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Artículo de método

Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

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DOI:

10.3791/69853

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20 de marzo de 2026

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1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe el marcaje de anticuerpo único (SAL) para resolver la organización espacial a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática. Al aprovechar las interacciones acumulativas anticuerpo-epítopo a nivel de molécula única, el SAL de membrana (mSAL) mapea las distribuciones locales de epítopos mientras captura simultáneamente el comportamiento de unión de anticuerpos en el entorno celular nativo.

Resumen

La membrana plasmática define la forma celular y actúa como la interfaz que gobierna la comunicación intercelular. Las proteínas de membrana constituyen una clase principal de objetivos terapéuticos; Por lo tanto, la superresolución de la membrana celular a través de sus proteínas constitutivas tiene un gran potencial para avanzar en la biología celular y la terapéutica de anticuerpos. En este sentido, la microscopía de localización de molécula única (SMLM) permite la visualización a nanoescala de organizaciones proteicas en estructuras biológicas. A pesar de su importancia, aplicar SMLM a proteínas de membrana plasmática presenta desafíos únicos. En este protocolo, presentamos un enfoque eficaz utilizando marcaje de anticuerpos únicos en lapso de tiempo (SAL) denominado SAL de membrana (mSAL). Proporcionamos instrucciones detalladas paso a paso, incluyendo la optimización de la concentración de anticuerpos, la densidad de potencia del láser, la duración de los intervalos sin iluminación, la reconstrucción de imágenes y el análisis de conglomerados basados en densidad, para resolver la distribución nanométrica de proteínas de membrana y la morfología de membranas. Utilizamos la proteína tetraspanina CD81 como proteína de membrana modelo para demostrar la capacidad de mSAL tanto en células adherentes como en células mamíferas en suspensión. Además de super-resolver la membrana celular y las distribuciones de las proteínas de membrana, nuestra técnica permite investigar la farmacodinámica de los anticuerpos terapéuticos que interactúan con sus dianas de membrana en el entorno de membrana nativa.

Introducción

La membrana plasmática contiene una amplia variedad de proteínas que regulan la movilidad celular, la adhesión, la detección y la comunicación intercelular. Comprender la distribución a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática es importante, ya que la función de las proteínas suele estar gobernada no solo por los niveles de expresión, sino también por su organización espacial en lamembrana 1,2. Cabe destacar que muchos anticuerpos terapéuticos se dirigen a las proteínas demembrana 3,4, lo que hace que las investigaciones a nanoescala sean esenciales para entender cómo las interacciones de anticuerpos están influenciadas por la organización local de las proteínas de membrana. Sin embargo, el mapeo preciso de la distribución de proteínas de membrana, el perfilado de abundancia por moléculas individuales y el seguimiento en tiempo real de sus interacciones dinámicas con los socios de unión siguen siendo un reto.

Las técnicas ampliamente utilizadas de microscopía de localización de molécula única (SMLM), como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)5,6 y la acumulación de puntos basada en ADN para la imagen en topografía a nanoescala (DNA-PAINT)7, emplean tinción por inmunofluorescencia (IF) para el marcado de muestras. Alcanzan resoluciones laterales de ~ 10 nm y han proporcionado amplios conocimientos sobre la organización a nanoescala de dianas terapéuticas de membrana, incluyendo receptores humanos de factores de crecimiento epidérmicos 2 (HER2)8,9, CD2010, receptores de células T11,12,13, ligando de muerte programado 1,14, receptores de células B 15,16,17 y CD19 17.18. Por ejemplo, los estudios dSTORM que utilizan el anticuerpo monoclonal terapéutico Trastuzumab para detectar directamente HER2, un receptor clave implicado en el cáncer de mama, han revelado estados de agrupamiento distintos entre pacientes positivos enHER2 8, mientras que diferentes anticuerpos terapéuticos han demostrado modular el agrupamiento deHER2 9. DNA-PAINT combinado con microscopía de lámina de red ha elucidado los estados oligoméricos y los perfiles de interacción del CD20 en células B con anticuerpos monoclonales terapéuticos rituximab, ofatumumab y obinutuzumab10. Aunque el SMLM convencional proporciona valiosas perspectivas sobre la organización a escala nanométrica, su potencial completo está limitado por los enfoques tradicionales de tinción FI. La calidad de la imagen SMLM depende de la tinción con FI, que a su vez está gobernada por la especificidad y afinidad del anticuerpo de marcaje. El SMLM tradicional utiliza anticuerpos de alta afinidad que normalmente logran una tinción de FI y calidad de imagen superior. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos terapéuticos interactúan con los receptores de membrana de las células vivas con afinidad moderada para minimizar los efectos secundarios fuera del objetivo19. Por ejemplo, los comprometedores de células T biespecíficas (TCE) muestran una afinidad menor por CD3, lo que impide la internalización deTCR 20,21,22. Tales interacciones no pueden ser capturadas con precisión por técnicas convencionales de FI.

Anteriormente hemos desarrollado una estrategia que aprovecha directamente las interacciones anticuerpo-epítopo de molécula única, denominada marcaje de anticuerpo único (SAL). SAL permite un mapeo de alta densidad de las interacciones anticuerpo-epítopo mientras preserva los equilibrios de uniónnativos 23. Aunque anteriormente hemos informado de un protocolo para proteínas intracelulares del citoesqueleto y mitocondriales, el SAL en proteínas de membrana no ha sido demostrado. En este protocolo, ofrecemos un flujo de trabajo paso a paso para aplicar SAL a proteínas de membrana, demostrado mediante el marcaje de la tetraspanina CD81, un candidato terapéutico objetivoreportado 25,26,27,28, tanto en células en suspensión como adherentes. Utilizando anticuerpos anti-CD81 marcados fluorescentemente para sondear directamente la distribución espacial de CD81 en células T U2OS y Jurkat, demostramos la aplicación de estudios a nanoescala SAL de proteínas de membrana. Denominamos esta estrategia SAL de membrana (mSAL). Finalmente, describimos una estrategia basada en agrupamiento para reducir las detecciones aisladas de moléculas individuales fuera de la célula.

