Visualización de nectarios foliares y brácteos del algodón mediante microscopía digital para mejorar la precisión de la puntuación y la preservación de datos

Summary

Aquí ilustramos procesos paso a paso para fenotipar nectarios foliares y brácteos en plantas de algodón utilizando imágenes generadas por microscopía digital. Este es un método eficaz para marcar los nectarios tanto de las hojas como de las brácteas del algodón, ya que la información puede recopilarse y preservarse en forma de imágenes digitales.

Abstract

Los nectarios son glándulas productoras de néctar distintas, presentes en muchas especies vegetales. Los nectarios presentan estructuras y funciones diversas. En el algodón, la puntuación tradicional del rasgo nectario es propensa a errores, poco fiable y tiene limitaciones, ya que los fenotipos de este rasgo a menudo no son visibles a simple vista. La expresión de rasgos nectarios está controlada por los genes Ne1 y/o Ne2. Además, la expresión de rasgos puede estar influenciada por el entorno y las etapas de crecimiento, lo que subraya la necesidad de métodos de puntuación precisos. En particular, la puntuación fenotípica mediante imágenes digitales da como resultado un método de puntuación más preciso de los nectarios. Este método supera las limitaciones de la puntuación tradicional generando imágenes de alta resolución. Además, facilita la identificación y diferenciación de las diferencias finas en la expresión de rasgos nectarios, preservando estas imágenes digitales para futuras referencias. Este método de puntuación de fenotipado descrito aquí puede adaptarse fácilmente para puntuar otros rasgos de la planta como glándulas, pelos y color. Estos métodos de puntuación pueden adaptarse a otras especies de plantas. En este artículo, explicamos el procedimiento paso a paso sobre cómo recoger muestras del campo o invernadero, diseccionarlas para observarlas mediante microscopía digital y conservar estas imágenes para futuras evaluaciones. Para este método, utilizaremos, por ejemplo, el marcado de muestras foliares y brácteas de plantas algodoneras para diferenciar la presencia de nectarios (completamente desarrollados, reducidos y vestigiales) de la ausencia de nectarios.

Introduction

Las plantas tienen glándulas especializadas llamadas nectarios que sintetizan y producen néctar en la mayoría de las angiospermas, algunos helechos y algunos gimnospermas ^1,2,3,4. Los nectarios se clasifican en tres tipos: mesofiliario, tricomático y epitelial, basándose en el origen de las células que producen^{néctar 5}. Los nectarios del algodón son estomas modificados formados por tricomas glandulares conocidos como papilas y se clasifican como tipo tricomático ^5,6. La mayoría de las especies de Gossypium tienen nectarios; sin embargo, el número de nectarios presentes en este género varía de una especie a^{una especie 7}. Los nectarios florales (FN) son más comunes que los nectarios extraflorales (EFN) en^{las plantas 8}. Estos nectarios pueden encontrarse en cualquier parte de la planta excepto en^{las raíces 1,2}. Por ejemplo, Gossypium hirsutum muestra tanto nectarios florales como^{extraflorales 9}. Las plantas de algodón doméstico muestran tres nectarios florales extra y uno^{floral 10}. Los tres nectarios florales adicionales son foliar, brácteo y circunbracteal¹¹. El nectario foliar es vegetativo y suele estar presente en las hojas del lado inferior de la nervadura central, mientras que los nectarios brácteos y circunbracteales son reproductores y se desarrollan en la base de la bráctea y la superficie abaxial del cáliz. El nectario floral está asociado a una flor, que se desarrolla en la superficie adaxial (superior) del cáliz. Este rasgo nectario está controlado por un único locus^{génico 12}. Estudios de dos grupos de investigación independientes identificaron que el rasgo nectario está controlado por un gen, Ne1 del genoma A o Ne2 del genoma D, mapeado a los cromosomas 12 y 26, respectivamente^{12 y 13}. Este rasgo solo se expresa en una condición de doble recesión, lo que significa que solo una condición homocigota recesiva expresará el rasgo sin nectari.

