La secuenciación transcriptomática identificó quimiocinas patógenas en núcleos en placas ateroscleróticas

Resumen

Este estudio tiene como objetivo analizar los mecanismos subyacentes de los factores inflamatorios asociados a las placas ateroscleróticas (AP) mediante secuenciación de ARN. Los resultados identificaron los genes clave de CCL3, CCL4 y CXCL1 como núcleos inflamatorios en la PA. Estas quimiocinas pueden impulsar la aterosclerosis al promover la acumulación de macrófagos M0 mientras suprimen las células inmunitarias protectoras, revelando posibles objetivos terapéuticos.

Resumen

La placa aterosclerótica (AP) es un tipo de enfermedad inflamatoria proliferativa del tejido fibroso tras la lesión de las células endoteliales y de las células musculares lisas en la pared de la arteria, lo que puede provocar distintos grados de obstrucción del flujo sanguíneo cardiovascular y cerebrovascular. Sin embargo, los enfoques terapéuticos eficaces dirigidos a la inflamación han fracasado en gran medida hasta la fecha, lo que sugiere que aún se necesitan más conocimientos. En este estudio, el objetivo era analizar los cambios transcriptómicos relacionados con factores inflamatorios en la PA mediante secuenciación de ARN (RNA-seq). Se realizó la selectividad por ARN en muestras de pacientes con AP (n = 11) y de individuos control (n = 3). Se identificaron genes diferencialmente expresados (DEGs) usando Metascape, seguido de análisis de enriquecimiento de vías KEGG usando el paquete clusterProfiler en software R, análisis de infiltración inmunitaria usando CIBERSORT y red de interacción proteína-proteína (PPI) usando la base de datos STRING. Los genes hub dentro de la red PPI se identificaron utilizando el plugin CytoHubba. Se identificaron un total de 3713 DEG en el grupo AP, incluyendo 2097 genes regulados al alza y 1616 genes regulados a la baja. Los resultados mostraron que las DEG estaban principalmente enriquecidas en vías relacionadas con el sistema inmunitario e inflamatorio. Tres factores relacionados con la inflamación, CCL3, CCL4 y CXCL1, fueron considerados como genes centrales principales en el proceso patológico de la AP. El análisis de infiltración inmunitaria reveló un microambiente distintivo en la PA, caracterizado por un aumento significativo de los macrófagos M0 junto con reducciones en células T CD8⁺, células NK activadas y mastocitos en reposo dentro de la AP. En conclusión, estos hallazgos procedimentales describen la expresión diferencial de CCL3, CCL4 y CXCL1 y su asociación con una composición alterada de células inmunitarias en la AP, destacando las tres quimiocinas como posibles candidatas para una investigación mecanicista adicional.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) han representado una amenaza seria para la salud humana en^{todo el mundo.} A medida que la tendencia global al envejecimiento de la población se intensifica, la incidencia de ECV también está en aumento². Entre ellas, la placa aterosclerótica (PA) es una de las principales causas de la^{ECV 3}. La PA es una enfermedad inflamatoria crónica, caracterizada por la acumulación gradual de lípidos en la íntima de las arterias y la formación de^{placas 4}. La PA es la base común de eventos cardiovasculares y cerebrovasculares, e afecta principalmente a arterias grandes y medianas, lo que conduce a isquemia y lesiones, y es un factor importante que causa enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares y la muerte⁵. Debido a la falta de síntomas evidentes en las primeras etapas, la AP suele estar avanzada cuando se diagnostica, lo que resulta en una alta tasa de^{mortalidad 6}. El tratamiento de la AP se centra en sus factores de riesgo, incluyendo factores modificables como baja actividad física, sedentario, tabaquismo, problemas de salud mental⁷, y obesidad y diabetes tipo 2 debido a una dieta alta en grasas, así como factores no modificables como genes, edad y^{sexo 8}. Estudios recientes han encontrado que el síndrome metabólico, la homocisteinemia, la hiperuricemia y la resistencia pancreática son factores de riesgo importantes para la aparición y desarrollo de la aterosclerosis ^9,10.