En esencia, SAL utiliza marcaje de molécula única en lapso de tiempo para capturar interacciones individuales anticuerpo-epítopo, y la posterior deconvolución de emisor único produce una imagen de superresolución basada en SMLM. Ajustando la concentración de anticuerpos y seleccionando un intervalo no iluminador (NII) adecuado entre fotogramas de imagen consecutivos, SAL ajusta la tasa de acceso de anticuerpos a la tasa de detección de moléculas individuales, permitiendo la localización de moléculas individuales. El SAL requiere NIIs más largos debido a la cinética de unión inherentemente lenta de los anticuerpos, que prolongan la duración de adquisición de la imagen (~3-17 horas). SAL es más adecuado para aplicaciones que requieren un mapeo nanográfico preciso de epítopos y la evaluación de la dinámica de interacción individual entre anticuerpos y epítopos. A pesar de su menor cauda, SAL ofrece una visión única sobre la organización de los epítopos y el compromiso de los anticuerpos en condiciones casi fisiológicas, lo que lo hace especialmente valioso para caracterizar anticuerpos terapéuticos in situ.

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Protocolo

Este protocolo utiliza las líneas celulares Jurkat E6.1 y U2OS establecidas y no involucra materiales humanos o animales vivos primarios.

1. Siembra/aterrizaje celular y fijación

NOTA: La preparación de la muestra sigue los protocolos estándar de tinción por inmunofluorescencia (IF), optimizados para preservar la organización subcelular de las proteínas de membrana plasmática en diferentes tipos celulares. Si existe un protocolo de inmunotinción establecido para el objetivo de interés, los usuarios pueden seguir ese protocolo hasta el paso de bloqueo de muestras 1.2.14. El marcaje de un solo anticuerpo (SAL) se basa en la detección acumulativa de anticuerpos marcados con fluorescencia a medida que se unen a su antígeno a nivel de molécula única. Se añaden anticuerpos marcados con fluorescencia diluidos en un tampón de imagen a las muestras en el escenario del microscopio, y el marcaje fluorescente se produce dinámicamente a medida que avanza la adquisición de la imagen. No se realiza marcaje fluorescente durante la fase de preparación de la muestra.

