Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento, purificación y cultivo de células marginales primarias de la stria vascular del ratón, y para establecer modelos in vitro de estrés oxidativo y senescencia celular para estudiar trastornos de la pared coclear lateral.
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Artículo de método
Aislamiento y cultivo de células marginales primarias de la Stria vascularis en ratones neonatales
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En este artículo
Resumen
Resumen
La estría vascular es una estructura clave en el oído interno responsable de generar y mantener el potencial endococlear (EP), y su disfunción está estrechamente asociada a diversas formas de pérdida auditiva. La stria vascular está compuesta por células marginales, células intermedias y células basales, entre las cuales las células marginales desempeñan un papel central en la generación y mantenimiento de la EP. Por ello, establecer un modelo de cultivo primario in vitro de células marginales es esencial para investigar las características biológicas de la stria vascular y su implicación en trastornos relacionados con la pérdida auditiva.
En este estudio, aislamos y cultivamos con éxito células marginales primarias de la stria vascular de ratones neonatales. Los tejidos estrial se obtuvieron por microdisección, se digirieron con colagnasa tipo II y se purificaron mediante placas diferenciales para eliminar la mayoría de los fibroblastos, con las células cultivadas alcanzando más del 80% de confluencia al día 7. La tinción por inmunofluorescencia demostró una expresión estable de citoqueratina 18 (CK18) y del miembro 1 de la subfamilia Q dependiente de voltaje de potasio (KCNQ1), confirmando el aislamiento exitoso, alta pureza y función fisiológica preservada de las células marginales.
A partir de este modelo, se establecieron modelos in vitro de estrés oxidativo y senescencia celular utilizando peróxido de hidrógeno (H2O2) y D-galactosa, respectivamente. Las células tratadas mostraron niveles significativamente aumentados de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS) y positividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), lo que indica una alta sensibilidad de las células marginales primarias al estrés oxidativo y a estímulos inductores de senescencia. En conjunto, este estudio establece un sistema estable y reproducible para el cultivo y modelización de células marginales primarias de ratón, proporcionando una plataforma in vitro fiable para investigar la disfunción de la stria vascular y mecanismos relacionados.
Introducción
En el sistema auditivo, varios tejidos dentro de la cóclea trabajan en conjunto para convertir ondas sonoras complejas en señaleseléctricas 1. La stria vascular regula la composición iónica de la endolinfa y genera el Potencial Endococlear (EP), manteniendo así la homeostasis coclear y asegurando el funcionamiento normal de las células ciliadas internas y externas. Está compuesto por tres tipos celulares distintos: células marginales, células intermedias y células basales. Las células marginales forman una monocapa epitelial polarizada que se encuentra directamente frente a la endolinfa y está sellada por uniones estrechas. La membrana basolateral de las células marginales está enriquecida con dos transportadores clave de potasio, Na⁺/K⁺-ATPasa y NKCC1, que están implicados en la regulación del transporte de iones sodio y potasio en la stria vascular. Se ha demostrado que la función de Na⁺/K⁺-ATPasa está directamente asociada con la EP 2,3. Los canales K⁺ KCNQ1/KCNE1 se encuentran en la membrana apical de las células marginales y generan un potencial adicional de difusión K⁺ que contribuye a la formación del EP4. Las células marginales están enriquecidas con múltiples proteínas relacionadas con el potasio y actúan como la unidad celular central que impulsa el reciclaje de potasio en la endolinfa coclear. Así, las células marginales son las células clave responsables de generar y mantener la EP.
Se ha demostrado que la estría vascular (SV) desempeña un papel fundamental en la patogénesis de múltiples trastornos asociados con la pérdida auditiva neurosensorial (SNHL), incluyendo la pérdida auditiva relacionada con la edad (ARHL), la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL), la pérdida auditiva hereditaria (HHL) y la pérdida auditiva inducida por fármacos (DIHL). Además, varios otros trastornos auditivos, como la enfermedad autoinmune del oído interno (IDA), la enfermedad autoinflamatoria del oído interno (SIDA) y la enfermedad de Ménière (DM), aunque etiológicamente distintos, también han demostrado en estudios recientes que involucran al SV en sus mecanismos patógenossubyacentes 5,6. Por lo tanto, es esencial establecer modelos celulares fiables para investigar la patogénesis de la pérdida auditiva. Los estudios han demostrado que la reducción de la densidad celular marginal actúa como un fuerte predictor de la EP durante toda la vida murina, mientras que la atrofia de la stria vascular representa una lesión característica temprana enARHL 7,8. El cultivo in vitro de células marginales puede proporcionar un modelo fiable para estudiar la patogénesis de ARHL y explorar posibles objetivos terapéuticos. Más allá de ARHL, estudios recientes han revelado una alta correlación y posible relación subyacente entre la stria vascular y otros trastornos auditivos, lo que sugiere que los modelos celulares marginales in vitro pueden tener aplicaciones másamplias 5,9,10.