Las teorías relacionadas con la patogénesis de la AP incluyen principalmente las teorías de infiltración lipídica, inflamación, respuesta al estrés oxidativo, infección e interacción entre factores genéticos y^{ambientales 11,12}. Entre ellas, la inflamación y el estrés oxidativo se reconocen como la patogénesis central de la AP y participan en todos los procesos desde la aparición hasta el desarrollo y deterioro de la AP¹³. El daño súbito de la placa inestable de la PA, la activación plaquetaria y la trombosis son una patogénesis importante del infarto de miocardio y el ictus^{hemorrágico 14}. Con investigación continua, se ha comprobado que la AP contiene no solo lípidos, sino también muchas células^{inflamatorias 15}. El tabaquismo, la hipertensión, los trastornos lipídicos, la hiperinsulinemia, la hiperglucemia, el alto nivel de ácido úrico y otros estímulos dañinos inducen a los glóbulos blancos y endoteliales a liberar continuamente moléculas solubles de adhesión y diversas citocinas, y favorecen que los monocitos se adhieran a las células endoteliales vasculares. Las quimiocinas acumuladas conducen además a la migración de monocitos al espacio subendotelial y se diferencian en macrófagos, que luego fagocitan la lipoproteína oxidada de baja densidad (LDL) rica en colesterol dentro del tejido, transformándose así en células espuma e iniciando la formación de estrías^{lipídicas 16}. El daño patológico temprano del SA, es decir, las estrías lipídicas, está compuesto principalmente por macrófagos y linfocitos T, que es una lesión inflamatoria^{típica 17}. Por lo tanto, diversas células inflamatorias y sus productos participan en la iniciación y progresión de AP¹⁸. Sin embargo, el panorama inflamatorio de la PA es complejo e involucra múltiples factores conocidos y potencialmente desconocidos. Los enfoques tradicionales de genes candidatos pueden no capturar todo este espectro de factores inflamatorios.

Para abordar esta limitación, empleamos la secuenciación de ARN (RNA-seq), un método transcriptómico de alto rendimiento sesgado. Este enfoque es especialmente adecuado para estudios que generan hipótesis donde los principales impulsores moleculares no están predefinidos. A diferencia de los métodos basados en genes candidatos o microarrays, el RNA-seq ofrece un rango dinámico más amplio, mayor sensibilidad y la capacidad de detectar transcritos novedosos sin necesidad de un diseño previo de^{sonda 19,20}. Estas características la hacen especialmente adecuada para descubrir firmas relacionadas con la inflamación en la AP, donde la base molecular permanece incompletamente caracterizada.

En este estudio, se realizó RNA-seq para analizar los mecanismos subyacentes de los factores inflamatorios asociados a la PA. Se emplearon herramientas bioinformáticas que empleaban diferentes algoritmos para detectar una serie de DEGs. Posteriormente, se realizaron análisis de enriquecimiento (WGCNA, vía KEGG, mcode, GSEA, análisis génico central) y análisis de interacción proteína-proteína (PPI). Los resultados de este estudio contribuyen a una mejor comprensión del mecanismo patológico molecular subyacente a la PA provocada por la inflamación y desempeñan un papel importante en la búsqueda de nuevos biomarcadores.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Popular de Liaocheng (número de aprobación: 2023014) y se ajustó a los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Los formularios de consentimiento informado fueron firmados por todos los pacientes o sus familias.

