Un protocolo para la extracción de suspensión de célula única de córneas de ratón

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para obtener suspensiones unicelulares de alta calidad de córneas completas de ratón mediante digestión secuencial con colagénasa A y tripsina. Este método produce células individuales viables con alta integridad de ARN, haciéndolas compatibles con aplicaciones posteriores como la secuenciación de ARN unicelular y el citometradory de flujo.

Resumen

Como capa más externa del globo ocular, la córnea desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis y visión de la superficie ocular. Los avances recientes en la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) han permitido un análisis de alta resolución de la heterogeneidad celular corneal, pero la preparación de suspensiones unicelulares de alta calidad a partir de tejido corneal sigue siendo un reto debido a su estructura densa y compleja. En este estudio, establecemos un protocolo robusto para generar suspensiones de células únicas a partir de córneas completas de ratón. El procedimiento consiste en picar las córneas en fragmentos finos seguido de una digestión enzimática secuencial utilizando colagnasa A y tripsina. La suspensión celular resultante se evaluó en calidad mediante múltiples métricas: se utilizó tinción con azul de tripán para evaluar la viabilidad y el recuento celular; la tinción por inmunofluorescencia para pancitoqueratina y queratocano permitió la identificación y cuantificación de los principales tipos celulares corneales; y la integridad del ARN se verificó mediante un bioanalizador. Este protocolo proporciona consistentemente preparaciones de célula única con altos números celulares, excelente viabilidad (≥ 94,6%) y una alta proporción de células individuales (96,3%), cumpliendo los requisitos compatibles con aplicaciones posteriores exigentes, incluyendo scRNA-seq.

Introducción

La córnea, situada en la capa más externa del globo ocular, es esencial para sus funciones de barrera y refracción, debido a una arquitectura altamente organizada que comprende cinco capas distintas: el epitelio, la capa de Bowman, el estroma, la membrana de Descemet y el endotelio¹. El epitelio corneal es una estructura escamosa estratificada no queratinizada que proporciona una barrera física contra patógenos externos y exhibe robustas capacidades antimicrobianas y regenerativas. El estroma, compuesto por fibrillas de colágeno alineadas con precisión, mantiene la transparencia corneal y un índice de refracción^{uniforme 2}. El endotelio, una capa monocelular, regula la transferencia de fluidos entre el estroma y el humor acuoso, preservando así la hidratación corneal y el suministro de^{nutrientes 3}. No obstante, esta complejidad estructural y celular intrincada ha supuesto históricamente desafíos significativos para investigar las funciones biológicas corneales y los mecanismos^subyacentes.

Para estudiar las interacciones intercelulares e identificar marcadores específicos de cada tipo celular, se emplean ampliamente técnicas como la clasificación de citometría^{de flujo 5} y la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq^)6. Sin embargo, un gran obstáculo técnico común a ambos enfoques es la preparación de suspensiones de celda única de alta calidad. Parámetros como el rendimiento total de las células, la proporción de células individuales y la viabilidad celular son fundamentales para la fiabilidad de las aplicaciones posteriores destinadas a caracterizar la función de las células corneales y la expresión de marcadores^{superficiales 7}. A pesar de su importancia, sigue existiendo una falta de protocolos estandarizados y eficientes para generar suspensiones de célula única a partir de córneas completas de ratón.

Se han establecido varios métodos para obtener suspensiones unicelulares a partir del tejido corneal. La digestión enzimática secuencial utilizando colagenasa A, tripsina o tripsina se ha empleado para aislar células individuales tanto de córneas humanas como^{murinas 8}. La tripsinización repetida también se ha utilizado para la disociación corneal⁷. Además, se han aplicado con éxito kits comerciales de disociación multitejido, como los de Miltenyi Biotec, para generar suspensiones corneales^{unicelulares 9}. En nuestro estudio comparativo previo de diferentes métodos de digestión corneal, demostramos que el tratamiento secuencial con colagnasa y tripsina constituye el enfoque óptimo. Este método proporciona consistentemente altos números celulares, excelente viabilidad (≥94,6%), un alto porcentaje de células individuales (96,3%) e integridad bien preservada del^{ARN 10}.

En este protocolo, ofrecemos un procedimiento detallado y paso a paso para generar suspensiones de células únicas de alta calidad a partir de córneas completas del ratón utilizando esta estrategia de digestión enzimática optimizada, basada en nuestra experiencia establecida y hallazgos previos.

Protocolo

Las ratones hembras C57BL/6 (B6), de 6 a 8 semanas, fueron suministradas por el Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica de Guizhou. Los animales se alojaron bajo un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con acceso ad libitum a comida y agua. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Experimental de Animales de la Universidad Médica de Guizhou (Aprobación nº 2305185) y realizados en cumplimiento con la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y de la Visión.