  1. Preparar células adherentes, como la línea celular U2OS, tal y como se describe en un protocolo24 previamente publicado.
  2. Suspensiones de celdas
    1. Mantener las células T de Jurkat a una densidad de 1 x10 5 a 1 x10 6 células/mL en 10 mL de medio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina) a 37 °C en una incubadora humidificada suplementada con 5% de CO2.
      NOTA: Los 10 mL recomendados de medio completo se aplican a los frascos T25; Los usuarios deben ajustar el volumen en consecuencia al utilizar diferentes recipientes de cultivo.
    2. Prepara la superficie del vidrio añadiendo 200 μL de solución de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% a los pozos destinados a su uso en un vidrio cubierto con 8 pozos de cámara. Incubar durante la noche a 4 °C o durante 2 horas a 37 °C.
    3. Cuenta las células del cultivo usando un hemocitómetro y luego transfiere 3,5 x 104 células a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: Puede que sea necesario ajustar el recuento de células para lograr una buena distribución de células individuales. Un rango de siembra de 30.000-60.000 células T Jurkat alcanza una densidad ideal en la que las células individuales están claramente separadas entre sí sin estar demasiado dispersas. Puede que sea necesario ajustar el recuento celular para un nuevo tipo celular.
    4. Centrifuga a 300 x g durante 3 minutos para obtener un pellet de celda. Descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 200 μL de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) precalentada (37 °C). El pellet celular resultante será visible como un pequeño depósito blanco en el fondo del tubo de la microcentrífuga.
      NOTA: Eliminar los residuos biopeligrosos conforme a las directrices de la institución y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.
    5. Aspira la solución de PLL del vidrio de cubierta preparado en cámara (paso 1.2.2). Si la incubación con PLL se realiza durante la noche a 4 °C, calienta previamente el vidrio de cubierta con 8 pozos a 37 °C antes de aspirar la solución.
    6. Añade la suspensión de celda del paso 1.2.4. sobre el pozo de la cámara recubierto con PLL. Incubar en una incubadora humidificada a 37 °C suplementada con 5% deCO2 durante 30 minutos para permitir que las células se adhieran a la superficie. Mezcla bien la suspensión de celdas antes de colocar el chapado y haz pipeta arriba y abajo para romper los grumos celulares y asegura una distribución uniforme por el pozo.
    7. Comprueba la fijación de la celda a la superficie de cristal usando un microscopio óptico. Con una ampliación de 10x, enfoca el microscopio en la parte inferior del cristal de la cubierta.
      NOTA: Golpear suavemente el cristal de la cubierta con cámara mientras observas bajo el microscopio puede ayudar a evaluar si las células se han adherido a la superficie o aún flotan.
    8. Preparar 200 μL del tampón de fijación (4% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en DPBS) y precaliéntalo a 37 °C en un baño maria.
      NOTA: El buffer de fijación proporcionado está optimizado para CD81 y es generalmente adecuado para preservar proteínas de membrana. Para nuevos objetivos proteicos de membrana, puede ser necesario ajustar la composición del tampón para lograr una preservación óptima. Se anima a los usuarios a consultar la literatura para encontrar condiciones de fijación adaptadas a nuevos objetivos.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y cancerígeno. El glutaraldehído es tóxico y corrosivo. Usa el equipo de protección individual (EPP) adecuado al manipular este reactivo. En caso de contacto con la piel, lava inmediatamente la zona afectada a fondo con agua y jabón. Deshazte del reactivo conforme a las directrices de la institución del usuario y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.
    9. Aspira el DPBS de cada pozo de muestra (del paso 1.2.6) usando una micropipeta.
      NOTA: Es fundamental realizar todos los pasos de intercambio de solución de forma lenta para evitar que las células se desprendan del vidrio de la cubierta. Eliminar los residuos biopeligrosos conforme a las directrices de la institución del usuario y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.
    10. Añade 200 μL de buffer de fijación precalentado a 37 °C en una esquina del pozo e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico y cancerígeno. El glutaraldehído es tóxico y corrosivo. Lleva el EPI adecuado al manipular estos reactivos. En caso de contacto con la piel, lava inmediatamente la zona afectada a fondo con agua y jabón. Deshazte del reactivo conforme a las directrices de la institución del usuario y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.
    11. Lava las celdas fijas 3 veces con 500 μL de DPBS. Salta este paso si sigues con el paso 1.2.12.
    12. Opcional: Retira lentamente la solución de fijación y añade 200 μL de borohidruro de sodio al 0,1% recién preparado en DPBS, luego incuba a temperatura ambiente durante 7 minutos. Salta este paso y procede al paso 1.2.14 si no usas la reducción de borohidruro de sodio.
      NOTA: La reducción con borohidruro de sodio ayuda a apagar la autofluorescencia generada por glutaraldehído y neutraliza los aldehídos no reaccionados. La liberación de gas hidrógeno como resultado de la reacción del borohidruro de sodio con la solución acuosa se manifestará como la liberación de burbujas. Si no se observa la liberación de gas hidrógeno, utiliza una solución recién elaborada de borohidruro de sodio.
      PRECAUCIÓN: El borohidruro de sodio es tóxico y corrosivo. Usa el EPI adecuado al manipular este reactivo. En caso de contacto con la piel, lava inmediatamente la zona afectada a fondo con agua y jabón. Deshazte del reactivo conforme a las directrices de la institución del usuario y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.
    13. Aspira la solución de borohidruro de sodio de cada pozo y luego lava tres veces con 500 μL de DPBS.
    14. Prepara 200 μL del buffer de bloqueo y añádelo al pozo. Incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. No utilice un reactivo de permeabilización (por ejemplo, TritonX-100, saponina), ya que podría eliminar proteínas de membrana. El protocolo de membrana SAL (mSAL) presentado aquí para CD81 no incluía un paso de bloqueo.
      NOTA: Se recomienda un tampón bloqueante que contenga albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (v) en DPBS para mSAL con nuevos objetivos. Al usar anticuerpos secundarios, se utiliza el suero correspondiente para bloquear. Por ejemplo, suero de cabra al 10% (v/v) en DPBS cuando se usa un anticuerpo secundario cabra-huésped. Si existe una receta de búfer de bloqueo establecida y un protocolo para el objetivo, los usuarios pueden seguir ese protocolo. El tampón bloqueante puede complementarse opcionalmente con anticuerpos de control de isotipo o anticuerpos derivados del suero para reducir las uniones fuera del objetivode los anticuerpos 23,24. Solo incluye un reactivo de permeabilización en el buffer bloqueador si el anticuerpo apunta a un epítopo intracelular de la proteína de membrana.
    15. Para mSAL con anticuerpos primarios conjugados con colorante, proceda directamente al paso 1.2.20.
    16. Preparar 150 μL de la solución primaria de tinción de anticuerpos (anticuerpo diluido en la concentración deseada en el tampón bloqueante). Sáltate este paso para mSAL con anticuerpos primarios conjugados con colorante.
      NOTA: Para la tinción primaria de anticuerpos, consulte la hoja técnica del proveedor para las condiciones recomendadas. Si no se proporciona información de concentración, comienza con 4 μg/mL (27 nM) para una IgG de longitudcompleta 23,24.
    17. Sustituye el buffer bloqueante por la solución primaria de anticuerpos. Incuba a temperatura ambiente durante 2 horas o a 4 °C durante la noche en una cámara húmeda. Sáltate este paso para mSAL con anticuerpos primarios conjugados con colorante.
    18. Lava la muestra dos veces con 400 μL de DPBS. Añade 200 μL de buffer de bloqueo al pozo.
    19. Opcional: Sustituye el buffer bloqueante por 200 μL de buffer post-fijación (4% de paraformaldehído) e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: La post-fijación ayuda a preservar el bloqueo de muestras paraSAL 23,24. Sin embargo, este paso debe omitirse si reduce la accesibilidad de los epítopos. Para evaluar el efecto de la post-fijación en el reconocimiento de epítopos por anticuerpos, realizar tinciones estándar de inmunofluorescencia con y sin post-fijación, y comparar la calidad de la tinción.
    20. Opcional: lava la muestra dos veces con DPBS.
    21. Añade 200 μL de DPBS en cada pozo y cubre la cámara con una película transparente para evitar la evaporación. Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante hasta 1 mes. Si se realiza mSAL inmediatamente después del paso 1.2.14, o 1.2.19 sin post-fijación, mantenga la muestra en el buffer de bloqueo y proceda directamente al paso 2.2.
      NOTA: Mantener la muestra en DPBS suplementada con 5 mM de azida de sodio evitará el crecimiento bacteriano durante el almacenamiento.
      PRECAUCIÓN: La azida de sodio es agudamente tóxica y puede ser fatal si se ingiere. Usa el EPI adecuado al manipular este reactivo. En caso de contacto con la piel, lava inmediatamente la zona afectada a fondo con agua y jabón. Deshazte del reactivo conforme a las directrices de la institución del usuario y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.

