Microscopía de localización de moléculas individuales de proteínas de membrana utilizando marcaje de anticuerpo único

Summary

Este protocolo describe el marcaje de anticuerpo único (SAL) para resolver la organización espacial a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática. Al aprovechar las interacciones acumulativas anticuerpo-epítopo a nivel de molécula única, el SAL de membrana (mSAL) mapea las distribuciones locales de epítopos mientras captura simultáneamente el comportamiento de unión de anticuerpos en el entorno celular nativo.

Abstract

La membrana plasmática define la forma celular y actúa como la interfaz que gobierna la comunicación intercelular. Las proteínas de membrana constituyen una clase principal de objetivos terapéuticos; Por lo tanto, la superresolución de la membrana celular a través de sus proteínas constitutivas tiene un gran potencial para avanzar en la biología celular y la terapéutica de anticuerpos. En este sentido, la microscopía de localización de molécula única (SMLM) permite la visualización a nanoescala de organizaciones proteicas en estructuras biológicas. A pesar de su importancia, aplicar SMLM a proteínas de membrana plasmática presenta desafíos únicos. En este protocolo, presentamos un enfoque eficaz utilizando marcaje de anticuerpos únicos en lapso de tiempo (SAL) denominado SAL de membrana (mSAL). Proporcionamos instrucciones detalladas paso a paso, incluyendo la optimización de la concentración de anticuerpos, la densidad de potencia del láser, la duración de los intervalos sin iluminación, la reconstrucción de imágenes y el análisis de conglomerados basados en densidad, para resolver la distribución nanométrica de proteínas de membrana y la morfología de membranas. Utilizamos la proteína tetraspanina CD81 como proteína de membrana modelo para demostrar la capacidad de mSAL tanto en células adherentes como en células mamíferas en suspensión. Además de super-resolver la membrana celular y las distribuciones de las proteínas de membrana, nuestra técnica permite investigar la farmacodinámica de los anticuerpos terapéuticos que interactúan con sus dianas de membrana en el entorno de membrana nativa.

Introduction

La membrana plasmática contiene una amplia variedad de proteínas que regulan la movilidad celular, la adhesión, la detección y la comunicación intercelular. Comprender la distribución a nanoescala de las proteínas de membrana plasmática es importante, ya que la función de las proteínas suele estar gobernada no solo por los niveles de expresión, sino también por su organización espacial en la^{membrana 1,2}. Cabe destacar que muchos anticuerpos terapéuticos se dirigen a las proteínas de^{membrana 3,4}, lo que hace que las inv....

Protocol

Este protocolo utiliza las líneas celulares Jurkat E6.1 y U2OS establecidas y no involucra materiales humanos o animales vivos primarios.

1. Siembra/aterrizaje celular y fijación

NOTA: La preparación de la muestra sigue los protocolos estándar de tinción por inmunofluorescencia (IF), optimizados para preservar la organización subcelular de las proteínas de membrana plasmática en diferentes tipos celulares. Si existe un protocolo de inmunotinción establecido para el objetivo de interés, los usuarios pueden seguir ese protocolo hasta el paso de bloqueo de muestras 1.2.14. El marcaje ....

Results

La técnica mSAL descrita en este protocolo permite la visualización de eventos de unión de anticuerpos individuales a sus respectivos objetivos proteicos de membrana plasmática, produciendo un mapa de superresolución de la distribución de proteínas de membrana. CD81 se utiliza aquí como ejemplo representativo, aunque el enfoque es fácilmente adaptable a otras proteínas de membrana.

Inmovilizar las células T de Jurkat con suficiente espacio entre células garant.......

Discussion

La organización de las proteínas de membrana plasmática desempeña un papel vital en la regulación de la función celular. Las técnicas convencionales de microscopía de fluorescencia están limitadas por el límite de difracción de la luz, lo que enmascara su organización a escala nanométrica. SMLM supera esta limitación al alcanzar resoluciones espaciales de 10-20^{nm 47}, lo que permite la caracterización de sus ensamblajes a nanoescala 10,48,49.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpo anti-CD81 Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	MA5-44132	Anticuerpo de imagen
Centrífuga de mesa	Eppendorf	5424
Albúmina sérica bovina	MilliporeSigma	A7906-100G
Vidrio con tapa con cámara, 8 pozos	Cellvis	C8-1-N
Medios DMEM	Thermo Fisher Scientific	11960069
Suero tamponado con fosfato de Dulbecco	Thermo Fisher Scientific	14190-144
Suero fetal bovino	MilliporeSigma	F0926-500ML
Glutaraldehído, 10 %	Ciencias de la Microscopía Electrónica	16120
Coloides de oro, 100 nm	Ted Pella	15711 y menos; 20	Marcador fiduciario
Aceite de inmersión	Laboratorios Cargille	16245
Microscopio invertido  equipado con módulo TIRF	Instrumentos Nikon	Eclipse Ti2-E	Microscopio
Línea celular Jurkat E6.1	MilliporeSigma	88042803-1VL	Celdas de suspensión
Lanzamiento láser, 6 líneas	Oxxius	L6CC-CS8-1511	Láser de excitación
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	Reactivo de transfección
Tubo microcentrífuga, 1,5 mL	VWR	89000-028
Software de imagen de microscopía	Instrumentos Nikon	Investigación Avanzada de NIS-Elementos	Software de adquisición de imágenes
Objetivo, 100x/1.49 CFI APO TIRF	Instrumentos Nikon	MRD01991	Objetivo de microscopio
Paraformaldehído, 16 %	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122	Antibióticos
Solución de poli-L-lisina, 0,01%	MilliporeSigma	P4707-50ML
Cámara Prime 95B sCMOS	Soluciones de visión Teledyne	01-PRIME-95B-R-M-16-C	Cámara
Medios RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093	Medios para celdas de suspensión
Azida de sodio	Thermo Fisher Scientific	19038-1000
Borohidruro de sodio	MilliporeSigma	213462-25G
Frascos de cultivo T25	Thermo Fisher Scientific	169900
Microesferas TetraSpeck			Marcador fiduciario
Plato de cultivo de tejidos, 100 mm	Corning	353003
Línea celular U2OS	ATCC	HTB-96	Células adherentes