Este estudio describe un protocolo para la disección y cultivo de la stria vascular de cócleas neonatales de ratón, seguido de la purificación de células marginales mediante placas diferenciales, proporcionando así un modelo celular fiable para la investigación de patologías relacionadas con la stria vascular.
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Protocolo
Los cachorros de ratón neonatales (P0-3) fueron proporcionados por Biont. Todos los procedimientos experimentales cumplieron con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicadas por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (Publicación del NIH, revisada en 2011) y aprobadas por el Comité de Ética Animal del Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan (WDRM202400019).
1. Esterilización y preparación de materiales
- Prepara las herramientas de disección, incluyendo dos pares de pinzas de microdisección, un par de pinzas estándar, un par de tijeras quirúrgicas y un par de tijeras de microdisección. Esteriliza todas las herramientas con un autoclave y sécalas en un horno a 60 °C durante 4 horas.
- Prepare 100 mL de medio celular epitelial animal (medio EpiCM-a) según las instrucciones del fabricante. Añadir suero bovino fetal (FBS), suplemento de crecimiento de células epiteliales (EpiCGS-a) y solución de penicilina/estreptomicina al medio basal para lograr concentraciones finales de 2% FBS, 1% EpiCGS-a y 1% penicilina/estreptomicina.
- Desinfectar la etapa y la carcasa del estereosmicroscopio con etanol al 75%. Luego, coloca las herramientas de disección autoclavadas y el microscopio desinfectado dentro de un armario de seguridad biológica. Expone todos los objetos a la luz ultravioleta durante 30 minutos para asegurar una esterilidad completa antes de iniciar el procedimiento de disección.
2. Disección y aislamiento del hueso temporal para la recogida del epitelio auditivo
- Eutanasiar a los cachorros neonatales de ratón (P0-3) tras anestesia con isoflurano al 4%, desinfectar con etanol al 75% y realizar decapitaciones sobre hielo. Utiliza otros métodos éticamente aprobados si es necesario.
- Inmoviliza la cabeza, abre el cuero cabelludo a lo largo de la sutura sagital usando tijeras de microdisección, separa el cuero cabelludo bilateralmente y extirpa el cuero cabelludo.
- Divide la cabeza del ratón neonatal por la mitad de la línea media usando tijeras de microdisección. Extrae tejido cerebral con pinzas para exponer los huesos temporales (Figura 1A).
- Observar los huesos temporales bilaterales en la base craneal, eliminar otros huesos innecesarios y conservar el tejido óseo temporal que contiene la cóclea (Figura 1B).
- Transfiere un hueso temporal a una bandeja estéril de 35 mm que contenga la Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) fresca sobre hielo.
- Transfiere el otro hueso temporal bajo el microscopio, asegura el tejido óseo temporal con un par de pinzas y utiliza otro par para realizar una disección contundente del tejido muscular superficial hasta que el anillo óseo semicircular blanco sea visible (Figura 1C). Tras confirmar la posición coclear, continúa la disección roma hacia abajo hasta que se observe tejido coclear translúcido (Figura 1D).
NOTA: Los pasos 2.6-2.7 deben realizarse en hielo. - Utilizando pinzas de microdisección, retira cuidadosamente un pequeño trozo de la pared ósea en el giro apical de la cóclea, inserta suavemente un lado de la pinza en la cóclea y separa la pared ósea del laberinto membranoso. Retira la pared ósea y extiende el tejido laberíntico membranoso en la Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).
- Asegura la membrana basilar con un par de pinzas y separa cuidadosamente la estría vascular con otro par de pinzas. Transfiera a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL que contiene 1 mL de solución de colagénasa tipo II de 1 mg/mL colocada sobre hielo (Figura 1F).
- Repite los pasos anteriores para extraer la stria vascular del otro lado.
3. Desagregación enzimática para obtener células marginales de la stria vascular
- Incubar el tubo de microcentrífuga que contiene el tejido extraído en una solución de colagenasa tipo II de 1 mg/mL a 37 °C durante 30 minutos.
NOTA: La solución de colagénasa tipo II se preparó diluyendo colagénasa tipo II en solución salina tamponada con fosfato (PBS; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mMNa 2HPO 4). - Centrifuga el tubo a 300 × g durante 8 minutos.
- Quita cuidadosamente el sobrenadante. Añade 1 mL de medio de cultivo para terminar la digestión, tritura suavemente para volver a suspender las células y centrifuga de nuevo a 300 × g durante 8 minutos.
- Aspira el sobrenadante y añade 1 mL de medio fresco para cultivo. Triturar para obtener una suspensión de célula única, transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL y añadir medio adicional para ajustar el volumen total a 10 mL.