2. Adquisición de imágenes

NOTA: El procedimiento de imagen tanto para células adherentes como para células en suspensión es similar y se realiza mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Sin embargo, las condiciones de imagen deben optimizarse para cada tipo celular.

  1. Deja que las muestras almacenadas (a 4 °C) alcancen la temperatura ambiente antes de la imagen para evitar la condensación en el cristal. Salta este paso si procedes directamente a la imagen tras la preparación de la muestra.
  2. Encienda el sistema de microscopio: microscopio, cámara sCMOS, unidad láser y el ordenador con el software de adquisición de imágenes. Permite que el sistema de microscopio se estabilice durante 5-10 minutos tras encenderse para que los componentes del sistema alcancen la temperatura de funcionamiento y minimicen la deriva térmica.
    NOTA: el mSAL puede realizarse utilizando cualquier configuración de microscopio TIRF y software compatible. Enciende el sistema según las instrucciones del instrumento.
  3. Aplica aceite de inmersión sobre un objetivo TIRF (por ejemplo, 100x/1.49) y monta el vidrio de la cubierta en la cámara sobre el escenario del microscopio.
    NOTA: Si el objetivo está equipado con un collar de corrección, asegúrese de que esté ajustado al grosor correcto del cristal de cubierta a 23 °C. El vidrio de cubierta utilizado en este estudio tenía un grosor de 0,13-0,17 mm.
  4. Si está equipado, activa el Sistema de Enfoque Perfecto (PFS), luego eleva cuidadosamente el objetivo hacia el cristal de la cubierta y enfoca la muestra.
  5. Prepara coloides de oro como marcadores fiduciales (dilución 1:2 en agua ultrapura). Sonica los coloides de oro antes de diluirlos durante 3 minutos para dispersar los agregados.
  6. Aspira suavemente el buffer de almacenamiento (DPBS o buffer de bloqueo) del pozo de la muestra y añade 200 μL de la solución coloide de oro a la muestra. Incuba durante 1 minuto y retira la solución.
  7. Utiliza iluminación de campo claro para verificar que se hayan depositado suficientes coloides de oro antes de aspirar la solución. Una densidad ideal consiste en 5 a 10 coloides de oro dentro de la región designada de interés (ROI).
    NOTA: Alternativamente, microsferas fluorescentes (véase Tabla de Materiales) pueden usarse con una dilución de 1:1.000 en DPBS.
  8. Lava 1 vez con 500 μL de agua ultrapura para eliminar el exceso de coloides de oro, luego añade 200 μL de DPBS.
  9. En el software de imagen, crea la configuración óptica para el fluoróforo (de la sonda de anticuerpos), incluyendo el dicroico adecuado, la longitud de onda de excitación láser y la densidad de potencia, el tiempo de integración de la cámara, el filtro de emisión y el binning de píxeles de la cámara (si corresponde). Se recomienda un tamaño de píxel de 150-160 nm para lograr una resolución óptima.
  10. Crea una configuración óptica para un paso de fotoblanqueo. Se recomienda una potencia láser de 380 W/cm2 o superior con un tiempo de integración de la cámara de 1 s.
    NOTA: El blanqueamiento por fotolijia durante la adquisición ayuda a minimizar la superposición entre eventos individuales de unión a anticuerpos fluorescentes. La luz recogida puede dirigirse a través de un filtro de emisión con una longitud de onda no coincidente para evitar la saturación de la cámara.
  11. Ajusta el ángulo láser para establecer la iluminación TIRF. Utilizando iluminación de campo claro, identifica una celda para mSAL. Asegúrate de que al menos 5 coloides dorados sean visibles dentro del ROI para corregir la deriva de la etapa durante la reconstrucción de la imagen. Confirma la autofluorescencia de los coloides dorados en la densidad de potencia del láser de imagen.
  12. Establece los parámetros de imagen: intervalo no iluminador (NII), número de fotogramas y la frecuencia del paso de fotoblanqueo (si es necesario) en el software de adquisición de imágenes. Para la mSAL de CD81 en células U2OS y Jurkat T con anticuerpos CD81, los ajustes óptimos fueron un NII de 5 s, 2.000 fotogramas en total y un paso de fotoblanqueo cada 5 fotogramas.
    NOTA: Estos parámetros deben optimizarse para cada proteína de interés, el anticuerpo utilizado para el mSAL y el tipo celular. Consulta el paso 3 para más detalles sobre optimización. El número óptimo de marcos puede variar tanto entre el anticuerpo-objetivo como según el tipo celular. Para nuevos sistemas objetivo, se recomienda capturar entre 2.000 y 3.000 fotogramas como punto de partida. Los NII extienden la duración de adquisición de imágenes. Por ejemplo, una adquisición mSAL de 3.000 frames con un NII de 20 s resulta en ~17 h de tiempo de adquisición.
  13. Prepara el tampón de imagen diluyendo el anticuerpo CD81 a una concentración de 1 μg/mL en 200 μL de 5% de BSA (p/v) en DPBS. Para mSAL de CD81, la concentración final de anticuerpos fue de 0,5 nM para células T de Jurkat y 2 nM para células U2OS.
    NOTA: La concentración de anticuerpos depende de la abundancia local del sustrato y de la afinidad del anticuerpo. Es fundamental optimizar las concentraciones de anticuerpos para cada proteína objetivo, cada anticuerpo utilizado para la imagen y cada tipo celular. Consulta el paso 3.1 para más detalles sobre optimización.
  14. Añade el buffer de imagen preparado al pozo y comienza la adquisición.

3. Optimización de parámetros de imagen

NOTA: los parámetros de imagen de mSAL están influenciados por la expresión de la proteína, su organización local y la elección del anticuerpo utilizado para la imagen. El objetivo de optimizar los parámetros de imagen es identificar la concentración de anticuerpos y la NII que producen eventos de molécula única resueltos espacialmente, manteniendo densidades suficientemente altas para maximizar el muestreo de epítopos.

