Prueba de neutralización de reducción de fluorescencia del virus de la hepatitis E para medir títulos neutralizantes de anticuerpos

Summary

No existe un ensayo estándar de neutralización viral disponible para el virus de la hepatitis E (HEV), un virus de ARN de cadena positiva no citopático. Aquí, se describe una prueba de neutralización de reducción de fluorescencia (FRNT) basada en la cuantificación de la proteína cápside viral marcada con fluorescencia para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-HEV.

Abstract

El ensayo de neutralización viral mide el potencial de neutralización de un anticuerpo o de una mezcla de anticuerpos contra el virus correspondiente. Es una técnica valiosa para evaluar la eficacia de los candidatos a vacuna y los anticuerpos neutralizantes desarrollados contra el virus. La prueba de neutralización de reducción de placas (PRNT) es un método popular para evaluar el título de los anticuerpos neutralizantes específicos del virus. Sin embargo, la PRNT no es factible en el caso de virus no citopáticos. El virus de la hepatitis E (HEV) es un virus de ARN monocadena de sentido positivo, perteneciente a la familia Hepeviridae. Es una de las principales causas de hepatitis viral aguda en todo el mundo. No muestra ningún efecto citopático en el cultivo celular de mamíferos. En China existe una vacuna contra el VH. Sin embargo, en la mayor parte del mundo no existen vacunas ni anticuerpos terapéuticos contra el VHE. Varios laboratorios han estado trabajando en candidatos a vacunas contra el HEV. Un ensayo de neutralización para medir la eficacia de las vacunas contra el VHE será una herramienta muy útil para los investigadores. Aquí describimos una prueba de neutralización de reducción de fluorescencia (FRNT) para estimar el título de neutralización del 50% (NT₅₀) de anticuerpos anti-HEV. Se utilizó el anti-HEV neutralizado en ORF2, o HEV neutralizado en conejo con IgG, para infectar células Huh7, seguido de una tinción inmunofluorescente de la proteína viral ORF2. Las células fluorescentes positivas se cuantificaron en la aplicación ImageJ, y se estimó que NT₅₀ era de 2,1 x 10³. Este método puede aplicarse para estimar el NT₅₀ de anticuerpos anti-HEV presentes en soros de ratones inmunizados, soros individuales recuperados con HEV y anticuerpos anti-HEV producidos en laboratorio.

Introduction

El virus de la hepatitis E (HEV) es un virus de ARN monocadena de sentido positivo que pertenece a la familia Hepeviridae ^1,2. Normalmente causa hepatitis aguda autolimitada, pero puede causar hepatitis crónica en personas^{inmunodeprimidas 3,4}. Las mujeres embarazadas tienen un alto riesgo de desarrollar insuficiencia hepática fulminante, con una tasa de mortalidad que puede aumentar hasta el 30^%. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó de unos 19,47 millones de casos de hepatitis aguda E (AHE) y 3450 muertes causadas por el VHE a nivel mundial en 2021^. El HEV se transmite en países en desarrollo principalmente a través de alimentos y agua contaminados, debido a la mala sanidad, mientras que las infecciones ocupacionales esporádicas en países desarrollados se asocian con el consumo de carne cruda o poco^{cocinada 6}. El HEV se clasifica en ocho genotipos. El genotipo (g) 1- y g2- HEV infectan exclusivamente a humanos. g3- y g4-HEV tienen una amplia variedad de hospedadores como humanos, conejos, cerdos, jabalíes y ciervos. g5- y g6-HEV infectan jabalíes, mientras que g7- y g8-HEV infectan camellos. Se ha reportado un solo caso de transmisión humana de g7-HEV en Oriente Medio mediante el consumo de carne y leche de^{camello 7,8}. La infección por VHE es mayormente común en países de ingresos bajos a medios. Se han reportado varios brotes transmitidos por el agua en regiones endémicas del sur y sudeste asiático, África y México, causados principalmente por la infección por diabetes tipo g1 y, con menor frecuencia, por la infección por virus por VIH (g2). Los casos de infección ocupacional esporádica en países desarrollados de Europa y Asia Oriental son causados principalmente por el g3-HEV ^6,7.