Además de estos genes, las condiciones ambientales y las etapas de crecimiento juegan un papel en el control del grado de expresión. Por lo tanto, debe haber un método preciso para puntuar este rasgo. El estudio actual se centra en el fenotipado de los nectarios foliares y brácteos en el algodón. Las plantas con nectarios visibles productores de néctar se califican como nectarias, mientras que las que carecen de este rasgo se califican como sin nectar 1,2,3,4. El objetivo principal de este artículo es presentar métodos precisos de puntuación del rasgo nectario utilizando tecnología de microscopía digital. La puntuación tradicional por observación visual directa no puede detectar fácilmente diferencias en la variación de expresión del rasgo néctario in situ a simple vista. Estas sutiles diferencias en la expresión de rasgos nectarios pueden visualizarse mediante microscopía digital. Para ilustrar, en el nectario de hojas de algodón, la rúbrica de puntuación sigue una escala estándar del 1 al 4 en la que 1 representa la ausencia de nectario, 2 representa un saliente en el fenotipo de la vena, 3 representa almohadillas o crestas poco desarrolladas sin néctar, y 4 representa nectarios completamente formados/completos con almohadillas y crestas^{claras 13}. Esta puntuación fenotípica se generó utilizando imágenes digitales de los nectarios foliares [usando imágenes digitales del lado abaxial (inferior) de la nervadura central de la hoja]. En general, la ausencia de nectarios se puntua como 0, pero para significación estadística, el valor 0 no puede usarse y reemplazarse por el valor 1. Por ello, el rango de puntuación de fenotipado se modificó a 1-4 desde la clasificación estandarizada de^{0-4 13}. La rúbrica de puntuación para flores sigue un patrón de puntuación similar de 1 a 4, en el que 1 representa glándulas sin nectari, sin prominentes y sin almohadillas ni crestas, 2 para glándulas ofuscadas en las que los nectarios solo tienen marcas sutiles en almohadillas y sin néctar, 3 para glándulas mal formadas con crestas y/o almohadillas tenues o ausentes, y 4 para nectarios completamente formados con néctar. Este patrón de puntuación muestra 4 para fenotipos nectarios (homocigoto dominante para uno de los genes), 3, 2 para expresión diferencial del rasgo nectario como en heterocigoto, y 1 para sin nectario (homocigoto recesivo para ambos genes).

Del mismo modo, se recogen y diseccionan flores como se describe paso a paso en este artículo para recopilar imágenes digitales que permitan la puntuación de los néctarios brácteos. Este fenotipo puede visualizarse con el microscopio para una puntuación precisa que puede almacenarse en forma de imágenes digitales. En el algodón, los rasgos nectarios no solo atraen a polinizadores, sino también plagas que provocan pérdidas de rendimiento¹⁴. Para resolver este problema, los mejoradores seleccionaron plantas sin características de nectarios (sin nectarios) como alternativa para controlar las plagas de forma natural sin el uso de pesticidas químicos^9,15. El rasgo sin nectari fue originalmente introducido desde Gossypium tomentosum a Gossypium hirsutum (algodón cultivado de tierras altas)⁸. Este método de puntuación es especialmente útil para identificar la segregación de rasgos sin nectari en poblaciones generadas al cruzar padres nectarios con padres sin nectari. Como resultado de estos cruces de padres diversos, F₂ (Segunda Generación Filial) muestra diferentes genotipos de homocigotos nectarios, heterocigotos nectarios y homocigotos sin néctarios. Solo es necesario un gen dominante para la expresión de rasgos nectarios, que sigue la proporción de segregación de 15:1 (9:3:3:1). Por tanto, 1 de cada 16 expresará el rasgo de no nectar en condición recesiva homocigota con genotipo ne1ne1ne2ne2. Sin embargo, los investigadores en programas de reproducción observaron más líneas sin nectari que la proporción esperada de 1 en 16. Esto significa que el rasgo nectario se expresa cuando los genes se expresan como Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. El diverso patrón de expresión de rasgos nectarios en tales poblaciones de nectarios homocigotos (Ne1Ne1Ne2Ne2), heterocigoto nectarizado (Ne1ne1Ne2ne2), y homocigoto sin nectarios (ne1ne1ne2ne2) las plantas pueden puntuarse perfectamente detectando los cambios visualizados en las imágenes digitales^12,13. Como las plantas heterocigotas con nectario reducido pueden no mostrar el rasgo nectárico visualmente y parecerse al rasgo sin nectario, el fenotipado visual plantea desafíos en la selección fiable de este rasgo. Estos problemas se intensifican en la temporada de crecimiento tardía, cuando los nectarios no están presentes en ciertos cultivares de algodón. Las diferencias entre plantas heterocigotas y plantas homocigotas sin nectarios pueden detectarse fácilmente mediante imágenes digitales, ya que las plantas heterocigotas pueden mostrar nectarios pequeños o reducidos, mientras que las homocigotas carecen completamente de este rasgo. Fenotípicamente, la presencia de nectarios se clasifica como nectarizada (homocigota/heterocigota con al menos un gen dominante), la presencia de nectarios pequeños o vestigiales como heterocigotos, y la ausencia de nectarios como plantas homocigotas sin nectarios. La puntuación digital por imagen redujo la puntuación inexacta de las plantas heterocigotas como plantas sin nectari. De manera similar, se prefiere la etapa de floración media cuando hay máxima expresión de rasgos. Por ello, en esta etapa se recogieron muestras de hojas y flores para realizar estos experimentos de puntaje fenotipado y así una puntuación precisa y fiable de los rasgos nectarios. Además, la visualización de rasgos nectarios mediante microscopía digital previene o reduce los falsos positivos en poblaciones sin rasgos nectarios. Esta puntuación fenotípica del rasgo nectario también se está utilizando en estudios de mapeo para identificar marcadores de ADN asociados al rasgo sin nectari que los criadores pueden utilizar para la selección asistida por marcadores (MAS) del rasgo sin nectari¹³. Esta técnica de puntuación puede extenderse a otras especies vegetales además de estudiar otros rasgos como glándulas, pelos y color. En general, la puntuación digital de imágenes no solo resuelve el problema de la puntuación inexacta de rasgos nectarios al proporcionar imágenes de alta resolución, sino que también identifica cambios sutiles en la expresión y almacena las imágenes digitales para su uso futuro. El algodón con rasgo sin nectari puede utilizarse para el biocontrol de plagas, además de responder preguntas de investigación sobre cómo este rasgo favorece las interacciones beneficiosas con insectos.