Pacientes y muestras

Este estudio analizó retrospectivamente a 11 pacientes con estenosis grave de la arteria carótida que se sometieron a endarterectomía carotídea en el Departamento de Neurocirugía Vascular del Hospital Popular de Liaocheng, provincia de Shandong, China, desde enero de 2023 hasta diciembre de 2023. Estos pacientes fueron inscritos en el grupo de PA. El diagnóstico de estenosis de la arteria carótida se basó en datos de imagen como la TCA o la angiografía cerebral. Los criterios de inclusión para el grupo AP fueron: (1) edad entre 50 y 80 años; (2) tomografía computarizada Angiografía/Angiografía por Restracción Digital confirmó la estenosis de la arteria carótida interna intracraneal ≥70%; (3) puntuación modificada de la Escala de Rankin pre-inicio ≤ 1; (4) consentimiento informado obtenido del paciente o de su representante legal. Los criterios de exclusión fueron: (1) enfermedades inflamatorias o inmunológicas; (2) presencia de trastornos psiquiátricos; (3) presencia de tumores malignos; (4) potencial de embarazo, lactancia o maternidad. Edad emparejada Los pacientes con lesión cerebral traumática grave que se sometieron a donación de órganos en el mismo hospital durante el mismo periodo fueron seleccionados como grupo control (NA; Control normal, n = 3). Los sujetos de ambos grupos fueron emparejados por edad, sexo e índice de masa corporal para eliminar factores de confusión. Los criterios de inclusión para el grupo control fueron: (1) edad entre 50 y 80 años; (2) no hay antecedentes de enfermedad coronaria, estenosis de la arteria carótida u otras enfermedades vasculares sistémicas; (3) consentimiento informado obtenido del representante legal del paciente. Se recogieron muestras de íntima y placa de la arteria carótida del grupo AP durante la endarterectomía carotídea, mientras que las muestras de íntima aórtica se recogieron del grupo control tras la donación de órganos. Los tejidos vasculares y de placa se almacenaron en tanques de nitrógeno líquido para pruebas posteriores. Las características basales de los pacientes con PA se muestran en la Tabla 1.

Preparación de muestras

La extracción total de ARN se extrajo utilizando reactivo TRIzol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN se evaluaron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop ND-2000 a 260 nm y 280 nm (relación A260/A280 entre 1,8 y 2,0). La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% a 100 V durante 30 minutos. Los valores de integridad del ARN (RIN) se obtuvieron usando el bioanalizador Agilent 2100 (se utilizaron muestras con RIN ≥ 7,0 para análisis posteriores). Todos los procedimientos de manipulación de muestras y extracción de ARN se realizaron a temperatura ambiente, salvo que se especifique lo contrario. El reactivo de residuos TRIzol se eliminó según las directrices institucionales de residuos químicos peligrosos.

Secuenciación de ARN

Tras el tratamiento con DNasa I de ARN total, el ARNm se enriqueció utilizando perlas magnéticas de Oligo D (T) y luego se fragmentó en trozos cortos a 94 °C durante 5 minutos. Los fragmentos resultantes de ARNm sirvieron como plantilla, con oligonucleótidos aleatorios como cebador. El ADNc de primera cadena se sintetizó mediante el sistema de transcriptasa inversa M-MuLV a 42 °C durante 50 minutos, seguido de la degradación mediada por RNasa H de las cadenas de ARN. La síntesis de segunda cadena se llevó a cabo utilizando dNTPs dentro del sistema de ADN polimerasa I. El ADNc de doble cadena se purificaba, se reparaban los extremos y se colocaba un voladizo en forma de "A" para facilitar la ligación del adaptador. Se utilizaron perlas AMPure XP para seleccionar fragmentos de ADNc de 250-300 pb, que luego se amplificaron mediante PCR. Posteriormente, los productos amplificados se purificaban para generar la biblioteca final. La secuenciación de bibliotecas se realizó en la plataforma Illumina HiSeq con longitud de lectura de extremo emparejado de 150 pb. Para el control de calidad de datos (QC), los datos en bruto que contenían secuencias adaptadoras o bases de baja calidad se filtraban mediante scripts internos. Debido a errores de secuenciación que pueden surgir del instrumento, la calidad de los datos se evaluó analizando la distribución de las tasas de error de secuenciación (se consideró aceptable la tasa de error < 1%). Además, se determinó la distribución del contenido de la GC. Todos los procedimientos de secuenciación se realizaron a temperatura ambiente, salvo que se indique lo contrario. Los reactivos que contenían productos químicos peligrosos (por ejemplo, tampones de DNasa I) se eliminaron según las directrices de bioseguridad institucional.