El genoma HEV es un ARN de cadena más de 7,2 kb que contiene una cápsula de 7-metilguanina en el extremo 5′, tres marcos de lectura abiertos (ORFs) seguidos de un extremo 3' poli-adenilado. ORF1 codifica la poliproteína no estructural, compuesta por siete dominios distintos: metiltransferasa (Met), dominio Y, proteasa cisteína similar a Papain (PCP), dominio V, macrodominio (dominio X), helicasa (Hel) y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). ORF2 codifica la proteína de la cápside, responsable del ensamblaje de la cápside viral. ORF3 codifica una fosfoproteína que actúa como viroporina y ayuda en la salida^{viral 9}. Un marco de lectura abierto adicional, ORF4, está presente en el g1-HEV, que se traduce mediante un mecanismo independiente de la tapa, usando un elemento interno similar al sitio de entrada del ribosoma situado dentro del ORF1. La expresión de ORF4 se potencia mediante compuestos inductores de estrés en el retículo endoplásmico. Se ha propuesto ORF4 para promover el ensamblaje complejo de replicación^{g1-HEV 10}.

Aunque el HEV no se replica eficazmente in vitro, algunas cepas del virus, aisladas de pacientes con hepatitis E, se propagaron con éxito en hepatocitos, línea celular pulmonar y línea celular epitelial^{del colon 11}. Sin embargo, es difícil propagar el virus de forma robusta en las células cultivadas. El clon infeccioso de cDNA de g1-HEV (cepa Sar55) se ha utilizado para estudios in vitro, pero hasta ahora no se ha logrado la producción y propagación eficiente de cepas de g1-HEV en células cultivadas. Algunas cepas de g3- y g4-HEV crecen mejor en células^{cultivadas 12}. No obstante, el virus purificado producido a partir de células transfectadas con ARN genómico HEV transcrito in vitro y con capo p6 no es suficiente para múltiples ensayos. Además, todas las partículas de HEV producidas por cultivos celulares están cuasi-envueltas, lo que afecta a su infectividad. En cambio, el HEV que se encuentra en alimentos y agua contaminados no está envolto y es altamente infeccioso. El HEV presente en las heces del paciente no está envolto y es la fuente común de infección natural. Por ello, el uso de HEV purificado de las heces del paciente garantiza una infección eficiente en el sistema de cultivo celular de mamíferos. Nuestros estudios anteriores han demostrado la fiabilidad del g1-HEV purificado por heces del paciente para cuantificar la replicación viral en células hepatomáticas humanas (Huh7). El virus purificado almacenado en -80 °C mantiene la infectividad durante varios años, y se ha utilizado en múltiples estudios independientes para estimar la replicación^viral 10,13,14,15. Este estudio diseñó un ensayo de neutralización de HEV utilizando g1-HEV purificado obtenido de un paciente. El virus fue purificado, titulado, caracterizado y almacenado en alicotas a -80 °C para su uso futuro en ensayos de neutralización. Dado que el HEV no es citopático, el método tradicional PRNT no es útil para estimar el potencial de neutralización viral de los anticuerpos anti-HEV. Hubo varios intentos de desarrollar ensayos de neutralización para HEV, incluyendo un ensayo de neutralización basado en citometría de flujo, un ensayo de neutralización ELISA basado en kits de antígenos para detectar pORF2 secretado en supernadantes celulares, un ensayo de unión in vitro basado en ELISA, un ensayo basado en RT-PCR y un ensayo de neutralización basado en^{fluorescencia} 16,17,18,19,20 . Un ensayo basado en ELISA detecta indirectamente la unión de anticuerpos para evaluar la neutralización funcional del virus, pero no puede medir la infección real. El método basado en citometría de flujo suele medir el porcentaje de células infectadas que utilizan un pseudovirus. El método de neutralización basado en RT-PCR es más complicado que el FRNT; Por lo tanto, las probabilidades de errores de manejo son mayores. Por otro lado, el método FRNT descrito aquí está limitado por la disponibilidad de virus infecciosos de alto título y capacidades de imagen. No obstante, es un método eficaz para medir NT₅₀ de anticuerpos anti-HEV.

Protocol

Se obtuvo la aprobación del comité de ética institucional (IEC) para recoger una muestra fecal de un paciente infectado con HEV ingresado en el Departamento de Gastroenterología del AIIMS, Nueva Delhi. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes participantes en el estudio. Los detalles de los reactivos y del equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento y cuantificación de virus