Protocol

1. Muestreo de hojas en invernadero/campo (Figura 1)

1. Prepara bolsas zip-lock de muestra con identificaciones de muestra. Guarda las bolsas de muestras a temperatura ambiente hasta que se usen.
2. Coloca la nevera en la nevera un día antes de la recogida de la muestra. Coloca una bolsa de hielo del congelador en el fondo de la nevera. Coloca una bandeja de plástico sobre la bolsa de hielo en la nevera.
   NOTA: Cualquier nevera portátil puede usarse para este propósito. Coloca la bolsa de hielo en la nevera y luego una bandeja de plástico (esta separación evita daños por congelación, que ocurre por el contacto directo de la muestra con el hielo) antes de transportar la nevera al lugar de recogida de la muestra.
3. Transporta bolsas de cierre y nevera y etiquetadas al invernadero o campo para recoger muestras. Se programaron pulverizaciones regulares para las plantas de campo para recoger muestras libres de plagas. De manera similar, para las plantas de invernadero, se siguieron ruidos regulares y programas de fertilizantes para plantas sanas.
4. Recoge tejido de hoja joven de plantas individuales de algodón de invernadero o de campo de entre 8 y 12 semanas en bolsas de muestra etiquetadas.
   1. Selecciona la etapa de floración media para la selección de la muestra debido a la mayor expresión del rasgo néctario en esta etapa. Selecciona hojas jóvenes de todas las plantas en esta etapa de desarrollo. Además de la influencia genética y ambiental, el rasgo nectario también está influenciado por la etapa de desarrollo.
   2. Para mantener constante la etapa de desarrollo para la comparación entre diferentes genotipos dentro de la población de F₂ , se recogen muestras foliares de forma uniforme en una etapa para restringir la comparación a esta etapa. Utiliza el tamaño de hoja de 5 a 7 cm como referencia, pero se pueden recoger hojas jóvenes del mismo tamaño de todas las muestras. Las hojas viejas muestran expresión de rasgos nectarios, pero en algunas líneas, el rasgo nectario no se expresará en etapas posteriores de desarrollo. Para evitar esta variación y mejorar la consistencia en la recogida de datos, sigue estas instrucciones al extraer muestras.
5. Recoge el tejido foliar de muestra y colócalo en la bolsa correspondiente. Recoge al menos 2 hojas por muestra de planta.
6. Para el tejido foliar, selecciona hojas sanas de 5 a 7 cm de ancho desde la rama superior de la planta.
   NOTA: Se prefieren hojas jóvenes en las ramas superiores para todas las muestras. Este tipo de recogida de muestras no solo restringe el muestreo a una etapa específica del desarrollo, sino que también reduce los errores en la fenotipificación manteniendo constante el tipo de muestra. Otros parámetros incluyen el acceso fácil y hojas saludables. Se realizará una comparación consistente de datos cuando se recojan varias hojas de planta de la misma etapa de desarrollo para identificar diferencias fenotípicas basadas en genotipos en la población.
7. Coloca cada bolsa de muestra sellada junto con el tejido foliar en la nevera. Transporta la nevera al laboratorio.
8. Transfiere muestras individuales al frigorífico para mantener condiciones de refrigeración de 4 °C. Guarda las muestras en la nevera hasta obtener imágenes digitales del nectario. Las hojas pueden almacenarse hasta 2 días para la imagen digital, pero se prefiere tomar imágenes el mismo día o al día siguiente.
9. Para el cribado de un gran número de muestras de hojas, recóllese muestras en lotes para terminar la imagen en el intervalo de 1 día después de la cosecha. Recoge muestras en tandas de 10-20 o utiliza varios enfriadores para evitar daños tisulares o pliegues en el tejido. Se debe tener cuidado en la recogida de muestras para obtener buenas imágenes digitales.