Umbrales de control de calidad y solución de problemas

Solo se usaron muestras con RIN ≥ 7.0 y bibliotecas con tamaño de fragmento de 250–300 pb. Se requería un mínimo de 14 millones de lecturas en bruto por muestra, con el 98% en el Q30 ≥. El bajo rendimiento de la biblioteca se resolvió aumentando los ciclos de PCR a 18, pero se prefería 15 ciclos para mantener las tasas de duplicados por debajo del 15%.

Cribado de DEGs

Evaluamos la distribución de los niveles de expresión génica entre diferentes muestras. Se utilizó correlación intermuestral de los niveles de expresión génica para verificar la fiabilidad experimental y la idoneidad de la selección de muestras. Se aplicó el análisis de componentes principales (ACP) para evaluar diferencias entre grupos y la reproducibilidad intra-grupo. Los DEG se identificaron utilizando la base de datos en línea Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). Los DEGs se definieron como aquellos con |log₂(cambio de pliegue) | > 1 y un valor p. < 0,05, que se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis bioinformáticos se realizaron utilizando parámetros por defecto, salvo que se especifique lo contrario. Como punto de control de reproducibilidad intermedia, se generaron gráficos PCA para confirmar que las muestras agrupaban por grupo y no por lote.

Análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)

El análisis KEGG (http://www.genome.jp/) es un enfoque sistemático para evaluar la función génica en el descubrimiento de vías reguladoras biológicas. Este artículo obtuvo por primera vez el ID oficial de conversión de símbolos del gen diferencial de org.Hs.eg (versión 3.12.0). El análisis de rutas KEGG se realizó utilizando el paquete clusterProfiler en el software R (versión 4.2.0). Una p. < 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Un resultado intermedio fue la generación de una lista ordenada de vías enriquecidas con el recuento génico correspondiente y valores p ajustados.

Análisis de redes PPI

Para construir la red PPI y el gen de la clave de pantalla, se empleó la base de datos STRING (versión 11.0, https://string-db.org/). Solo se mantuvieron como estadísticamente significativas las interacciones con una puntuación compuesta superior a 0,9. La red fue visualizada y analizada utilizando Cytoscape (versión 3.10.1), una herramienta de bioinformática de código abierto diseñada para explorar redes de interacción molecular. Los genes hub dentro de la red PPI se identificaron usando el plugin CytoHubba (versión 0.1).

Gen Hub

Los 20 genes clave principales fueron seleccionados por CytoHubba Plugin. El rojo indica niveles altos del gen. El análisis bioinformático de los genes hub por la base de datos en línea Metascape (versión 3.5, http://metascape.org/gp/index) para analizar 20 genes hub antes. El enriquecimiento génico se identificó en las siguientes clases de ontología: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Todos los genes del genoma sirven como fondo de enriquecimiento. Se examinaron los ítems con p. < 0,05, recuento mínimo 3 y factor de enriquecimiento > 1,5.

Método de análisis estadístico

Se utilizó el software estadístico SPSS 25.0 para analizar los datos. Los datos de conteo se expresaron en frecuencia o porcentaje, y la comparación entre grupos se evaluó mediante la prueba de Chi cuadrado. Los datos de medición fueron consistentes con la media ± desviación estándar de la distribución normal, y se utilizó la prueba T para la comparación entre grupos. p. < 0,05 se consideró una diferencia significativa.

