Estandarización biológica de la biofabricación humana basada en ASC para constructos tisulares reproducibles a escala macroeconómica

Resumen

Este estudio presenta un flujo de trabajo de biofabricación reproducible utilizando esferoides de células madre derivadas del adiposo y andamios GelMA impresos en 3D. Demuestra métricas de control espacial, capacidad de fusión y control de calidad, lo que da lugar a constructos de tejido a gran escala trasplantables con posibles aplicaciones en medicina regenerativa.

Resumen

La falta de protocolos estandarizados entre laboratorios supone una barrera significativa para la comparabilidad de los resultados experimentales y la transferencia eficiente de tecnologías de biofabricación. La rigurosa estandarización biológica no solo mejora la reproducibilidad, sino que también facilita la alineación con los marcos regulatorios nacionales e internacionales, que son esenciales para la traducción clínica de las estrategias de ingeniería de tejidos. Este estudio introduce un flujo de trabajo estandarizado de biofabricación que comprende el cultivo monocapa de hADSCs, formación de esferoides, impresión 3D de andamios de Gelatina Metacriloiloida (GelMA) y bioensamblaje de esferoides. Se integraron métricas de control de calidad para garantizar la reproducibilidad. El andamiaje GelMA impreso en 3D fue diseñado con dos poros centrales, cada uno capaz de albergar cientos de esferoides. La fidelidad de impresión se confirmó comparando las dimensiones del andamiaje con el modelo CAD, con desviaciones menores y no significativas. Los hADSC formaron esferoides uniformes en 24 horas en micromoldes de agarosa. Cuando se siembran en poros de andamiaje, los esferoides sufrieron fusión continua durante 72 horas, formando construcciones a escala macro confirmadas por imágenes confocales. El diseño del andamio y la precisión en la impresión aseguraban soporte estructural, mientras que la uniformidad de los esferoides permitía la formación predecible del constructo. La fusión de esferoides dentro de los poros del andamiaje dio lugar a constructos tisulares adecuados para el trasplante, con o sin andamiaje, lo que pone de manifiesto la versatilidad de este enfoque de bioensamblaje. Los hallazgos subrayan el papel fundamental de la estandarización biológica en el avance de metodologías reproducibles para la biofabricación de constructos de tejido vivo, con prometedoras implicaciones para futuras aplicaciones clínicas en medicina regenerativa.

Introducción

El bioensamblaje y la bioimpresión son enfoques complementarios de biofabricación en ingeniería de tejidos que se centran en la construcción de tejidos y órganos complejos a gran escala utilizando tecnologías^{automatizadas} 1,2,3,4.

Los esferoides se incorporaron a la biofabricación como bloques de construcción principalmente para enfoques de^{bioensamblaje 5}. Los esferoides se consideran microtejidos que reproducen las interacciones entre las células y el microambiente tisular circundante in vivo. Entre las fuentes celulares utilizadas para la formación de esferoides, las células madre derivadas de la adiposa (ADSCs) destacan por su facilidad de aislamiento, mantenimiento a largo plazo del cultivo y potencial^{de diferenciación 6,7,8}.

Debido a su capacidad intrínseca para formar agregados más grandes, los esferoides pueden generar construcciones tisulares más complejas cuando se someten a enfoques de bioensamblaje. Esta organización impulsada por la fusión mejora el potencial regenerativo y de diferenciación de los esferoides de células^{madre 9,10}.

El bioensamblaje esferoide puede ser soportado o incluso guiado por biomateriales¹¹, lo que hace que esta estrategia sea adecuada para la biofabricación escalable y^{automatizada 12,13.}