2. Muestreo de flores en invernadero/campo (Figura 1)

1. Sigue los pasos 1.1 a 1.6. Recoge flores de un invernadero de 8 a 12 semanas o de una planta de algodón cultivada en el campo. Recoge al menos 2 flores por muestra de planta.
   1. Recoge flores normalmente de las ramas superiores cuando las plantas están en la fase de floración media. El rasgo nectario muestra la mayor expresión en la etapa de floración media.
2. Elige flores sanas. Coloca cada bolsa de muestra sellada con al menos dos flores en la nevera. Transporta la nevera al laboratorio.
3. Transfiere muestras individuales al frigorífico para mantener condiciones de refrigeración de 4 °C. Guarda las muestras en la nevera hasta obtener imágenes digitales de los nectarios bracteales.
   1. Procesar muestras el mismo día o al día siguiente tras la recogida. Recoge muestras de flores, guárdalas a 4 °C y procesa los nectarios brácteos el mismo día. Recoge las flores que se produzcan más tarde al día siguiente o más tarde en la semana y realiza la obtención de imágenes digitales de los nectarios brácteos ese mismo día.

3. Montaje inicial del microscopio digital (Figura suplementaria 1)

NOTA: Otros microscopios comparables pueden utilizarse para capturar y almacenar imágenes digitalmente.

1. Enciende el microscopio (VHX 600) y completa los pasos iniciales. Coloca una lámina blanca A4 medio doblada que coincida con el tamaño de la etapa del microscopio.
2. Ajusta la luz en la plataforma/escenario del microscopio usando los pequeños mandos de luz que hay en el mando de la consola.
3. Gira el interruptor de la luz (el pequeño mando de la consola) al máximo para máxima luz y brillo (perilla grande de la consola) a medio-alto girando el mando de la consola en tres cuartas partes.
4. El software integrado VHX 600 muestra opciones para ajustar el objetivo en la pantalla del ordenador. Ajusta el objetivo a 10x de aumento seleccionando la opción de 10x en la pantalla. Enciende el interruptor de encendido del monitor en la pantalla frontal del ordenador y aparecerá el menú principal, que muestra opciones para objetivos y opciones de grabación de imagen.
5. Toma un pequeño número de muestras (de 3 a 5) del frigorífico para la nevera para la imagen digital. Coloca la nevera con las muestras junto al microscopio.
6. Mantén la tabla de cortar y la hoja estéril en el banco cerca del microscopio. Toma una muestra del frigorífico y saca el tejido para proceder con la imagen digital (Figura 1).