1. Preparación

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos: Limpiar dos pares de tijeras oftálmicas, dos pares de pinzas oftálmicas, un par de pinzas de tejido y un tubo centrífugo de 2 mL enjuagando dos veces con agua doble destilada (DDW). Esteriliza los instrumentos y el tubo usando un autoclave de vapor. Seca todos los objetos durante la noche en un horno convencional a 65 °C.
2. Preparación de la solución
   1. Medio epitelial hormonal suplementario (SHEM): Prepara SHEM suplementando el medio DMEM/F12 con los siguientes componentes: suero fetal bovino (FBS) al 5% (v/v), 0,5% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO), 10 ng/mL factor de crecimiento epidérmico del ratón, 5,5 μg/mL transferrina, 0,5 μg/mL hidrocortisona, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina).
      NOTA: SHEM se utiliza para mantener la viabilidad de la celda durante el procesamiento. Puede sustituirse por medios alternativos como DMEM basal o solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contienen al menos un 10% (v/v) de FBS.
   2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
      1. Disolver 22,4 g de polvo de PBS en 2 L de agua destilada doble (DDW) bajo agitación usando un agitador magnético para obtener 1× PBS.
      2. Autoclava la solución PBS con un día de antelación y déjala enfriar.
      3. En condiciones estériles, transfiera 47,5 mL de PBS estéril de 1× a un tubo centrífugo de 50 mL y añade 2,5 mL de penicilina-estreptomicina al 1% (v/v).
         NOTA: La formulación 1× PBS (2 L) contiene 137 mM de NaCl, 8 mM_{de Na 2HPO 4} y 2 mM de_{NaH 2}PO₄, pH 7,2.
   3. Soluciones de colagénasa A
      1. Solución estándar: Disolver 1 g de colagnosa A en polvo en 40 mL de DDW. Filtra a través de un filtro de 0,2 μm y guárdalo a -20 °C.
      2. Solución de trabajo: Diluir 1 mL de colagenasa A solución stock en 4 mL de DDW estéril para obtener una concentración final de 5 mg/mL.
   4. Solución de tripsina: Descongelar la solución comercialmente disponible de tripsina/EDTA al 0,25% (p/v) (que contiene 0,91 mM EDTA) sobre hielo antes de su uso.
   5. Solución de azul de tripán (0,4%): Disuelva 0,4 g de azul de tripán en 100 mL de DDW. Filtra con papel de filtro y guárdalo a 4 °C.
      NOTA: La solución de Trippan Blue al 0,4% se utiliza para evaluar el recuento total de células, la proporción de células individuales y la viabilidad. Puede sustituirse por kits comerciales de tinción viva/muerta o sistemas automáticos de conteo de células.

2. Preparación de córneas de ratón

1. Esteriliza el microscopio de disección y la zona de trabajo limpiando con etanol al 75%, y luego expone la zona a la luz UV dentro de un armario de seguridad biológica durante 30 minutos.
2. Preparar lo siguiente en condiciones estériles: una placa de Petri de 60 mm con 5 mL de medio SHEM, tres placas de Petri de 60 mm cada una con 5 mL de 1× PBS suplementadas con 5% de penicilina-estreptomicina (P-S), tres placas de Petri de 60 mm cada una con 5 mL de PBS simple de 1× y un tubo centrifugador estéril de 2 mL
3. Eutanasia del ratón mediante asfixia por CO₂ , seguida de una luxación cervical.
4. Enjuaga bien la cabeza del ratón y los párpados cerrados inmersiendo tres veces en PBS que contenga un 5% de P-S antes de proceder con la enucleación.
5. Con tijeras oftálmicas, haz una incisión a lo largo del polo posterior de cada globo ocular y coloca cuidadosamente los ojos aislados en la placa de Petri que contiene el medio SHEM helado (Figura 1A).
   NOTA: Para maximizar la viabilidad celular, todas las soluciones deben estar preenfriadas a 4 °C y todos los pasos de disección deben realizarse sobre hielo.
6. Transfiere inmediatamente la placa de Petri con los ojos a un armario de seguridad biológica. Lava los globos oculares tres veces en 1× PBS que contenga 5% de P-S, incubando durante 5 minutos por lavado.
7. Bajo un microscopio disecador, separa cuidadosamente el tejido corneal: Utilizando tijeras oftálmicas y pinzas, haz una incisión desde el polo posterior hacia el limbo corneal. Desprende suavemente la córnea de la esclerótica y la conjuntiva a lo largo del borde limbal. Retira completamente el cristalino y el iris usando dos pares de pinzas (Figura 1B).
8. Utilizando pinzas oftálmicas, transfiere el tejido corneal a una placa de Petri que contenga 1× PBS y lávate tres veces (5 minutos cada una) para eliminar cualquier tejido no corneal residual y antibióticos.
   NOTA: El iris suele adherirse firmemente a la córnea. Asegúrate de que se retire suavemente y completamente con pinzas para evitar contaminaciones, dejando solo tejido corneal limpio.
9. Utilizando pinzas oftálmicas, transfiere el tejido corneal limpio a un tubo centrífugo de 2 mL y añade 1 mL de solución activa de colagénasa A (5 mg/mL).
10. Con tijeras oftálmicas, tritura el tejido corneal en fragmentos de aproximadamente 0,5 mm × 0,5 mm directamente dentro del tubo.
11. Incubar el tubo que contiene los fragmentos corneales y la solución de colagínasa A en una incubadora de cultivo celular a 37 °C durante 1 hora (Figura 2A-C).
12. Durante la digestión de la colagenasa A, monitoriza el tejido cada 10 minutos. Terminar la digestión cuando no queden fragmentos de tejido grandes procediendo a centrifugación. Centrifuga la muestra a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente usando una centrífuga. Aspira cuidadosamente el sobrenadante.
13. Resuspende el pellet en 200 μL de solución al 0,25% de tripsina/EDTA.
14. Incubar el tubo en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C durante 10 minutos para digerir los fragmentos de tejido restantes.