Las estrategias de biofabricación existentes pueden categorizarse en términos generales en enfoques de ensamblaje de esferoides sin andamios y sistemas de bioimpresión embebidos^{en hidrogel 2,5,14}. Los métodos sin andamiaje dependen exclusivamente del autoensamblaje celular espontáneo y la fusión interesferoide, aprovechando interacciones intrínsecas célula-célula. Sin embargo, al no tener orientación arquitectónica externa ni confinamiento geométrico, estos enfoques presentan un control espacial reducido y una menor predictibilidad^{estructural 5,15}. En contraste, los enfoques de encapsulación basados en hidrogel incrustan células dentro de matrices de volumen para proporcionar soporte estructural y arquitectura^{predefinida 16,17}, lo que puede restringir parcialmente el contacto directo célula-célula durante las primeras fases de fusión e influir en la dinámica migratoria^{celular 18}. En este marco, biomateriales imprimibles como la Gelatina Metacriloiloida (GelMA) presentan motivos de adhesión celular y pueden funcionar como andamios para facilitar el bioensamblaje^{esferoide 19}. Se hipotetiza que un andamiaje GelMA impreso en 3D proporciona confinamiento geométrico y guía espacial para los esferoides, promoviendo así la formación controlada de tejidos mediante fusión en estructuras más grandes y estructuralmente definidas. Este enfoque pretende mejorar el control espacial y la reproducibilidad estructural durante el bioensamblaje esferoide combinando la organización guiada por andamios con fusión esferoide dentro de una arquitectura hidrogel definida. Sin embargo, el flujo de trabajo actual se centra en la estandarización de procesos y los parámetros de biofabricación estructural, y no aborda la maduración a largo plazo de tejidos, la diferenciación funcional ni la producción automatizada a gran escala.

La estandarización biológica es esencial no solo para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad, sino también para preservar la integridad funcional de los tejidos^{biofabricados 19,20}. Por lo tanto, el control preciso de los parámetros de ingeniería, geométricos y estructurales es fundamental, ya que estos factores influyen directamente en el rendimiento biológico, incluyendo la función y maduración^{tisular 5,21}. Se presenta un flujo de trabajo de biofabricación estandarizado y reproducible, que abarca los siguientes pasos clave: (1) cultivo de monocapas ASC; (2) formación de esferoides ASC; (3) impresión 3D del andamiaje GelMA; y (4) bioensamblaje esferoide (Figura 1). Dentro de este flujo de trabajo, se establecieron métricas objetivas de control de calidad, incluyendo uniformidad y esfericidad de esferoides, fidelidad de impresión e integridad de la forma del andamio.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de micromoldes de agarosa y fabricación de andamios impresos en 3D con GelMA