4. Imagen digital y puntuación de néctarios foliares (Figura 2)

1. Sigue los pasos 1 y 3. Abre la bolsa zip lock de muestra y coloca la muestra de hojas sobre la tabla de cortar. Corta el pecíolo de la hoja usando una hoja estéril.
   NOTA: Para un uso seguro de las cuchillas, lleva guantes y mantén los bordes afilados de la hoja orientados hacia otro lado de los dedos, colocando el tejido entre los dedos mientras se hacen las incisiones.
2. Transfiere el tejido foliar sobre la lámina blanca precortada colocada en el escenario. Gira el tejido foliar en el centro de la etapa del microscopio con el lado abaxial hacia arriba.
3. Enfoca la nervadura central de la hoja girando suavemente los ajustes gruesos y finos de los botones del microscopio. Sigue ajustando hasta que la imagen no haya desenfoque.
4. Como el nectario está presente en el extremo inferior de la nervadura central, mantenlo centrado donde se observaron las nervaduras centrales y las venas posteriores divergentes. Mantén la hoja centrada en el escenario.
   NOTA: Solo se observa un nectario foliar en el algodón doméstico, mientras que los tipos silvestres muestran tres nectarios, uno en la nervadura central y uno en cada vena lateral a cada lado de la nervadura central (nectarios totales :3).
5. Ajusta los ajustes gruesos y finos del microscopio para mejorar la nitidez de la imagen digital. Haz todos los ajustes de imagen para capturar y guardar la imagen del nectario de la hoja.
   1. Para evitar reflejos de luz en la imagen digital, apaga todas las luces y graba la imagen en la pantalla del ordenador. Apaga todas las luces de la habitación y usa una lámpara de mesa para procesar cada muestra. Una vez completados todos los pasos, apaga la lámpara y deja encendida solo la luz del microscopio y graba la imagen.
6. Guarda la imagen una vez que el programa muestre una ventana que muestra varias opciones para guardar. Guarda la imagen (etiquetando cada imagen) con el número de identificación de la muestra. Puntua la imagen digital del nectario foliar como 1, 2, 3 y 4 según el fenotipo del nectario. Actualiza tu hoja de puntuación para cada ID de muestra.

5. Imagen digital y puntuación del nectario brácteo (Figura 3)

1. Sigue los pasos 2 y 3. Transfiere un pequeño número de muestras de flores (2-3) para obtener imágenes. Saca la muestra de flores de la bolsa zip-lock.
2. Retira las brácteas de la flor usando pinzas o manualmente a mano. Coloca la flor sobre la tabla limpia. Usa una hoja estéril para cortar el tallo de la flor. Utiliza una hoja estéril para hacer una incisión recta a lo largo del borde de las brácteas extraídas.
3. Coloca el tejido boca abajo (con el pecíolo hacia arriba) sobre la lámina blanca precortada colocada sobre el escenario del microscopio.
4. Utiliza ajustes gruesos y finos para mejorar la claridad de la imagen que se muestra en pantalla. Haz todos los ajustes de imagen y haz clic en el botón de grabar en el mando de la consola para capturar la imagen de la hoja.
   1. Haz ajustes de imagen poniendo el pequeño potenciómetro/interruptor de luz al máximo y el botón grande/interruptor de brillo a medio-alto (girando el mando a 3/4^{de éstemo}). Luego, mejora la resolución de la imagen girando los ajustes gruesos y finos del microscopio. Mantén estos ajustes constantes y cambia de muestra hasta que se registren imágenes de todo el conjunto de muestras. Para evitar la reflexión de la luz en la imagen digital, apaga todas las luces y graba la imagen en el ordenador.
5. Luego, el programa muestra una ventana que muestra todas las ubicaciones del ordenador para guardar la imagen. Guarda la imagen digital en el ordenador con el número de identificación de la muestra.
6. Puntuar los nectarios brácteos (Figura suplementaria 2) con 1, 2, 3 y 4 en función del fenotipo observado en las imágenes digitales adquiridas. Actualiza la hoja de puntuación con el ID de la muestra y la puntuación correspondiente para análisis futuros