1. Con consentimiento informado, obtener la muestra fecal de un paciente infectado con HEV para la purificación del virus.
2. Resuspende la muestra fecal en la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco a la concentración final (p/v) del 10% y centrifuga a 7800 x g durante 1 hora a 4 °C.
   NOTA: Utiliza guantes al manipular la muestra fecal de HEV y limpia la zona de trabajo con etanol al 70% después del trabajo (realiza todos los pasos dentro de un armario de bioseguridad).
3. Recoge el sobrenadante y pásalo por un filtro de 0,45 μm.
4. Añadir un 8% de PEG6000 preparado en 0,4 M NaCl al sobrenadante viral e incubar durante 16 horas a 0 °C.
5. Centrifuga la muestra a 18.000 x g durante 30 minutos a 4 °C.
6. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en 40 mL del Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco.
7. Concentra la suspensión a un volumen de 5 mL mediante filtración de flujo tangencial (TFF) usando un cartucho de membrana de 30 kDa. Filtra a través de un filtro de 0,2 μm dentro del armario de Bioseguridad, haz alicuotas y guárdalo a -80 °C. Utiliza una sola aliteracia para aislar el ARN total y realizar RT-qPCR.
8. Utilizar múltiples diluciones de plásmido pSK-HEV2 [vector pBluscript que contiene cDNA de un clon infeccioso de g1-HEV (ID Genbank: AF444002.1)] (1 ng a 0,000001 ng ADN/reacción a dilución serial 10x) para trazar un estándar para la cuantificación de ARN viral.
9. Grafica el gráfico con la cantidad de ADN pSK-HEV2 en el eje X y los valores Ct correspondientes en el eje Y. Extrapola la concentración de ARN viral a partir del gráfico estándar.
10. Cuantifica el nivel de ARN genómico del HEV a partir del gráfico estándar y calcula el número de copias genómicas del virus usando la siguiente fórmula: Número de copias = ng*(número/mol) / bases *(ng/g)*(g/mol de bases).

2. Infección de células Huh7 con g1-HEV

1. Toma un matraz T75 que contenga células Huh7. Comprueba bajo el microscopio si las células están confluyentes y sanas.
2. Retira el medio mediante aspirador (realiza todos los pasos en el armario de bioseguridad). Añade 10 mL de DPBS, haz girar y retira.
3. Añade 1 mL de solución de tripsina al 0,05%, asegurando que se distribuya uniformemente en la superficie.
4. Incuba dentro de una incubadora de_CO-2 durante 30–60 segundos, hasta que las células estén desprendidas al 90%.
5. Añade 5 mL de medio completo, extiéndelo uniformemente por toda la superficie del T75 y pipete varias veces para lograr una población unicelular uniforme, libre de agregados.
6. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico de 50 mL, centrífuga a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Aspira el medio de cultivo desde el tubo cónico dentro del armario de bioseguridad.
8. Añade 5 mL de medio completo al tubo y suspende las celdas a una suspensión uniforme mediante pipeteo suave.
9. Toma 10 μL de suspensión de celdas y colócalos sobre una lámina de contracarga. Cuenta las celdas en 4 cuadrantes, calcula la media/mL.
10. Semilla 0,5 x 10⁶ celdas/pozo de una placa de 6 pozos en 2 mL de DMEM (suplementado con un 10% de FBS).
11. Al día siguiente, retirar el medio, lavar 1 mL de DPBS y añadir 50 μL del virus g1-HEV (equivalente a 4,5 × 10 copias^genómicasde 4 del g1-HEV purificado) en 1 mL de medio libre de suero (SFM).
12. Incubar las células en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 1 hora.
13. Lava las células con 500 μL de DPBS y luego añade 2 mL de medio completo (DMEM suplementado con 2% de FBS).
14. Incubar las células durante 72 horas en una incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C.
15. Procedan a los ensayos aguas abajo.

3. Ensayo RT-qPCR

1. Retira el medio de crecimiento de la placa de 6 pozos (del paso 2.15) y lava las células con 1 mL de DPBS.
2. Añade 1 mL de reactivo TRI directamente a la placa de 6 pozos para lisar las celdas. Pipetear el lisato varias veces arriba y abajo, luego transfiere a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
   NOTA: El reactivo TRI es tóxico si se inhala, se ingiere o si entra en contacto con la piel. Usa guantes protectores mientras usas el reactivo y evita respirar vapores. Preferiblemente, úsalo dentro de la capucha química. Todo el material plástico debe ser de grado libre de ARN.
3. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos. Añadir 0,2 mL de cloroformo, tapar bien el tubo y luego usar un vórtice durante 10–15 s (el cloroformo es peligroso y tóxico; manejarse con el EPI adecuado). Incuba durante 2–3 minutos.
4. Centrifuga las muestras durante 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C. Transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Añade 0,5 mL de isopropanol a la fase acuosa y mezcla bien invirtiendo el tubo varias veces.
5. Incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
6. Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 × g a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
7. Resuspende el pellet en 1 mL de etanol al 75%. Centrifugar durante 5 minutos a 7500 × g a 4 °C. Descarta el sobrenadante.
8. Seca al aire el pellet de ARN durante 5–10 minutos.
9. Suspende el pellet en agua libre de nucleasa (NFW) de 50 μL, incuba a 55 °C durante 10 minutos, mezcla con golpes manuales y mide la concentración de ARN mediante espectrofotometría.
10. Realiza la RT-qPCR de un solo paso basada en sondas TaqMan usando los siguientes cebadores:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    sonda g1-HEV: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; Ribonucleasa P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP Probe: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG[BHQ1]3′.
11. Calcular la cuantificación relativa del ARN g1-HEV utilizando el método 2^−ΔΔCT .