1. Producción del micromolde de agarosa al 2% en solución de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% (véase Figura 2A)
   NOTA: Todos los residuos químicos deben ser manipulados y eliminados conforme a las normativas institucionales de seguridad química y las directrices sobre residuos peligrosos.
   1. Prepara una solución de NaCl al 0,9% en agua ultrapura y autoclave durante 30 minutos a 121 °C. Manténganse en condiciones estériles hasta su uso.
   2. Diluye 1 g de agarosa ultrapura estéril en 50 mL de solución de NaCl al 0,9%. Homogeneizar y despolimerizar la agarosa en un microondas a intervalos de 10 s durante 3–5 ciclos, hasta que esté completamente disuelta.
   3. En un armario de seguridad biológica, coloca un molde de silicona disponible comercialmente que contenga 81 huecos circulares sobre gasas estériles.
   4. Deposita cuidadosamente 600 μL de agarosa en el centro del molde de silicona y déjalo reposar durante 40 minutos para asegurar una polimerización completa.
   5. Desmolad cuidadosamente el micromolde de agarosa totalmente polimerizado y transfiéralo a un pozo de una placa microtitulada de 12 pozos.
   6. Ajusta la posición del micromolde de agarosa y fijalo en el fondo del pozo llenándolo con 600 μL de agarosa.
   7. Preincuba el micromolde incubándolo con la glucosa media baja modificada de Dulbecco (DMEM, 2 mL/pozo) durante 15 minutos. Repita este procedimiento dos veces y, en la tercera incubación, sustituyal por el medio de cultivo tridimensional (3D), compuesto por DMEM suplementado con ácido ascórbico (50 μg/mL), alpómina sérica humana (1,25 μg/mL), penicilina-estreptomicina (PS, 1×, de una solución 100×) y suplemento ITS (1×, de una solución 100×).
      NOTA: El medio de cultivo 3D se diferencia del medio de expansión monocapa por la ausencia de Suero Bovino Fetal (FBS) y la inclusión de suplementos definidos que promueven la interacción célula-célula y el soporte de la matriz extracelular, favoreciendo un adecuado autoensamblaje y estabilización de los esferoides. Si la producción de moho y el placado celular se realizan en días diferentes, el procedimiento puede pausarse tras la segunda incubación DMEM, y los moldes deben almacenarse en condiciones estériles en una incubadora humidificada a 37 °C durante hasta 5 días. La tercera incubación con medio de cultivo 3D debe realizarse solo el día del emplatado. Antes de sembrar las células, elimina completamente el medio tanto del pozo como del micromolde.
2. Preparación del hidrogel de Gelatina Metacriloiloida (GelMA)
   NOTA: Todo el procedimiento debe realizarse en la oscuridad, ya que los reactivos son fotosensibles. En este estudio se utilizaron GelMA (fuerza del gel 300 g Bloom, grado de sustitución 60%) y el fotoiniciador fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP). Para preparar 10 mL de una solución de GelMA al 10% p/v que contenga 0,5% p/v de LAP:
   1. Disuelva 50 mg de polvo LAP en 1 mL de DMEM, mezclando suavemente con una pipeta hasta obtener una solución clara y homogénea.
   2. Transfiere la solución LAP a un tubo centrífuga que contenga 9 mL de DMEM y mezcle bien.
   3. En un armario de seguridad biológica, esteriliza la solución resultante mediante filtración a través de un filtro de 0,22 μm.
   4. Añadir 1 g de GelMA a la solución y homogeneizar mediante agitación magnética a 50 °C durante aproximadamente 3 horas, o hasta obtener una solución clara y homogénea. Sujeta el matraz frente a la luz para asegurarte de que la solución esté libre de partículas visibles y turbidez.
   5. Carga el hidrogel resultante en una jeringuilla de 10 mL para impresión posterior o, si no se usa inmediatamente, guárdalo a 2–8 °C, protegido de la luz, hasta su uso.
      NOTA: Las soluciones GelMA y LAP se utilizaron aproximadamente 24 horas después de la preparación. No se recomienda almacenar esta solución durante mucho tiempo. Tanto los polvos GelMA como LAP deben almacenarse a 2–8 °C, según las instrucciones del fabricante. El fotoiniciador LAP está clasificado como no peligroso según normas como ABNT NBR 14725 y el Reglamento (CE) nº 1272/2008. Sin embargo, el fabricante recomienda usar equipos de protección individual para prevenir la irritación respiratoria, cutánea y ocular. Se recomienda el uso de gafas de seguridad probadas y aprobadas conforme a las normas gubernamentales pertinentes, como NIOSH (Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional - EE. UU.) o EN 166 (UE), así como guantes de caucho nitrilo con un grosor mínimo de 0,11 mm. La protección respiratoria solo es necesaria cuando se genera polvo. Las recomendaciones del fabricante respecto a la protección respiratoria con filtro se basan en normas como DIN EN 143, DIN EN 14387 y otras normas complementarias relacionadas con el sistema específico de protección respiratoria utilizado. El fabricante recomienda usar un filtro tipo P1.
3. Diseño de modelos 3D, segmentado y generación del archivo G-code
   NOTA: El modelo de andamiaje 3D fue diseñado utilizando el software de diseño asistido por ordenador (CAD) en línea Tinkercad. Para este protocolo, se generó un andamiaje cilíndrico con un diámetro de 15 mm, un grosor de fondo de 1 mm y dos poros circulares, cada uno con un diámetro de 5,50 mm y una profundidad de 2 mm.
   1. Una vez que el diseño del modelo 3D esté completado, expórtalo como un archivo *.stl (Archivo Suplementario 1).
   2. Abre el software Repetier-Host V2.3.2, que se usará para cortar el modelo diseñado.
   3. En la pestaña "Slicer", selecciona la opción de slicer deseada. En este estudio se utilizó el CuraEngine .
   4. Configura el perfil de parámetros apropiado. En esta obra, velocidad 10 mm/s; Altura de la capa 0,2 mm; Patrón de relleno: Grid; Se usaron toberas de diámetro 0,41 mm.
   5. Carga el archivo *.stl del modelo 3D que se va a imprimir.