- Mezcla la suspensión de la celda a fondo pipeteando repetidamente, luego transfiere 1 mL de la suspensión a cada pozo de una placa de 6 pozos. Cultivar las células en 2 mL de DMEM suplementados con 2% de FBS, 1% de EpiCGS-a y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C en una incubadora de 5% deCO-2 .
- Cambia el medio diariamente y monitoriza el estado de la celda. El crecimiento agrupado de células marginales puede observarse típicamente 2 días después del placaje.
4. Purificación de células marginales
- En el tercer día de cultivo, observa la aparición de numerosos fibroblastos en forma de huso que rodean los grupos de células marginales en forma de adoquines (Figura 2B).
- Aprovechando las diferencias en las tasas de adherencia, se pipetea suavemente para eliminar parcialmente los fibroblastos en forma de husillo. Usando una pipeta de 1 mL, enjuaga suavemente la solución salina balanceada de D-Hanks sobre grandes áreas en cada uno de los cuatro cuadrantes. Monitoriza la purificación celular bajo un microscopio y ajusta la fuerza y dirección de la pipeteación en consecuencia. Generalmente, el lavado en grandes áreas se realiza dos veces. Después de cada ronda, examinar la densidad de fibroblastos microscópicamente; A partir de estas observaciones, se aplica pipeteo suave localizado en áreas densamente pobladas de fibroblastos para lograr una distribución escasa y uniforme en todo el plato de cultivo.
NOTA: Se mantuvo una densidad adecuada de fibroblastos, ya que la eliminación completa o una purificación excesiva pueden restringir el crecimiento de las células primarias. Recomendamos mantener una proporción aproximada de 2:1 de células marginales respecto a fibroblastos. - Cesar la purificación cuando los fibroblastos aparecen dispersos entre los grupos celulares marginales bajo examen microscópico. Quita el sobrenadante y añade 2 mL de medio fresco para cultivar para continuar el cultivo.
5. Tinción por inmunofluorescencia
- En el segundo día tras la purificación, examina la morfología celular bajo el microscopio. Al observar la formación adecuada de grupos celulares y la densidad adecuada, aspirar el medio de cultivo y lavar las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4).
- Fija las células con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar la solución fijadora, lava las células tres veces con PBS (5 minutos por lavado).
- Permeabiliza las células con 0,5% de Triton X-100 durante 15 minutos. Retira la solución y lava las células tres veces con PBS (5 minutos por lavado).
- Bloquea las células con PBS que contenga un 10% de suero de cabra durante 30 minutos a temperatura ambiente.
- Incubar células con anticuerpo monoclonal anti-ratón CK18 de conejo (diluido 1:300 en PBS con suero de cabra al 3%) o anticuerpo KCNQ1 (G-8) (diluido 1:100 en PBS con suero de cabra al 3%) durante la noche a 4 °C.
- Lava las células tres veces con PBS (10 min por lavado). Incubar con el anticuerpo secundario correspondiente (diluido 1:300 en PBS que contenga suero de cabra al 3%) durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Elimina el anticuerpo secundario y lava las células tres veces con PBS (10 minutos por lavado).
- Aplicar 1-2 gotas de medio de montaje antifade que contenga DAPI sobre las láminas, montar los cubrecubrientes y examinar las muestras usando un sistema de escaneo láser confocal.
NOTA: Excepto los pasos de lavado, se añadieron todas las soluciones de incubación, incluidos los anticuerpos, en volúmenes suficientes para cubrir completamente las células.
6. Tratamiento H2O 2 y tinción ROS
- Tras 7 días de cultivo, cuando las células marginales han formado una monocapa confluente, inducen el estrés oxidativo mediante tratamiento con 1 mMH 2O 2. Preparar la solución de trabajo de 1 mM diluyendo la solución stock al 30% deH2O2 1:10000 en medio celular epitelial. Incubar los grupos experimentales con esta solución funcional, mientras se trata a los grupos control solo con medio celular epitelial.
- Tras 16 horas de tratamiento, retira cuidadosamente el medio y lava las células con PBS. Evalúa los niveles intracelulares de ROS en células marginales utilizando un Kit de Ensayo de Especies Reactivas de Oxígeno según el protocolo del fabricante.
- Retira el medio de cultivo, luego añade MitoTracker Red CMXRos diluido (un colorante selectivo para mitocondrias) y DCFH-DA a las células, e incuba a 37 °C en una incubadora de cultivo celular durante 30 minutos.
- Lava las células tres veces con PBS (5 minutos cada una), monta las cubiertas y observa las muestras con un microscopio láser confocal de barrido.
7. Tratamiento con D-galactosa y tinción de SA-β-gal
- Tras 7 días de cultivo, cuando las células marginales forman una monocapa confluente, el polvo de D-galactosa se disolvió en un medio EpiCM-a para preparar una solución de trabajo de 40 mg/mL de D-gal. Incubar grupos experimentales con esta solución (2 mL por pozo de una placa de 6 pozos, 48 h, a 37 °C) para inducir la senescencia celular, mientras se tratan los grupos control con el mismo volumen de medio Epi.