Resultados

Análisis de datos de ARN-seq de genes diferenciales en placas ateroscleróticas

Solo se utilizaron muestras con RIN ≥ 7.0 para la preparación de la biblioteca. Las 14 muestras (11 AP, 3 control) superaron este umbral. Todas las muestras se secuenciaron en un solo lote; por lo tanto, no fue necesario ajustar el efecto por lotes. Se generaron una media de 16,8 millones de lecturas en bruto por muestra; Tras el filtrado de calidad, se retuvieron 16,5 millones de lecturas limpias (98%), de las cuales el 91% se asignó de forma única al genoma de referencia humano (HG38). El análisis de DEGs mostró que había 2097 genes regulados al alza y 1616 genes regulados a la baja (|log2FC| >1, P <0,05) en pacientes con placas de aterosclerosis en comparación con controles sanos (Figura 1A). El mapa de calor de los 20 genes diferencialmente expresados con mayor y otra regulación se mostró en la Figura 1B. La secuenciación del ARNseq transcriptoma reveló correlaciones de muestras (Figura 1C). La correlación entre los módulos génicos coexpresados y los fenotipos fue analizada por WGCNA (Figura 1D). El análisis de PCA mostró que había una diferencia significativa entre el grupo NA y el grupo AP (P.< 0,05) (Figura 1E).

Análisis de enriquecimiento KEGG de genes diferenciales

El análisis de enriquecimiento de vías KEGG utilizando el paquete clusterProfiler en el software R (versión 4.2.0) se realizó por separado en los genes expresados de forma diferencial al alza y a la baja en el grupo de la enfermedad (Figuras 2A,B). Los resultados mostraron que estos genes estaban significativamente enriquecidos en vías relacionadas con la inmunidad y la inflamación, como la línea celular hematopoyética, la artritis reumatoide, la adhesión focal, la señalización de integrinas y la vía de señalización de quimiocinas.

Análisis GSEA

El análisis GSEA mostró que los genes centrales del grupo experimental estaban principalmente enriquecidos en la parte superior, mostrando una tendencia a la regulación al alza (Figura 3A). Los genes centrales del grupo control se enriquecieron principalmente en la parte inferior, mostrando una tendencia a la baja (Figura 3B). En resumen, los genes inflamatorios se subieron en el grupo experimental (ASA) y se subieron en el grupo control (NA).

Análisis de redes PPI

En la red PPI analizada usando la base de datos STRING (versión 11.0), los nodos que comparten el mismo ID de clúster tienden a estar posicionados cerca unos de otros. Como se muestra en la Figura 4A, este agrupamiento reveló que los genes correspondientes están principalmente implicados en la regulación de la activación celular, la respuesta inflamatoria y la activación celular. La Figura 4B presentó la misma red coloreada por valores p, donde los grupos que contienen más genes presentan valores p más significativos.

Identificación de genes centrales y análisis de infiltración de células inmunitarias

Se seleccionaron DEGs para el análisis mcode y se mostraron resultados de análisis principalmente relacionados con los receptores de acetilcolina (Figura 5 y Tabla 2). El análisis génico central utilizando el plugin CytoHubba en Cytoscape identificó los 20 genes principales del núcleo, la mayoría de los cuales estaban asociados con la inmunidad y la inflamación (Figura 6A, panel izquierdo). Los 10 genes principales del hub consistían en CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 y CCR5 (Figura 6A, panel derecho). La intersección de genes hub con los genes del panel inflamatorio olink 92 reveló 5 genes comunes, incluyendo CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 y CCL4 (Figura 6B). El análisis de CIBERSORT reveló diferencias significativas en la infiltración de células inmunitarias entre el grupo de la enfermedad y los controles sanos. En comparación con el grupo control, el grupo de enfermedad mostró una proporción significativamente mayor de macrófagos M0 (p < 0,05) (Figura 6C). Por el contrario, las proporciones de células T CD8, células NK activadas y la mayoría de las células en reposo fueron significativamente menores en el grupo de la enfermedad (p. < 0,05 para todos) (Figura 6C).