  1. Concentración de anticuerpos
    1. Diluir el anticuerpo a 0,5 nM para las células de Jurkat y 2 nM para las células U2OS en 200 μL de 5% (p/v) de BSA en DPBS y añadir la solución de anticuerpos al pozo. Para un marcaje óptimo de un solo anticuerpo, se utiliza una concentración de anticuerpos en o cerca de su constante de disociación de equilibrio (Kd); si Kd es desconocido, se recomienda empezar en 1 nM.
    2. Utiliza la función de visualización en vivo en el software de imagen configurado para mSAL para monitorizar la unión de anticuerpos.
    3. Ajusta el ángulo TIRF y los parámetros de imagen para lograr una relación señal-ruido (SNR) de ≥ 3.
      NOTA: Un ángulo óptimo de TIRF mejora la SNR limitando la fluorescencia fuera de foco causada por la difusión de anticuerpos en el buffer de imagen. Se puede usar una densidad de potencia láser de 100-200 W/cm2 y un tiempo de integración de cámara de 50 ms al principio. Si la SNR es baja, aumenta gradualmente la potencia del láser y/o el tiempo de integración de la cámara y monitoriza los cambios en la SNR hasta que alcance un valor óptimo.
    4. Configura los parámetros de imagen en el software de adquisición de imágenes para obtener al menos una adquisición de 10 fotogramas con un NII de 5 s (véase el paso 2.12).
      NOTA: Se recomienda un NII de 5 s como punto de partida. Debe realizarse una exploración NII para identificar la NII óptima para un nuevo sistema anticuerpo-objetivo (paso 3.2).
    5. Empieza la adquisición. Evalúa la escasez de localizaciones de moléculas individuales de la película grabada.
      NOTA: Los pasos detallados para obtener la densidad de localización se describen en una publicaciónanterior 24. Se encontró que una densidad de localización de una sola molécula entre 0,02 y 0,15 eventos/μm2 era óptima para mSAL.
    6. Si se observan múltiples eventos de unión a anticuerpos superpuestos inmediatamente después de añadir el tampón de imagen o se acumulan localizaciones de moléculas individuales a medida que avanza el registro, abortar la adquisición. Reduce la concentración de anticuerpos por dos veces y repite la adquisición en una nueva muestra. Repite este proceso de reducir la concentración de anticuerpos por 2 veces y reevaluar el número de eventos por unidad de área hasta alcanzar la densidad deseada de eventos de localización de molécula única.
      NOTA: Los eventos superpuestos se manifiestan como múltiples puntos grandes que se vuelven más brillantes o más grandes al unirse a un nuevo anticuerpo dentro del límite de difracción del primer anticuerpo.
    7. Si la densidad del evento es escasa, aumentar la concentración de anticuerpos en el tampón de imagen en 2 veces y repetir la adquisición en una nueva muestra. Repite este proceso de multiplicar por dos la concentración de anticuerpos y reevaluar el número de eventos de unión por unidad de área hasta alcanzar la densidad deseada de eventos de localización de molécula única.
      NOTA: Se recomienda utilizar una muestra nueva para cada ensayo de optimización de concentraciones para evitar posibles interferencias de anticuerpos pre-unidos en evaluaciones posteriores de densidad de localización.
  2. Optimización NII
    1. Configura los parámetros de imagen en el software de adquisición de imágenes para obtener una adquisición de 50 fotogramas (véase el paso 2.12). Pon el NII en 0 (sin retraso).
    2. Prepara el tampón de imagen para la concentración optimizada de anticuerpos del paso 3.1 y añádelo al pozo de la muestra. Empieza la adquisición.
    3. Repite los pasos 3.2.1-3.2.2, ajustando los NII a 1, 3, 5, 10 o 20 s. Realiza cada adquisición en una nueva muestra.
    4. Evalúa la densidad y la escasez de localizaciones de moléculas individuales de la película grabada (véase los pasos 3.1.5-3.1.7). El NII más bajo con la densidad óptima de eventos de molécula única se determina como el NII óptimo.
      NOTA: Puede que la concentración de anticuerpos necesite optimizarse aún más para lograr la densidad óptima de localización de una sola molécula para el NII correspondiente. Consulta el paso 3.1. Informes previos muestran que los NII más largos (10-20 s) fueron más selectivos hacia eventos de unión de mayor densidad, pero extender el NII más allá de 20 s no produjo una mejora adicional23,24. Si ocurren eventos de unión espacialmente superpuestos a medida que avanza la adquisición de la imagen, introduce un paso de fotoblanqueo en intervalos suficientes para eliminar la fluorescencia de los anticuerpos unidos. Por ejemplo, si aparecen eventos superpuestos en el quinto fotograma, aplica fotoblanqueo cada quinto fotofotograma. La aparición de eventos espacialmente superpuestos se describe en la NOTA del paso 3.1.6.

4. Análisis de datos

NOTA: la reconstrucción de imágenes mSAL utiliza el software gratuito NIH, Fiji29, con el plugin ThunderSTORM30 . Fiji versión v1.54r y ThunderSTORM versión 1.3 se utilizaron en este protocolo. El análisis detallado de imágenes ha sido descrito en un protocolo anterior 24. En esta sección, describimos el flujo de trabajo de análisis utilizado específicamente para mSAL. El análisis presentado en este protocolo utilizó una cámara Prime95B sCMOS (número de serie A18B203004) con fotoelectrones por A/D de 0,98 y el nivel base de la cámara de 100. El tamaño del píxel de imagen está configurado a 147 nm.

