Colagenasa IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Colagenasa IIThermofisher17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Vidrio de cubiertaCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
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Cuchilla desechable de microtomoPlumaS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
Cuchilla desechable de microtomoPlumaS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNasa IThermofisher18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
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Horno de secadoBORUKDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
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Dulbecco' s Eagle Medium ModificadoThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Dulbecco' s Eagle Medium ModificadoThermofisher12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Alcohol etílicoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
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Suero fetal bovinoThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Suero fetal bovinoThermofisherA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Kit de tinción de hematoxilina y eosinaBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0105S
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Ácido clorhídricoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
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Portaobjetos de microscopioCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
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Medio de montajeBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Medio de montajeBeyotimeC0173-100ml  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Microscopio ópticoNikonECLIPSE SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
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Cera de parafina  Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Cera de parafina  Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Solución de fijación con paraformaldehídoBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& código=P0099-3L
Solución de fijación con paraformaldehídoBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& código=P0099-3L
Penicilina– EstreptomicinaThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Penicilina– EstreptomicinaThermofisher15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Solución salina tamponada con fosfatoThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Solución salina tamponada con fosfatoThermofisher10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Papel filtro cualitativoSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Papel filtro cualitativoSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Paquete de software RFundación R para la Computación Estadísticav4.2.2https://www.r-project.org/
Paquete de software RFundación R para la Computación Estadísticav4.2.2https://www.r-project.org/
Microtomo rotatorioLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Microtomo rotatorioLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
ScanpyDesarrollo comunitariov1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
ScanpyDesarrollo comunitariov1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Deshidratador de tejidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Deshidratador de tejidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Máquina de incrustación de tejidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Máquina de incrustación de tejidosWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Trippan blue SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
Trippan blue SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
XilenoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
XilenoSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

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