Análisis funcional de genes hub

Analizamos además la función biológica del gen Hub utilizando la base de datos Metascape, revelando que estos genes están principalmente asociados a la vía de señalización mediada por citocinas y a la señalización mediada por calcio (Figura 7A y Tabla 3). Posteriormente, se utilizaron firmas de tipo celular para enriquecer los factores reguladores transcripcionales del gen hub, mostrando que los genes hub estaban principalmente relacionados con la célula paneth tipo C11 24W del intestino grueso, el macrófago C8 desarrollador de cui y los neurotipos del mesencéfalo manno hmgl (Figura 7B). El análisis de enriquecimiento de enfermedades en la base de datos DisGeNET demostró que los genes hub estaban asociados con lesiones cutáneas, infecciones por el virus de Epstein-Barr y encefalitis tick-bome (Figura 7C). El análisis de enriquecimiento de características tisulares de la base de datos PaGenBase mostró que los genes hub estaban principalmente enriquecidos en el bazo, la sangre y el pulmón (Figura 7D). Además, el análisis de la base de datos TRRUST descubrió que RELA y NFKB1 son los principales factores de transcripción que regulan los genes hub (Figura 7E).

DISPONIBILIDAD DE DATOS:

La matriz de recuento procesada se proporciona como archivos suplementarios (Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2). Todos los demás datos se presentan íntegramente en el artículo. Los datos de secuenciación en bruto están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Figura 1: Análisis de DEGs. (A) Placas sanas y placas ateroscleróticas, mapa diferencial de genes volcánicos, regulado al alza 2097, regulado a la baja 1616 (|log2FC| > 1, P.< 0,05). (B) Mapa de calor de los 20 genes diferencialmente expresados al alza y a la baja con aumento y bajón. (C) Análisis de correlación por muestras. (D)La correlación entre módulos génicos coexpresados y fenotipos fue analizada por WGCNA. (E) Análisis de ACP (grupo NA fue significativamente diferente del grupo AP). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Análisis KEGG. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG se realizó por separado en los genes expresados diferencialmente al alza (A) y a la baja (B) en el grupo de la enfermedad. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Análisis GSEA. (A) El análisis GSEA mostró que los genes centrales en el grupo experimental estaban principalmente enriquecidos en la parte superior, mostrando una tendencia a la regulación al alza. (B) En el grupo control, los genes centrales se enriquecieron principalmente en la parte inferior y mostraron una tendencia descendente. En conclusión, los genes inflamatorios se subieron en el grupo experimental (AP) y se redujeron en el grupo control (NA). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Diagrama de red PPI. (A) Coloreados por ID de clúster, donde los nodos que comparten el mismo ID de clúster suelen estar cerca entre sí. (B) Colorear con valores P, donde los elementos que contienen más genes tienen valores P más significativos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: análisis mcode de los DEGs. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Análisis génico central. (A) Los 20 genes principales del hub (panel izquierdo) y el gen central top 10 (panel derecho) obtenidos mediante el método de cálculo de grados mediante el plugin CytoHubba en CytoScape, que están principalmente asociados con la inmunidad y la inflamación. (B) Intersección de genes hub y panel inflamatorio olink 92 genes identificados 5 genes de intersección. (C) El algoritmo CIBERSORT se empleó para comparar la abundancia de infiltración de 22 subconjuntos de células inmunitarias entre los grupos AP y NA. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7: Análisis bioinformático de genes hub. (A) Anotación funcional de genes hub usando la base de datos Metascape. (B) Análisis de enriquecimiento de reguladores transcripcionales asociados con genes hub basados en firmas de tipo celular. (C) Análisis de enriquecimiento de enfermedades de genes hub realizado con la base de datos DisGeNET. (D) Patrones de expresión específicos de tejidos de genes hub identificados mediante la base de datos PaGenBase. (E) Red reguladora transcripcional de genes hub analizada utilizando la base de datos TRRUST. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

MCODE	VETE	Descripción	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Receptores de acetilcolina nicotínica altamente permeables al calcio	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Receptores de acetilcolina nicotínica presináptica	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Receptores postsinápticos de acetilcolina postsinápticos altamente permeables al calcio	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canales de potasio en dominio de poros tándem.	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	Estabilización del potencial de membrana	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - potencial de membrana en reposo	-9.7

Tabla 1: Las características basales de los pacientes con PA

MCODE	VETE	Descripción	Log10(P)
MCODE_1	GO:0030322	Receptores de acetilcolina nicotínica altamente permeables al calcio	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Receptores de acetilcolina nicotínica presináptica	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Receptores postsinápticos de acetilcolina postsinápticos altamente permeables al calcio	-16.7

Tabla 2: El análisis de enriquecimiento MCODE de los DEGs.