4. Ensayo de inmunofluorescencia (IFA)

1. Divide las celdas de Huh7 como se describió en los pasos anteriores.
2. Coloque el engobe de vidrio de grado microscopico en una placa de 12 pozos y sembre 0,2 ×^{10 6} celdas/pozo en un medio completo de 1 mL (DMEM suplementado con FBS al 10%).
3. Infectar las células con copias de 1,8 × 10⁴ genomas del g1-HEV purificado en 500 μL SFM. Incubar las células en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 1 hora.
4. Lava las células tres veces con 500 μL de DPBS.
5. Añade 2 mL de soporte completo (DMEM complementado con un 2% de FBS).
6. Incubar las células durante 72 horas en incubadora de 5% CO₂ , 37 °C.
7. Lava las celdas tres veces con 500 μL de DPBS, incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente entre cada lavado.
8. Añade 500 μL de PFA al 4% (Paraformaldehído) a las células e incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: El 4% de PFA es perjudicial si se inhala, causa irritación de la piel y los ojos, y puede provocar una reacción alérgica cutánea. Por seguridad, usa guantes protectores y protección ocular mientras usas el reactivo y evita inhalar vapores.
9. Lava las células con 500 μL de DPBS, tres veces durante 5 minutos cada una, e incuba en DPBS durante 30 minutos.
10. Añadir 250 μL de solución bloqueadora (5% Suero normal de cabra, 0,5% BSA, 0,3% Triton X-100 en DPBS) a las células e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente (RT).
11. Retirar la solución bloqueante, lavar una vez con 500 μL de DPBS e incubar las células con 250 μL de anticuerpo primario (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Suero normal de cabra, dilución 1:500 de anticuerpo anti-ORF2 o IgG de conejo), durante la noche a 4 °C.
12. Lava las células con 500 μL de DPBS tres veces durante 5 minutos cada una.
13. Incubar las células con anticuerpos secundarios (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Suero normal de cabra, dilución 1:1000 del anticuerpo anticonejo Alexa fluor 594) durante 1 hora en RT.
14. Lava las células tres veces con DPBS durante 5 minutos cada una. Añade 10 μL de reactivo antifade de oro Prolong con solución DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) al portaobjetos de vidrio. Montar las celdas que contienen la cubierta, con las celdas orientadas hacia la solución DAPI en portaobjetos de vidrio, evitando burbujas de aire.
15. Sella la cubierta con pintura para uñas.
16. Adquiere imágenes fluorescentes en un microscopio confocal con un objetivo de 60x.
17. Configura el microscopio para la visualización y adquisición de señales fluorescentes.
18. Primero, enfoca los núcleos en la lámina correspondiente a las células simuladas (no infectadas) a 60x de aumento. Ajusta el voltaje umbral y el láser para que no se vea ninguna señal de fluorescencia de fondo. Revisa el portaobjetos de control teñido con anticuerpos (rabbit IgG) y verifica que no haya señal de fluorescencia de fondo.
19. Visualiza las láminas de células infectadas con HEV sin alterar los parámetros anteriores. Adquiere imágenes en 1028 x 1028 píxeles.