   6. En la pestaña "Slicer", selecciona la configuración creada previamente.
   7. Haz clic en "Cortar con CuraEngine". El modelo 3D cortado se visualizará entonces en la interfaz de software.
   8. Haz clic en "Guardar en archivo" para guardar el archivo G-code en la ubicación deseada.
4. Impresión 3D de andamios de hidrogel de Gelatina Metacriloiloida (GelMA) para bioensamblaje de esferoides
   NOTA: La impresión 3D debe realizarse en condiciones estériles. Por lo tanto, antes de comenzar el proceso de impresión, comprueba que el armario de seguridad biológica que alberga la impresora esté encendido y que el flujo de aire funcione correctamente. Confirma que la altura del cristal de protección del armario es la misma que la marca del sensor del equipo.
   1. Quita los seguros de seguridad de la bioimpresora.
   2. Retira la placa de cristal de la cama de impresión soltando los clips metálicos.
   3. Coloca una guía acrílica de forma adecuada para soportar la fijación de la placa de cultivo a la plataforma de impresión, usando los clips metálicos.
   4. Conecta la impresora a la fuente de alimentación. Cabe señalar que este equipo soporta doble tensión (110/220 V).
   5. Conecta el cable USB de la impresora al ordenador.
   6. Pulsa el botón de encendido/apagado para encender la impresora.
   7. Abre el software Repetier-Host V2.3.2, que se usará para ver el modelo 3D e imprimir.
   8. Haz clic en la opción "Conectar" en la interfaz del software.
   9. Usando el control manual por software, selecciona el extrusor (1 o 2) y envía el cabezal de impresión a la posición de inicio (X = 0, Y = 0, Z = 0).
   10. Ajusta el extrusor seleccionado para que la jeringuilla encaje correctamente usando la herramienta adecuada del control manual en Repetier.
   11. Inserta cuidadosamente la jeringuilla en el extrusor, ya cargado con hidrogel y conectado a una boquilla de extrusión (en este estudio usamos una boquilla cónica de polipropileno con un diámetro interno de 0,41 mm).
   12. Encajaría la placa de cultivo en la guía acrílica unida a la cama de impresión.
   13. Ajusta la posición de inicio Z (Z = 0) usando el tornillo de tope Z situado en el lado izquierdo de la bioimpresora. Es decir, establecer la distancia deseada entre la boquilla de extrusión y la superficie de impresión. Idealmente, la boquilla debería tocar ligeramente el sustrato, que en este estudio era la placa de cultivo.
   14. Devuelve el cabezal de impresión a la posición de origen.
   15. Carga el archivo G-code generado previamente.
   16. Utilizando la herramienta de control manual adecuada del software, extruye parte del hidrogel de la jeringuilla para asegurar el flujo del material a través de la boquilla.
   17. Empieza el proceso de impresión.
   18. Después de la impresión, realiza el fotocruzado del andamiaje resultante utilizando el sistema de luz ultravioleta de la bioimpresora 3D, equipado con dos LEDs a 395-400 nm. Expone el andamio a la luz ultravioleta durante 5 minutos (intensidad luminosa de 20 mW/^cm2).
   19. Utiliza la misma solución de agarosa despolimerizada al 2% que se usa para fabricar los micromoldes y así fijar los andamios impresos en 3D a los pozos de una placa de cultivo de 12 pozos. Es necesario asegurar los andamios al fondo de los pozos para proporcionar mayor estabilidad y evitar desplazamientos durante la siembra de esferoides y durante todo el periodo de cultivo.
       NOTA: Al realizar el paso 4.16, comprueba si el hidrogel forma un filamento continuo durante la extrusión. Normalmente, la solución de gelatina se carga en la jeringuilla mientras aún está en estado líquido (aproximadamente 37 °C). En pocos minutos a temperatura ambiente (22–25 °C), este biomaterial comienza a transformarse en una consistencia similar a un gel. El material no debe gotear durante la extrusión, ya que esto afectará negativamente a la calidad de impresión. La formación continua de filamento durante la extrusión indica que el hidrogel ha alcanzado una consistencia óptima para la impresión. La solución de GelMA y LAP diluida en DMEM presenta una coloración ligeramente anaranjada. Tras la fotocruz inducida por UV, se observa comúnmente un cambio de color, con el material volviéndose blanquecino o translúcido, como se muestra en la Figura 3D,E. Al operar el sistema UV, las gafas de seguridad son obligatorias para garantizar una protección ocular adecuada contra la radiación ultravioleta.
5. Análisis de fidelidad de impresión
   NOTA: El análisis de fidelidad de la impresión 3D de los andamios GelMA considera los siguientes parámetros: diámetro del andamio, diámetro de los poros y grosor del andamio. Se utilizó el software ImageJ Versión 1.54 para realizar las mediciones.
   1. Primero, capturar imágenes de los andamios observados con un estereomicroscopio. Usa una regla o un calibre como referencia.
   2. Antes de analizar las imágenes, calibra y ajusta la escala en ImageJ para realizar las mediciones.
   3. Utiliza la herramienta de línea recta para realizar las mediciones.
   4. Dado que tanto la forma del andamio como de los poros son circulares, se utiliza la media aritmética del andamiaje y los diámetros de los poros para el análisis estadístico.
   5. Para el análisis de fidelidad de impresión, compare las mediciones obtenidas por ImageJ de los andamios impresos con los valores definidos en el modelo 3D generado por Tinkercad.
      NOTA: El grosor medido del andamiaje impreso se compara con la suma de los valores de profundidad de poros y grosor del fondo proyectados en Tinkercad.
   6. Realizar un análisis estadístico de los datos obtenidos. En este caso, para comparar los valores medidos del andamiaje con los valores esperados, se puede utilizar la prueba U de Mann-Whitney (no paramétrica). La prueba de Shapiro-Wilk se utiliza para evaluar la normalidad. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