MCODE	VETE	Descripción	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Receptores de acetilcolina nicotínica altamente permeables al calcio	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Receptores de acetilcolina nicotínica presináptica	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Receptores postsinápticos de acetilcolina postsinápticos altamente permeables al calcio	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canales de potasio en dominio de poros tándem.	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	Estabilización del potencial de membrana	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - potencial de membrana en reposo	-9.7

Tabla 3: El análisis de enriquecimiento MCODE del gen hub.

Archivo suplementario 1: Control de la expresión génica (n=3).Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Pacientes (n=10) Gen de la tabla central.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Con el continuo profundizamiento de la investigación sobre la PA, se detectan constantemente nuevas citocinas en la PA, y la inflamación se ha convertido en un factor importante en la génesis y desarrollo de la^{AS 21,22}. La activación de la albúmina puede romper la conexión entre las células endoteliales y la matriz íntima vascular y favorecer que las células endoteliales se desprendan de la vía íntima vascular. Lesión intramuscular vascular^{inducida 23,24}. La inflamación induce la modificación oxidativa del LDL-C, y el LDL-C modificado a su vez conduce al proceso inflamatorio en la íntima de la arteria, acelerando así la formación^{de AP 25}. Las placas inestables pueden eventualmente romperse y causar SCA mediante el uso de causas internas y^{externas 26}. Durante la ruptura de placas, los macrófagos, las células del músculo liso vascular (VSMC) y los linfocitos secretan factores inflamatorios como la interleucina-1 leucocitaria-1 (IL-1), IL-6, el factor de adhesión intervascular-1 y el factor de adhesión intercelular-1. Simultáneamente, la expresión de integrina leucocitaria (CD11b/CD18), un receptor en monocitos y granulocitos, aumenta^27,28. Sin embargo, el mecanismo molecular de la inflamación que conduce a la formación de AP aún está por explorarse.

La aparición y desarrollo de la PA causada por inflamación es un curso complejo de acción multifactorial, cambio multigénico y enfermedad en varias etapas, especialmente estrechamente relacionado con la expresión anormal de muchos genes. En este estudio, el análisis de RNA-Seq y bioinformática reveló que, entre tejidos de control sanos y AP, el gráfico volcánico de los DEGs mostró 2097 genes regulados al alza y 1616 a la baja. Un análisis adicional de enriquecimiento KEGG de los DEGs demostró que los DEGs estaban principalmente enriquecidos en vías relacionadas con el sistema inmunitario e inflamatorio. El análisis génico de núcleo identificó los 10 genes principales de núcleo, que consisten en CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 y CCR5. La intersección de genes hub con los genes del panel inflamatorio olink 92 reveló 5 genes comunes, incluyendo CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 y CCL4. Estos resultados sugieren que los factores relacionados con la inflamación CCL3, CCL4 y CXCL1 pueden desempeñar un papel crucial en el proceso patológico de la AP. El análisis de infiltración inmunitaria reveló un microambiente distintivo caracterizado por un aumento significativo de los macrófagos M0 junto con reducciones en células T CD8⁺, células NK activadas y mastocitos en reposo dentro de placas.