5. Prueba de neutralización por reducción de fluorescencia (FRNT)

1. Neutralización viral e infección de células Huh7
   1. Divide las celdas de Huh7 como se describió en los pasos anteriores. Colocar el deslizante de cobertura en una placa de 12 pozos y sembrar 0,2 × 10⁶ celdas/pozo en un medio completo de 1 mL (DMEM + 10% FBS).
   2. Al día siguiente, preparar una dilución serial de 10 veces de anticuerpos (anti-ORF2 e IgG de conejo) en SFM con una concentración inicial de 25 μg/mL en pasos 1:10 hasta^{una dilución} 1:10 5. El volumen final de la dilución debe ser de 100 μL.
   3. Añadir 1,8 x 10⁴ copias genómicas equivalentes al g1-HEV purificado a cada dilución de anticuerpos.
   4. Incubar la mezcla de anticuerpos y virus en incubadora al 5% de CO₂ , 37 °C durante 1 hora.
   5. Retirar la placa de 12 pozos que contiene las celdas Huh7 (sembradas el día anterior) y lavar las celdas con 500 μL de DPBS.
   6. Añade la mezcla de anticuerpos y virus a las células y coloca la placa en una incubadora de CO₂ al 5% a 37 °C durante 1 hora.
   7. Lava las celdas con 500 μL de DPBS.
   8. Añadir DMEM + 2% de medios FBS a las células e incubar la placa en una incubadora de 5% de CO₂ a 37 °C durante 72 horas.
   9. Realizar el IFA como se menciona en la sección 4 (paso 4.7 en adelante).
   10. Adquiere imágenes fluorescentes de 5 campos aleatorios usando un objetivo de 10x en 1028 x 1028 píxeles.
   11. Guarda las imágenes en formato JPEG/TIFF. Cuantifica las manchas fluorescentes usando el análisis ImageJ como se describe a continuación.
   12. Para analizar la imagen en ImageJ, convierte la imagen RGB a una imagen de 8 bits. Haz clic en la imagen > escribe > 8 bits.
   13. Ajusta el umbral de la imagen. Haz clic en la imagen > ajustar > umbral. Selecciona el umbral inferior en 40 y el umbral superior en 255.
   14. Para contar, seleccione Analizar> Analizar partículas. Selecciona resultados de visualización, borra resultados, resume, excluye en los bordes y retornos compuestos. Desseleccionar Añadir al gestor, incluir agujeros y superponer. Pulsa Ok y aparecerá el recuento de puntos fluorescentes.
2. Estimación de NT₅₀
   1. Calcula la % de neutralización de cada dilución usando la siguiente fórmula:
      % Neutralización= 100-[(((células ORF2-positivas en dilución)⁄(células ORF2-positivas en control viral)) X 100]
   2. Calcula NT₅₀ usando la siguiente fórmula:
      log₁₀(NT₅₀) = log₁₀D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log₁₀D2-log₁₀D1)
      Donde, D1 = Dilución en la que % de neutralización es inferior a 50
      D2 = Dilución en la que % de neutralización es superior al 50
      N1= % Neutralización por debajo de 50
      N2= % Neutralización por encima de 50
   3. Calcular el antilog de Log₁₀ NT₅₀ usando la fórmula:
      NT₅₀= 10^{log₁₀(NT₅₀)}
   4. Grafica el gráfico de (media±SD) de todos los campos.

Results

Infección de células Huh7 con g1-HEV y caracterización viral

El g1-HEV fue aislado de una muestra fecal mediante una serie de pasos, como se ilustra (Figura 1A). El número de copias genómicas del g1-HEV purificado se estimó mediante RT-qPCR, seguido de almacenamiento a -80 °C. Para confirmar la infección y replicación viral, las células Huh7 fueron infectadas con equivalentes de 1,8 ×¹⁰ copias genómica...

Discussion

FRNT es un método basado en inmunotinción para estimar el potencial neutralizante de los anticuerpos. Se ha utilizado para estimar valores NT₅₀ para anticuerpos contra múltiples virus, incluyendo el virus del dengue (DENV), el Coronavirus-2 del Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SARS-CoV-2) y el virus de la encefalitis japonesa (JEV⁾23,24,25. En este método, el virus se incuba con un ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos microfugas de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Plato de cultivo celular de 12 pozos	Corning	3512
Agitador incubador de 37 grados	Termo Científica	50163013
4′,6-diamidino-2-fenilindol	Abcam	AB104139	DAPI
Tubo centrífugo de 50 mL	Halcón	352070
Plato de cultivo celular de 6 pozos	Corning	3516
Anticuerpo IgG secundario de harina Alexa 594	Termo Científica	A-11012
Anticuerpo anti-ORF2	Genscript	NA	Sintetizado a medida por Genscript y caracterizado en nuestro laboratorio14
Anticuerpo IgG anticonejo	Genscript	NA
Albúmina sérica bovina	HIMEDIA	MB083	BSA
Microscopio confocal	Olimpo	FV3000
DMEM, glucosa alta	HIMEDIA	AL007A
Suero fetal bovino	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org (Wayne Rasband y colaboradores, NIH, EE. UU.)
Suero normal para cabra	HIMEDIA	RM-10701
Paraformaldehído	HIMEDIA	GRN3660	PFA
Soro tampón de fosfato pH 7,4	HIMEDIA	TL1006	PBS
Polietilenoglicol 6000	SIGMA	81255	PEG6000
Kit de sonda de 1 paso SOLIScript	SOLIS BIODYNE	08-57-00250
Reactivo TRI	Centro de Investigación Molecular	TR118
Triton X100	SIGMA	X100
Tripsina-EDTA	GIBCO	25300-54