Results

Se seleccionaron plantas de algodón cultivadas en el campo durante 8 a 12 semanas para este estudio. Se recogieron al menos dos réplicas técnicas para cada planta por tipo de tejido. Se recogen muestras jóvenes saludables de hojas de las ramas superiores con láminas foliares de 5 a 7 cm de longitud. Se recogen muestras de flores sanas de flores abiertas o capullos que se abren el mismo día. Se recogieron muestras de hojas y flores en el campo de diferentes líneas vegetales, y se generaron imágenes digitales para ambos tipos de tejido en el laboratorio utilizando un microscopio (Figura 1). Se siguieron todos los pasos descritos anteriormente en el procedimiento, desde la recogida de la muestra hasta la imagen (como se explica en la Figura 2 y la Figura 3). Los resultados representativos tanto para néctares foliares como brácteos suelen mostrar la ausencia de nectario (1), la presencia de nectario con fenotipos intermedios (2, 3) y un nectario completamente desarrollado que produce néctar (4). Los datos generados en la Figura 4 son las imágenes digitales adquiridas de dos plantas de algodón diferentes (nectariada y sin nectari). Los resultados de la puntuación digital de la superficie abaxial de la hoja (en la parte inferior de la nervadura central) mostraron dos fenotipos con puntuaciones 1 (sin nectarios en la nervadura central) y 4 (con nectario completamente desarrollado con néctar; Figura 4A,B). De manera similar, cuando se analizaron muestras de flores para néctarios brácteos, mostraron dos fenotipos de 1 (sin nectario) y 4 (néctar productor de nectario completamente formado; Figura 4C,D). Idealmente, tanto las hojas como las flores recogidas de la misma planta deben seguir el mismo patrón, lo que significa que la hoja sin nectari y la flor sin nectari deben pertenecer a una sola planta, mientras que la hoja nectária y la flor nectariada deben pertenecer a la misma planta. La Figura 5 se produce recogiendo imágenes digitales tanto de las hojas como de los nectares brácteos de plantas nectarias, a 10x, 20x y 40x, para visualizar claramente los rasgos nectarios. Además, para entender cómo se da esta puntuación en la segregación de poblaciones F₂ de padres de algodón nectario y sin nectari, se recogieron tejidos foliares de una de estas poblaciones y se produjeron imágenes digitales para cada muestra de nectario foliar. Las imágenes digitales seleccionadas de hoja correspondientes al formato estándar de puntuación 1, 2, 3 y 4 están resaltadas en la Figura 6^{y 13}. El patrón común y fácil de identificar es la ausencia de nectario y la presencia de éste. La ausencia de nectario recibe la puntuación más baja, mientras que un nectario completamente desarrollado recibe la puntuación más alta de 4. El rango de puntuaciones entre 1 y 4, que es 2, 3, está poco desarrollado y es menor que los nectarios normales. Este patrón puede observarse en nectarios homocigotos, que son 1 (ausente), heterocigoto como en 2 y 3 scores (nectarios reducidos) y 4 (plenamente desarrollados). Además, se pueden cultivar líneas parentales nectarianas y sin nectar junto con poblaciones para comparar y comprender estas diferencias.