2. Preparación de hADSCs y formación de esferoides

NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas del adiposo humano (hADSCs) disponibles comercialmente se cultivaron en un medio de crecimiento específico para células y pasaron en una confluencia del 80%–90% según las recomendaciones del fabricante. Se usaron células hasta el paso 7 para este protocolo. Todos los residuos biológicos deben ser debidamente descontaminados o esterilizados antes de su eliminación y manipulados conforme a las directrices de bioseguridad institucional. Para una visualización confocal posterior, la monocapa debe etiquetarse con un tinte fluorescente antes de la formación de la esferoide e incubarse según lo recomendado por el fabricante. La formación de los esferoides puede iniciarse 30 minutos después del marcado.

1. Tripsinización de la monocapa ASC
   1. En un armario de seguridad biológica, abre el matraz de cultivo y transfiere su contenido a un contenedor de residuos.
   2. Lava la monocapa dos veces con 1× de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y descarta la solución.
   3. Añade una solución de tripsina/EDTA al 0,125% suficiente para cubrir la monocapa. Cierra el matraz e incuba en una incubadora humidificada a 37 °C durante hasta 5 minutos.
   4. Inactiva la tripsina/EDTA añadiendo un volumen igual de DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS).
   5. Recoge la suspensión celular usando una pipeta serológica o transfiere a tubos de centrifugación. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C).
   6. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
   7. Resuspende el pellet celular en DMEM y homogeneiza. Toma una alicuota para el recuento de células y la evaluación de viabilidad.
2. Cultura esferoide (véase Figura 2B)
   1. Separa el número adecuado de celdas a cubrir para cada molde en un tubo centrífugo de 15 mL. Para los hADSC, cada molde de agarosa que contenga 81 hezos debería recibir 1 × 10⁶ celdas—se forma un esferoide en cada micropozo, dando como resultado 81 esferoides por micromolde.
   2. Añade 1× PBS y centrifuga a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Descarta el sobrenadante y añade 1× PBS. Repite este paso dos veces.
   3. Tras la tercera centrifugación, descarta cuidadosamente el sobrenadante y seca la abertura del tubo con gasa estéril antes de devolverla a una posición vertical.
   4. Suspender el pellet celular en 120 μL de medio de cultivo 3D para el cultivo de esferoides y homogeneizar. Ajusta el volumen de la suspensión a 200 μL con medio de cultivo 3D adicional si es necesario.
      NOTA: Cada molde con 81 resecciones tiene una capacidad de 200 μL.
   5. Aspira 200 μL y placala cuidadosamente en el centro del molde, evitando la formación de burbujas.
      NOTA: Este paso puede automatizarse mediante un sistema robótico de pipeteo, como se describió^{anteriormente 22}.
   6. Deja la placa en el armario de seguridad biológica durante 5 minutos para que las células se asienten en las resecciones.
   7. Coloca el plato en una incubadora humidificada durante 40 minutos.
   8. Después de este periodo, añade cuidadosamente 2 mL de medium 3D a cada pozo. Devuelve la placa a la incubadora humidificada a 37 °C.
3. Medición y análisis estadístico de esferoides
   1. Capturar imágenes de los esferoides situados a lo largo de las dos diagonales del micromolde de agarosa, formando un patrón en "X", utilizando un microscopio óptico invertido equipado con una cámara digital y un objetivo de 10×. Utiliza la barra de escala de 100 μm para calibrar la escala de imagen antes de medir los diámetros.
   2. Para determinar los diámetros mayor y menor de los esferoides, utiliza la herramienta "line" del software y realiza dos mediciones perpendiculares para cada esferoide fotografiado, con un ángulo aproximado de 90° entre ellos.
   3. Calcular el diámetro medio de cada esferoides como la media aritmética de los dos diámetros perpendiculares previamente medidos. Calcular la esfericidad como la relación entre el diámetro mayor y el menor de cada esferoide, con valores más cercanos a 1 que indican mayor uniformidad y una forma más esférica.
   4. Realizar análisis estadísticos utilizando los valores obtenidos de diámetro y esfericidad.