3. Aislamiento de células individuales corneales

1. Triturar suavemente la mezcla (tejido y solución de tripsina/EDTA) repetidamente usando una pipeta P1000 con punta de gran diámetro para disociar el tejido en una suspensión unicelular.
2. Centrifuga la suspensión de la celda a 300 x g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante. Resuspende el pellet celular en 1 mL de PBS que contenga albúmina sérica bovina (BSA) al 0,04% para obtener una suspensión unicelular.
   NOTA: Para las células destinadas a secuenciación o citometría de flujo, resuspenderse en PBS sin suero. Para las células que se cultivarán, usa 1x PBS suplementado con 0,04% de BSA.
3. Filtrar la suspensión de la celda a través de un colador de celda de 40 μm previamente humedecido hacia un nuevo tubo centrífugo de 50 mL para eliminar grumos y residuos celulares.
   NOTA: Prehumedecer el colador celular con PBS para minimizar la pérdida celular. Si es necesario, las celdas filtradas pueden centrifugarse de nuevo y resuspenderse en el volumen deseado para la concentración.

4. Conteo de celdas

1. Combina 9 μL de la suspensión de la celda con 1 μL de solución de azul de tripán al 0,4% y mezcla suavemente.
2. Carga lentamente la mezcla en una cámara de hemocitómetro a través del canal de carga designado. Cuenta las celdas usando el método de cuatro cuadrantes para determinar el número total de celdas, la viabilidad y la proporción de células individuales. Realiza al menos dos réplicas técnicas.

Resultados

La calidad de las suspensiones unicelulares se evaluó en función del rendimiento total de la celda, la proporción de células individuales y la viabilidad celular. La suspensión se teñió con azul de tripán y se analizó mediante microscopía de contraste de fase en múltiples campos (Figura 3). De cuatro ojos de ratón (ocho córneas), se obtuvo un total de 1,05 × 10⁵ células, con una viabilidad celular media del 94,6% y una proporción de células indivi...

Discusión

La introducción de la secuenciación de ARN unicelular ha incrementado notablemente el uso de tecnologías genómicas, transcriptómicas, epigenéticas y proteómicas en la investigación^ocular 9,10,11,12. En consecuencia, la preparación de suspensiones unicelulares de alta calidad se ha vuelto cada vez más crítica, ya que permite detectar variaciones de señalización ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Alexa Fluor 594 anti-conejo burro	Abcam	ab150064
Antiqueratina	Abcam	ab230175
Anti-pancitoqueratina	Thermo Fisher Scientific	AE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Esterilizador de autoclave	An Shen	LDZH-100KBS
Albúmina sérica bovina V	Solarbio	A8020
Filtro celular	NIDO	258369	40 & mu; m
Máquina centrífuga	Eppendorf AG	22331 Hamburgo
Colagenasa A	Roche	10103578001
Microscopio confocal	Oberkochen	Zeiss LSM 880
Placa de conteo	MARIENFELD	M407859
Tubo centrífugo	NIDO	620611	2 mL, 50 mL
Cubierta	MARIENFELD	M407859
DAPI	Solarbio	C0065
Microscopio diseccionador	Carl ZEISS	VISU150
DMEM/F12  Medios	Gibco	11320033
DMSO	Solarbio	D8371
Fetal  bovino  Suero	Gibco	16140071
Hidrocortisona	Solarbio	IH0100
ITS	Gibco	23337619
Factor de crecimiento epidérmico del ratón	Invitrogen	PMG8041
cirugía oftálmica  Pinzas	Dumot	0208-5-PO
Tijeras quirúrgicas oftálmicas	FST	15021-15
Horno	AISITE	DH6000 II
Penicilina y Estreptomicina	Gibco	15070063	100 mL
Placa de Petri	NIDO	705201	60mm
Solución salina tamponada con fosfato	Solarbio	P1010
Incubadora termostática	Thermo Fisher Scientific	3111
Triton-X 100	Solarbio	T8200
Trippan Blue	Solarbio	T8070
Tripsina/EDTA	Gibco	R001100
Mesa ultralimpiadora	You Qi	VS-840-2
4% de paraformaldehído	Solarbio	P1110