Figura 1: Visión general de los pasos de visualización de nectares foliares y brácteas desde el muestreo hasta la microscopía digital. (A) Seleccionar plantas de algodón en la fase de floración media para la recogida tanto de hojas como de muestras florales. (B) Recoger muestras de hojas del campo para observar los rasgos de néctar en la hoja. (C) Gira la hoja para que el lado abaxial de la hoja quede hacia arriba y observa el rasgo del nectario en la región de la caja negra resaltada. (D) Colocar la hoja en el escenario del microscopio y mantener el enfoque en la región de la caja negra resaltada para registrar imágenes digitales del néctario de la hoja. (E) Recoger flores en la etapa de floración media del campo (A). (F) Hacer una incisión colocando la flor sobre una tabla de cortar e incisar en línea recta en la zona de la caja blanca en dirección a la flecha, separando la base de la flor. (G) Colocar la sección incisa en el escenario del microscopio para obtener imágenes digitales de los nectarios brácteos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Procedimiento paso a paso para la imagen digital y la puntuación de los nectarios foliares en algodón. 1. Recoger material foliar del campo en bolsas de muestra etiquetadas y colocarlas en una nevera 2. Transporta la nevera con las muestras al laboratorio 3. Saca muestras individuales del refrigerador 4. Abre la bolsa individual de muestra y saca la hoja 5. Corta el pecíolo de la hoja manualmente o usa una hoja. 6. Colocar la hoja en el escenario de microscopio preestablecido con el lado abaxial (inferior) hacia arriba 7. Ajusta el zoom a 10x en el programa VHX 600 de la pantalla del ordenador. Ajusta los ajustes gruesos y finos del microscopio para obtener la mejor resolución de la imagen. 8. Observa la pantalla del ordenador para ver si hay ajustes en la imagen observada (ajustar la luz y el brillo controlados por perillas pequeñas y grandes girando estos botones, usar botones finos y gruesos en el microscopio para obtener la mejor resolución de imagen, y apagar otras luces para eliminar reflejos, etc.) en el néctario de la hoja 9. Guarda la imagen digital para puntuar. El círculo de guiones alrededor del nectario en la hoja resalta la región del nectario foliar en las imágenes 8 y 9. Observa los nectarios foliares al microscopio con una ampliación de 10x (100 μm). Solo se observa un nectario de hojas en el algodón doméstico (como se observa en esta imagen). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Procedimiento paso a paso para la imagen digital y la puntuación de los nectarios brácteos en algodón. 1. Recoger muestras de flores del campo en las bolsas etiquetadas y guardarlas en la nevera 2. Saca una muestra del disipador 3. Saca una flor 4. Quita las brácteas manualmente cortándolas lejos de la flor 5. Realizar una incisión con una hoja estéril cortando a lo largo del borde bratecteal en línea recta (cuadro blanco mostrado en la Figura 1 antes de pasar a la imagen digital de los nectarios brácteos) 6. Gira la sección 7 incisa. Coloca la sección incisa con el lado del pecíolo hacia arriba sobre el escenario del microscopio etapa 8. Haz ajustes de luz usando los interruptores de luz y brillo en la consola conectada al microscopio. Utiliza ajustes gruesos y finos en el microscopio para recoger imágenes con buena resolución. Todas las imágenes se observan al microscopio con una magnificación de 10x (100 μm). Recoge imágenes digitales para marcar los nectarios bratéales. Los círculos en las imágenes digitales del nectario brácteo resaltan la presencia de nectario, y hay 3 nectarios brácteos en el algodón doméstico. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Imágenes digitales de néctario de hojas de algodón y nectario brácteo. (A) Hoja con nectario; (B) Hoja sin néctario; (C) Flor que muestra 3 nectarios brácteos, y (D) Flor que no muestra nectarios brácteos. Observa tanto los nectarios de hojas como de flores bajo un microscopio a un aumento de 10x (100 μm). Los círculos de guion muestran la presencia y ausencia de nectario en los néctarios foliares y bracteales. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Los nectarios foliares y brácteos se ampliaron a 10x, 20x y 40x para una identificación clara de los nectarios en imágenes digitales. (A) Recoger muestras de hojas para observar el rasgo nectario en la nervadura central. (B) Observar el néctario foliar en la nervadura central bajo el microscopio a una magnificación de 10x. (C) Observar el néctario de la hoja en la nervadura central bajo el microscopio a una ampliación de 20x. (D) Observar el nectario de la hoja en la nervadura central bajo el microscopio a una ampliación de 40x. (E) Incisión en la sección floral para los néctarios brácteos. (F) Observar los nectarios brácteos bajo el microscopio a un aumento de 10 veces. (G) Observar nectarios brácteos bajo el microscopio a 20x de aumento. (H) Observar los nectarios brácteos al microscopio a una ampliación de 40x. Las barras de escala en cada imagen representan la ampliación a la que se tomaron las imágenes del nectario foliar o del nectario brácteo (como se muestra aquí como 10x, 20x y 40x). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Patrón estándar de puntuación del nectario foliar siguiendo los patrones 1, 2, 3 y 4. (A) Muestra foliar sin nectario resaltado en los círculos discontinuos (Puntuación 1 por ausencia de nectario). (B) El nectario de hoja pequeña observado muestra un patrón de una de las condiciones heterocigotas (imagen circular discontinua del nectario puntuado como 2). (C) Nectario foliar con puntuación 3, otro patrón del heterocigoto. (D) Nectarios completamente formados con una puntuación de 4. La escala 10x representa la ampliación a la que se tomaron las imágenes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Nectario foliar y nectarios brácteos sin usar microscopio. La figura muestra cómo aparecen los nectarios con la puntuación tradicional. Esta cifra ha sido adaptada de¹³. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 8: Posibles genotipos de la población La figura muestra los genotipos de las poblaciones F₂ resultantes de un cruce de padres diversos, nectarizados y sin nectari. Esta tabla ha sido adaptada de¹³. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Montaje de microscopio digital. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Diferente número de nectarios brácteos observados. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Los nectarios son tricomas glandulares especializados que producen néctar en las plantas para una polinización cruzada exitosa. Tanto los nectarios vegetativos como reproductivos están presentes en las plantas. El género Gossypium (algodón) tiene más de 50 especies, y la mayoría de ellas contiene¹⁶ nectarios foliares. Sin embargo, este rasgo en el algodón también atrae plagas, lo que provoca pérdidas adicionales de rendimiento¹⁷. Los criadores seleccionaron rasgos naturales sin nectarios (ausencia de nectarios) descubiertos por primera vez en G. tomentosum para resolver este problema. Por esta razón, introdujeron este rasgo sin nectari en algodón cultivado de tierras^{altas 17}. Finalmente, se generaron varias poblaciones seleccionando líneas nectarias y sin nectari como progenitores. Como las poblaciones homocigotas sin nectarios y heterocigotos no muestran diferencias al observarse a simple vista, es necesario disponer de una herramienta especial para diferenciar estas plantas. Por lo tanto, este método de puntuación por microscopía digital, a diferencia de la puntuación tradicional (como se muestra en la Figura 7), no solo visualiza la reducción de nectarios, sino que también previene la puntuación inexacta de plantas heterocigotas sin nectarios como plantas homocigotas.