3. Siembra de esferoides en andamios GelMA para fusión y bioensamblaje de esferoides

1. Tras 24 horas de formación esferoide, recógelas de los micromoldes de agarosa usando una pipeta con puntas de gran diámetro y transfieras a microtubos de 2 mL.
2. Cuando los esferoides se asienten en el fondo de los microtubos, descarta el sobrenadante.
3. Resuspende los esferoides en 50 μL de medio 3D.
4. Utilizando una pipeta con puntas de ancha, recoge los esferoides e incrusta suavemente los poros del andamiaje GelMA.
   NOTA: En un poro de soporte GelMA de unos 5,50 mm de diámetro y 2 mm de profundidad, se siembra aproximadamente entre 480 y 640 esferoides (correspondientes a 6–8 micromoldes de agarosa, cada uno generando 81 esferoides con diámetros que van de 200 a 400 μm) en 50 μL. Esta estimación se basaba en el volumen de poros y el diámetro medio del esferoide, cuantificándose mediante el número de micromoldes completos transferidos en lugar de conteo individual de esferoides, asegurando una estimación práctica y reproducible de la densidad esferoide dentro del poro.
5. Después de depositar los esferoides en el poro de soporte GelMA, espera entre 20 y 40 minutos para que los esferoides se asienten. Añade 1 mL de medio 3D a cada pozo.
6. Después de 24 horas, añade 1 mL de medio 3D a cada pozo.
7. Monitorizar la fusión de esferoides en los poros de los andamios GelMA mediante microscopía de contraste de fase y estereomicroscopía. Adquiere las imágenes cada 24 horas, desde el día 0 (inmediatamente después de la siembra) hasta el día 3 (72 horas).
8. Fijar la construcción biológica en paraformaldehído al 4% tras 72 horas para su visualización mediante microscopía confocal. Manipular el paraformaldehído en una campana extractora certificada utilizando el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular) debido a sus propiedades tóxicas e irritantes, y desechar los residuos conforme a las directrices de seguridad química institucional. Para la observación confocal, las células deben estar premarcadas en la monocapa con un tinte fluorescente antes de la formación de la esferoide.
   NOTA: Si es necesario extraer el constructo del poro GelMA para análisis o aplicación in vivo , recógelo cuidadosamente usando pinzas de precisión o un punzón de biopsia del tamaño adecuado.

Resultados

Las células madre humanas derivadas del adiposo (hASCs) cultivadas en una monocapa (Figura 2C) fueron inducidas con éxito a formar esferoides en menos de 24 horas tras la siembra en micromoldes de agarosa (Figura 2D). Los esferoides resultantes exhibieron una morfología compacta y bien definida. El análisis morfométrico reveló un diámetro medio de 239,8 μm ± 87,0 μm a las 24 horas (Figura 2E) y un v...

Discusión

Los resultados mostrados en este estudio destacan la integración exitosa de métricas de control de calidad en un flujo de trabajo estandarizado de biofabricación para garantizar la reproducibilidad. El uso de andamios impresos en 3D basados en diseños preestablecidos proporciona soporte estructural para el bioensamblaje^{esferoide 19,23}. Como prueba de concepto, se diseñó un andamio sólido con dos regiones porosas centrales, dimens...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Preparado en el laboratorio		-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 with Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Centrifuge	Eppendorf	-	5702
Class II Biological Safety Cabinet	Streamline	-	Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell culture	Thermo Fisher Scientific	-	Series 8000 WJ
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%	Sigma-Aldrich	900622	Número de lote/partida: MKCS2673. La documentación para cada lote, incluyendo la Hoja de Datos de Seguridad (SDS) y el Certificado de Análisis (CoA), se puede obtener del sitio web del fabricante’s.
GraphPad Prism 6.0 software	GraphPad Inc	-	-
Hot plate magnetic stirrer	IKA	Z671797	Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope	Labomed	-	-
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroids	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicillin-streptomycin 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)	Lonza	PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Trypsin/EDTA	Gibco	27250018	-