  1. Establece los parámetros para la reconstrucción en la ventana de Análisis de Ejecución. Los parámetros utilizados para las reconstrucciones de imágenes CD81 mSAL se describen a continuación. La función de Vista previa debe utilizarse para evaluar los eventos de unión de moléculas individuales detectados en el fotograma seleccionado antes de ejecutar el análisis completo.
    Filtrado de imágenes:
    Filtro: Filtro wavelet (B-spline)
    Orden B-Spline: 2
    Escala B-Spline: 4
    Localización aproximada de moléculas:
    Método: Máximo local
    Umbral de intensidad máxima: std(Onda.F1)
    Conectividad: 8-barrio
    Localización subpíxeles de moléculas:
    Método: PSF: Gaussiana integrada
    Radio de ajuste [px]: 2
    Método de ajuste: Máxima verosimilitud
    Sigma inicial [px]: 0,75
    Análisis de ajuste multiemisor: no seleccionado
    Visualización de los resultados:
    Método: Gaussiana normalizada
    Aumento: 7,3
    Frecuencia de actualización [fotogramas]: 50
    Incertidumbre lateral: 20
    NOTA: Los parámetros de prefiltrado se utilizan para mejorar la detección de un solo emisor sobre el fondo. Sirven como puntos de partida, pero deben optimizarse para cada conjunto de datos. Los parámetros aproximados del método de localización y detección se utilizan para eventos de unión de moléculas individuales. Se ha demostrado que el uso de máximos de intensidad local con conectividad de 8 vecindarios proporciona un rendimiento fiable31. Se seleccionó el método gaussiano integrado con ajuste de máxima verosimilitud, ya que es ampliamente utilizado y proporciona una aproximación fiable de la función de dispersión puntual (PSF) en aplicaciones de imagen de moléculaúnica 32,33,34,35. El método de visualización utilizado en este protocolo es Gaussiano Normalizado. Los usuarios pueden seleccionar el método de visualización que mejor se adapte a sus datos. La magnificación se ajustó para dar un tamaño de píxel reconstruido de 20 nm, lo cual es apropiado para la precisión de localización esperada que se puede lograr con marcaje basado en anticuerpos, donde el error de enlace es del orden de ~10 nm. El factor de aumento de 7,3 se calculó dividiendo el tamaño del píxel limitado por difracción por el tamaño de píxel reconstruido deseado (147 nm / 20 nm = 7,3). La frecuencia de actualización determina con qué frecuencia se actualiza la imagen reconstruida durante el procesamiento, pero no influye en el resultado final. La incertidumbre lateral se establece en 20 (pero no forzada) para que la reconstrucción incorpore las incertidumbres de localización calculadas. Para más detalles sobre las opciones disponibles, consulte la Guía de Usuario30 de ThunderSTORM o haga clic en el signo de interrogación junto al campo de entrada.
  2. Comienza el análisis de ThunderSTORM con un sigma inicial de 1,6 píxeles y un radio adecuado de 3. Refinar los parámetros según sea necesario. No se utilizó el ajuste multiemisor, ya que las densidades de eventos se mantuvieron no solapadas en las imágenes limitadas por difracción.
  3. Haz clic en Aceptar para ejecutar la reconstrucción. Una vez completado, la ventana de resultados se abrirá automáticamente.
  4. Utiliza la función Plot histogram para encontrar el pico sigma. Convierte este valor (nm) en píxeles dividiéndolo por el tamaño de píxel de los datos brutos, luego vuelve a ejecutar el análisis ThunderSTORM usando el nuevo valor para sigma inicial y el radio de ajuste establecido a un entero cercano a 3x sigmainicial 30.
  5. Determina la corrección de deriva usando el marcador fiducialseleccionado 24.
  6. Realiza la reconstrucción de la imagen en todo el campo de visión y aplica la corrección de deriva calculada.
  7. Para el post-procesamiento de la imagen, haz clic en la pestaña Filtro de la ventana de resultados. Aplica filtros para eliminar eventos mal localizados. En los resultados mostrados para CD81, se eliminaron eventos con sigma superior a 200 nm e incertidumbre superior a 20 nm. Utiliza la función de histograma gráfico para examinar la distribución sigma y determinar un corte adecuado.
    NOTA: Las localizaciones de molécula única con valores sigma elevados suelen surgir de fluoróforos tenues con bajos conteos de fotones o de emisores superpuestos. También se eliminaron las localizaciones con una incertidumbre superior a 20 nm, ya que una incertidumbre que supera el tamaño final del píxel indica una baja precisión de localización. Para orientación adicional sobre parámetros de filtrado, consulte la Guía de Usuario30 de ThunderSTORM.
  8. Guarda la tabla de resultados con datos de localización de moléculas individuales para análisis posteriores seleccionando Exportar. El archivo exportado estará en .csv formato y se denominará mSAL.csv en este protocolo. Guarda la imagen Gaussiana Normalizada resultante.