Los macrófagos M0 representan un conjunto no comprometido que puede internalizar fácilmente LDL oxidado y diferenciarse en células de espuma, un evento característico en la aterogénesis^{temprana 29}. La proporción elevada de macrófagos M0 observada en el grupo de la enfermedad apunta a una acumulación de estas células precursoras en el microambiente de placas. CCL4, producido principalmente por macrófagos y células T activadas, actúa como un estímulo persistente que sostiene la activación de los macrófagos a través de la vía de señalización NFκB, promueve la expresión de moléculas de adhesión e induce la metaloproteinasa matricial-2 y -9, facilitando así la transición de los macrófagos M0 hacia un estado pro-aterogénico y comprometiendo directamente la estabilidad de la^{placa 30}. La proporción reducida de células T CD8⁺ puede reflejar la supresión mediada por CCL3 de subconjuntos ateroprotectores de células T. Komissarov et al. demostraron que la migración de células T hacia las placas ateroscleróticas humanas ocurre predominantemente a través del eje CCR5-CCL3³¹. Además, Döring et ^al.32 descubrieron una vía no canónica mediante la cual CCL17 señala a través de CCR8 para inducir la expresión de CCL3, lo que a su vez suprime la diferenciación reguladora de células T; la ablación genética de CCL3 en células T CD4⁺ aumentó los valores de FoxP3⁺ Treg y limitó la aterosclerosis, mientras que la administración de CCL3 agravó la enfermedad y restringió la diferenciación de Treg. Este cambio probablemente disminuye las células T reguladoras CD8⁺ ateroprotectoras mientras promueve células T efectoras patógenas, lo que resulta en la disminución neta de la proporción de células T CD8⁺ observada en nuestro análisis. Las reducciones en células NK activadas y mastocitos en reposo probablemente reflejan alteraciones en el estado de activación más que una pérdida absoluta de estas poblaciones. Bonaccorsi et ^al.33 informaron que las placas carótidas sintomáticas presentan un aumento de la infiltración de células NK y la producción de γ de IFN, lo que vincula directamente la activación de las células NK con la inestabilidad clínica de la placa. Para los mastocitos, Wezel et ^al.34 demostraron que las quimiocinas liberadas por los mastocitos activados, especialmente CXCL1, inducen el reclutamiento de neutrófilos a través del eje CXCL1/CXCR2, agravando así la respuesta inflamatoria en curso y promoviendo la progresión y desestabilización de la placa. Por tanto, la disminución de la proporción de células NK activadas y mastocitos en reposo probablemente refleja su activación, desgranulación o agotamiento dentro del entorno inflamatorio de la placa, más que una verdadera disminución numérica.

Este estudio presenta varias limitaciones. En primer lugar, este estudio se basa únicamente en la secuenciación transcriptómica y está limitado por el pequeño tamaño de la muestra. Más allá del tamaño limitado de la muestra, deben señalarse varias limitaciones técnicas del protocolo RNA-seq. El ARN-seq masivo enmascara la heterogeneidad celular; Se necesitan enfoques de célula única para resolver la expresión específica de CCL3, CCL4 y CXCL1 por tipo celular. La deconvolución inmune computacional (CIBERSORT) proporciona solo estimaciones, no mediciones directas. La abundancia de ARN no siempre se correlaciona con los niveles de proteínas; se requiere validación ortogonal. Futuros estudios deberían abordar estas limitaciones utilizando transcriptómica unicelular, cohortes más grandes e independientes, y validación ortogonal de proteínas.

En conclusión, los presentes hallazgos subrayaron el importante papel de los factores inflamatorios en el proceso fisiopatológico de la PA. Además, identificamos los genes centrales CCL3, CCL4 y CXCL1, que pueden formar una red coordinada de quimiocinas que impulsa la aterosclerosis promoviendo la acumulación de macrófagos M0, suprimiendo subconjuntos protectores de células T y alterando los estados de activación de las células NK y los mastocitos. En general, estos hallazgos destacan las tres quimiocinas como reguladores críticos del microambiente inmune de la placa y posibles objetivos terapéuticos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Extracción de ARN
Nanodrop ND-2000 espectrofotómetro	Thermo Fisher Scientific	ND2000	Detección de concentraciones de ARN
Bioanalizador Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Control de calidad de ARN
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Secuenciación de transcriptoma
Cuentas magnéticas Oligo D (T)	New England Biolabs	S1550S	Enriquecimiento de ARN