La puntuación fenotípica mediante imágenes digitales depende de varios factores clave, como el momento específico de recogida de la muestra, la selección de la muestra, el uso de una escala estándar de puntuación para néctarios foliares y bracteales, el posible genotipo y cómo se pueden interpretar los datos de puntuación para aplicaciones posteriores. En primer lugar, es importante recoger hojas y flores durante la temporada de crecimiento, cuando la secreción nectaria es más alta, generalmente a mitad de la floración en julio. En segundo lugar, la selección de hojas o flores en el tamaño y la etapa adecuados juega un papel fundamental en la puntuación fenotípica. Para las hojas, se preferían ramas superiores con láminas de 5 a 7 cm de largo para la marcatura de los néctaris foliares. De manera similar, para la puntuación de nectarios brácteos, se eligieron flores sanas de las ramas superiores. La selección de muestras en etapas específicas del desarrollo ayudará, incluso al comparar todas las plantas dentro de una población excluyendo expresiones de rasgos dependientes de la etapa de desarrollo (como se muestra en la Figura 8). Para comprobar si la puntuación es repetible, se generaron imágenes digitales para al menos dos muestras por tejido y planta. Recopilar múltiples réplicas de la misma planta ayuda a una recogida de datos consistente.

La posible limitación del método es mantener las plantas libres de plagas hasta la recogida de la muestra. Las zonas infestadas por plagas pueden identificarse por parches de tejidos o huevos depositados en los tejidos o por daños en las regiones nectarias con zonas negras sin apariencia visual de nectario debido a su consumo por pulgones u otros insectos. Esto se observó durante el cribado de cientos de muestras. En estos casos, se recogieron hojas y flores sanas y se analizaron para obtener datos consistentes de esas muestras. Esto se puede solucionar manteniendo horarios regulares de control de plagas y suplementando con fertilizante para conseguir plantas sanas. Seguir todos los pasos críticos descritos ayudará a solucionar problemas para la puntuación fenotípica.

Esta técnica tiene varias aplicaciones, como el mapeo para identificar marcadores de ADN que ayudan a los mejoradores a identificar genotipos para la selección asistida por marcadores. Esta puntuación fenotípica requiere confirmación a partir de marcadores de ADN debido a las influencias ambientales y de la etapa de desarrollo, además de los genes que controlan este rasgo. Por tanto, fenotipar este rasgo mediante microscopía digital será un punto de partida para reducir un gran número de plantas de varias poblaciones a un pequeño número de líneas sospechosas de falta de nectario. Utilizando marcadores de ADN, estas líneas se validan aún más para su uso en programas de mejoramiento mejorado que desarrollen resistencia a enfermedades mediada por rasgos sin nectari en variedades recién desarrolladas. Este método también puede ayudar a los investigadores a comprender el papel del rasgo néctario en las plantas y las interacciones beneficiosas con insectos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio digital	Keyence VHX	VHX 600	Se pueden utilizar otros microscopios
Tabla de cortar Farberware	Farberware	Modelo nº 78892-10	14''L x 11''' Ancho X 0,5''Th, se puede usar cualquier marca, esta está disponible en amazon.com
Igloos Laguna pequeña nevera de 9 cuartos	Iglú	Número de pieza 00043567	Se puede usar cualquier marca o tamaño según la necesidad del proyecto
Bolsas de plástico (400 piezas), 3 x 4 pulgadas	Marca Aubeco	NA	4''L x 3''' Ancho x 0,01''H, se puede usar cualquier marca, prefieren plásticos transparentes
Single y nbsp; Cuchillas de afeitar de filo, pack de 100	Weupe	NA	Se puede usar cualquier marca, esta está disponible en amazon.com