5. Análisis de clústeres

NOTA: Durante la sondeación de epítopos, los anticuerpos interactúan con sus objetivos previstos (interacciones específicas) así como con moléculas fuera del objetivo (interacciones no específicas). Dado que mSAL depende de la detección acumulativa de eventos de unión a un solo anticuerpo-antígeno, algunas interacciones inespecíficas contribuyen inevitablemente a la imagen reconstruida. Las interacciones anticuerpo-epítopo presentan huellas cinéticas distintas que, en principio, pueden distinguir la unión específica de la no específica, donde eventos específicos y no específicos se diferencian por sus densidades locales de interacción, en lugar de por la permanencia de una sola molécula multiplicadapor 36. Aquí, se describe un análisis basado en densidad de agrupamiento espacial de aplicaciones con ruido (DBSCAN)37 para eliminar eventos de baja densidad, reteniendo eventos de alta densidad que son más propensos a reflejar una unión específica de anticuerpos. Además, el agrupamiento basado en densidad también puede proporcionar conocimientos cuantitativos sobre la organización espacial a nanoescala de proteínas, especialmente aquellas conocidas por organizarse naturalmente en clústeres, como CD81 en microdominios enriquecidos contetraspanina 38,39,40,41,42. El análisis DBSCAN proporcionado se realizó utilizando MATLAB 2025a. Para usuarios sin acceso a MATLAB, se recomienda realizar análisis DBSCAN similares con alternativas de código abierto como Python o R 43,44,45. El código utilizado en este protocolo puede obtenerse de: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Ejecutando el código
    1. Descarga el archivo MATLAB desde el enlace de GitHub de arriba.
    2. Inicia MATLAB y abre el código. En las líneas 37 y 38, se establezca el número mínimo de puntos (minPTS) y épsilon para los parámetros de agrupamiento. Se utilizaron los siguientes parámetros:
      Células T Jurkat:
      MinPTS: 7
      Épsilón: 60
      Celdas U2OS:
      MinPTS: 7
      Épsilón: 80
      NOTA: Consulte el paso 5.2 para más detalles sobre cómo optimizar estos parámetros.
    3. Establece la ruta del archivo en el software MATLAB en la carpeta que contiene el archivo mSAL.csv reconstruido.
    4. Ejecuta el código haciendo clic en Ejecutar. El código pedirá al usuario que seleccione un archivo. Selecciona el archivo mSAL.csv y haz clic en Abrir.
    5. Los datos agrupados se guardan automáticamente en la carpeta llamada MATLAB Data en la ruta de archivo designada dentro del código. Abre este archivo en ThunderSTORM haciendo clic en Plugins > ThunderSTORM > Importar/exportar > Importar resultados.
    6. Guarda la imagen resultante de microscopía de localización de molécula única.
  2. Optimización de las entradas de agrupamiento
    NOTA: Los dos parámetros de entrada para el algoritmo DBSCAN son el minPTS y el epsilon. Epsilon define el radio alrededor de un punto para establecer su vecindad, mientras que minPTS especifica el número mínimo de puntos dentro de ese entorno necesarios para formar una región densa. Los puntos que cumplen este requisito de densidad se clasifican como puntos núcleo, y sus vecindarios se añaden recursivamente al conglomerado. Los puntos que no cumplen el requisito de densidad pero se encuentran dentro del vecindario de un punto central se etiquetan como puntos de frontera, mientras que todos los puntos restantes se consideran puntos de ruido.
    1. Ejecuta el análisis usando las entradas descritas anteriormente (paso 5.1.2) como punto de partida. Elige un valor minPTS que sea mayor que el número de localizaciones de ruido pero menor que el número de localizaciones en la celda. Después de seleccionar minPTS, ajusta la épsilon para que este número de localizaciones pueda capturarse dentro del radio de vecindad para regiones representativas en la célula.
      NOTA: minPTS y épsilon pueden ajustarse de forma independiente. Un enfoque práctico para seleccionar estos parámetros es examinar primero el diagrama de dispersión de los puntos de ruido fuera de la celda y compararlos con el número de localizaciones observadas en áreas de tamaño similar en la celda.
    2. Evalúa la ventana etiquetada como Figura 2 que muestra los datos agrupados. Si los datos retienen agrupaciones en la célula que contiene el fenotipo esperado con localizaciones minimizadas fuera de la célula, las entradas de agrupamiento son adecuadas.
      NOTA: Los datos agrupados deben conservar la estructura de los datos adquiridos usando mSAL. Si los grupos parecen pequeños, localizados solo en las regiones de densidad muy alta de los datos originales, y excluyen un número significativo de eventos de unión que se correlacionen con el fenotipo esperado, los parámetros de agrupamiento pueden ser demasiado restrictivos. Si la unión inespecífica fuera de la celda no se reduce suficientemente con grandes agrupaciones, los parámetros de agrupamiento pueden ser demasiado inclusivos.
    3. Si los parámetros de agrupamiento son demasiado restrictivos, disminuye el minPTS y aumenta la épsilon para incluir más puntos en los datos agrupados. Si los parámetros de agrupamiento son demasiado inclusivos, aumenta el minPTS y disminuye el epsilon.
    4. Después de ajustar el minPTS y el epsilon, vuelve a ejecutar el código. Repite los pasos 5.2.2-5.2.3 hasta lograr el agrupamiento óptimo.

6. Validación de la unión de anticuerpos a su objetivo

NOTA: Para proteínas de membrana sin morfología bien definida, validar la precisión de las estructuras resueltas puede ser un reto. Para validar la especificidad de los anticuerpos, los usuarios pueden expresar una fusión de proteína fluorescente (FP) de la proteína objetivo. Como comprobación inicial, se puede realizar la tinción convencional por inmunofluorescencia en células que expresan la fusión FP. Para una validación más precisa al evaluar nuevos anticuerpos, se puede realizar mSAL en las células que expresan FP para confirmar que los eventos de unión localizados corresponden al objetivo marcado con fluorescente. Aquí, se describe un protocolo para transfectar celdas U2OS con CD81-mStayGold como ejemplo, lo que permite confirmar que las localizaciones de CD81 mSAL corresponden al CD81 marcado por FP en la superficie celular. Los usuarios pueden sustituir cualquier proteína fluorescente adecuada, siempre que su emisión no se solape con el canal de fluorescencia del anticuerpo que se valida.

  1. Sembra las células U2OS en una lámina de cámara de 8 pozos y crece hasta una confluencia del ~70%. Mantener las células en 200 μL de medio de crecimiento completo (DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v), 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina).
  2. Combina 100 ng del constructo de ADN que codifica la proteína con un reportero fluorescente con 5 μL de Lipofectamina 2000. Vórtice durante 30 s e incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Este estudio utilizó CD81 fusionado con mStayGold. Se emplearon técnicas estándar de clonación molecular para generar plásmidos de ADN, aunque no se describen en este protocolo. El ADN: Las proporciones de lipofectamina proporcionadas están optimizadas para células sembradas en portaobjetos de cámara de 8 pozos y pueden necesitar ajustes según las instrucciones del fabricante para otros formatos de muestra.
  3. Añade 5 μL de solución de ADN/Lipofectamina a las células. Incubar el portaobjetos de la cámara durante 4 horas a 37 °C, complementado con un 5% deCO2 en un ambiente húmedo.
  4. Sustituye el medio por medio de crecimiento completo previamente calentado. Incubar durante > 8 horas a 37 °C suplementado con un 5% deCO2 en un ambiente húmedo para permitir niveles detectables de expresión proteica.
  5. Evalúa los niveles de expresión de fluorescencia en las células utilizando un microscopio de fluorescencia o un generador de imágenes. Se recomienda una eficiencia de transfección del ≥ 30%. Si los niveles de expresión de fluorescencia son subóptimos, optimiza la proporción ADN: Lipofectamina según las directrices del fabricante.
    NOTA: Las células que expresan transitoriamente deben usarse para la validación de anticuerpos en un plazo de 24-48 horas tras la transfección.
  6. Para arreglar las celdas, por favor sigue los pasos 1.2.8-1.2.13.
  7. Almacenar las muestras fijas en 200 μL de DPBS con 5 mM de azida de sodio hasta estar listas para la imagen. Las muestras pueden almacenarse a 4 °C durante hasta 1 mes.
    PRECAUCIÓN: La azida de sodio es agudamente tóxica y puede ser fatal si se ingiere. Usa el EPI adecuado al manipular este reactivo. En caso de contacto con la piel, lava inmediatamente la zona afectada a fondo con agua y jabón. Deshazte del reactivo conforme a las directrices de la institución del usuario y a todas las normativas locales, estatales y federales aplicables.
  8. Sigue los pasos 2.1-2.12 para montar el microscopio y montar la muestra. Identifica una célula que expresa la proteína de interés usando la señal de fluorescencia.
  9. Para referencia, captura una imagen TIRF de la célula. Si se utiliza una proteína fluorescente en el mismo canal de imagen que el anticuerpo mSAL, realiza un fotoblanqueo de la proteína fluorescente. Para decolorar la proteína, utiliza la potencia máxima del láser durante > 10 minutos hasta que no se observe señal.
  10. Añade el buffer de imagen preparado al pozo y comienza la imagen. El análisis debe completarse tal y como se describió anteriormente (paso 4).
  11. Abre tanto la imagen reconstruida como la imagen TIRF de la proteína fluorescente adquirida antes de la adquisición del mSAL. Evalúa las localizaciones de unión de anticuerpos mSAL comparando la apariencia y localizaciones de la proteína expresada, representada en la imagen TIRF limitada por difracción, con la imagen mSAL.

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Resultados

La técnica mSAL descrita en este protocolo permite la visualización de eventos de unión de anticuerpos individuales a sus respectivos objetivos proteicos de membrana plasmática, produciendo un mapa de superresolución de la distribución de proteínas de membrana. CD81 se utiliza aquí como ejemplo representativo, aunque el enfoque es fácilmente adaptable a otras proteínas de membrana.

Inmovilizar las células T de Jurkat con suficiente espacio entre células garant...

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Discusión

La organización de las proteínas de membrana plasmática desempeña un papel vital en la regulación de la función celular. Las técnicas convencionales de microscopía de fluorescencia están limitadas por el límite de difracción de la luz, lo que enmascara su organización a escala nanométrica. SMLM supera esta limitación al alcanzar resoluciones espaciales de 10-20nm 47, lo que permite la caracterización de sus ensamblajes a nanoescala 10,48,49...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

La investigación publicada en esta publicación contó con el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R35GM146786 y la Facultad de Artes Liberales y Ciencias de la Universidad de Illinois Chicago. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo anti-CD81 Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificMA5-44132Anticuerpo de imagen
Centrífuga de mesaEppendorf5424
Albúmina sérica bovinaMilliporeSigmaA7906-100G
Vidrio con tapa con cámara, 8 pozosCellvisC8-1-N
Medios DMEMThermo Fisher Scientific11960069
Suero tamponado con fosfato de DulbeccoThermo Fisher Scientific14190-144
Suero fetal bovinoMilliporeSigmaF0926-500ML
Glutaraldehído, 10 %Ciencias de la Microscopía Electrónica16120
Coloides de oro, 100 nmTed Pella15711 y menos; 20Marcador fiduciario
Aceite de inmersión  Laboratorios Cargille16245
Microscopio invertido  equipado con módulo TIRFInstrumentos NikonEclipse Ti2-EMicroscopio
Línea celular Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLCeldas de suspensión
Lanzamiento láser, 6 líneasOxxiusL6CC-CS8-1511Láser de excitación
Lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific11668019Reactivo de transfección
Tubo microcentrífuga, 1,5 mL VWR89000-028
Software de imagen de microscopíaInstrumentos NikonInvestigación Avanzada de NIS-ElementosSoftware de adquisición de imágenes
Objetivo, 100x/1.49 CFI APO TIRF Instrumentos NikonMRD01991Objetivo de microscopio
Paraformaldehído, 16 %Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140-122Antibióticos
Solución de poli-L-lisina, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Cámara Prime 95B sCMOSSoluciones de visión Teledyne01-PRIME-95B-R-M-16-CCámara
Medios RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093Medios para celdas de suspensión
Azida de sodioThermo Fisher Scientific19038-1000
Borohidruro de sodioMilliporeSigma213462-25G
Frascos de cultivo T25Thermo Fisher Scientific169900
Microesferas TetraSpeckMarcador fiduciario
Plato de cultivo de tejidos, 100 mm Corning353003
Línea celular U2OSATCCHTB-96Células adherentes

Referencias

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