- Tras 48 horas de tratamiento, retira cuidadosamente el medio y lava las células con PBS. Evalúa la senescencia celular en células marginales utilizando el kit de tinción SA-β-gal según las instrucciones del fabricante.
- Fija las células con solución fijadora durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el fijador, lava las células tres veces con PBS (5 minutos por lavado).
- Incubar las células con una solución de trabajo de tinción SA-β-gal que contenga un 5% de X-Gal (1 mL por pozo de una placa de 6 pozos) durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada sinCO2.
- Capturar imágenes de tinción de SA-β-gal bajo iluminación en campo claro usando un microscopio.
8. Análisis estadístico
- Para comparar entre grupos tratados con H₂O₂ y grupos control respecto a la intensidad media de inmunofluorescencia de la tinción ROS, y entre grupos tratados con D-galactosa y control respecto a la proporción de células SA-β-gal-positivas, aplicar pruebas t tras evaluaciones de normalidad y logaritaritomo.
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Resultados
Crecimiento y características morfológicas de las células cultivadas
Utilizando este protocolo, establecimos con éxito cultivos primarios de células marginales aisladas de la cóclea murina. En el segundo día de cultivo, la microscopía óptica reveló que las células se habían adherido al sustrato y comenzaban a formar colonias agrupadas (Figura 2Aa). En el día 3, purificamos las células (Figura 2B). Observacion...
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Discusión
Durante décadas, la investigación sobre la pérdida auditiva se ha centrado principalmente en el papel de las células ciliadas sensoriales y sus conexiones sinápticas con las neuronas ganglionaresespirales 11. Numerosos estudios publicados se han dedicado a establecer y optimizar modelos in vitro de cultivo de células ciliadas, que han desempeñado un papel indispensable en la investigación del daño a las células ciliadas, la regeneración y los efectos de f...
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Divulgaciones
Los autores afirman que la investigación no presenta conflictos de interés comerciales ni financieros.
Agradecimientos
Expresamos nuestro agradecimiento al Departamento de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello del Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan (Wuhan, China) y al Instituto de Investigación de Otorrinolaringología-Cirugía de Cabeza y Cuello del Hospital Renmin de la Universidad de Wuhan (Wuhan, China) por su generoso apoyo y ánimo. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación para la Construcción e Incubación de Centros del Servicio Nacional de Salud de China (ZX0000000037), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81700916, 82301294), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hubei (2017CFB242) y el Proyecto de Investigación Científica de la Comisión de Salud de la provincia de Hubei (WJ2017Q005).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo centrífuga de 15 mL | Servicebio | EP-1501-J | Uso para la cultura |
| Plato de cultivo celular de 35 mm | NIDO | 706001 | Uso para disección |
| 4% de paraformaldehído | Servicebio | G1101 | Tinción inmunofluorescente |
| Placa de 6 pozos | Servicebio | CCP-6H | Uso para la cultura |
| Anticuerpo anticonejo conjugado Alexa Fluor 488 | Proteintech | SA00013-2 | Tinción inmunofluorescente |
| Medio de montaje antifade con DAPI | Absenta | abs9235 | Tinción inmunofluorescente |
| Kit de Conteo de Células-8 | Beyotime | C0037 | Uso para el recuento de celdas |
| Colagenasa Tipo II | Biosharp | BS164 | Uso para la cultura |
| Sistema de escaneo láser confocal | Olympus | FV1200 | Tinción inmunofluorescente |
| DCFH-DA | Invitrogen | C2938 | Tinción ROS |
| D-gal | Solarbio | D8310 | Uso para modelado celular |
| EpiCM-a Medium | Sciencell | 4131 | Uso para la cultura |
| Pinzas finas | RWD | F11020-11 | Uso para disección |
| Suero de cabra | Beyotime | C0265 | Tinción inmunofluorescente |
| H2O2 | Mkbio | MM0707 | Uso para modelado celular |
| La solución salina equilibrada de Hank (HBSS) | Biosharp | BL561A | Uso para la cultura |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | Uso para disección |
| Anticuerpo KCNQ1 (G-8) | Santa Cruz | SC-365186 | Tinción inmunofluorescente |
| Microscopio | Olympus | SZX7-1063 | Uso para disección |
| Microscopio | Olympus | IX71 | Utilizado para observar los resultados de la tinción por inmunofluorescencia |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | Tinción ROS |
| Cachorros de ratón neonatal (P0-P3) | proporcionado por BIONT | ||
| PBS | Servicebio | G4202 | Tinción inmunofluorescente |
| Anticuerpo monoclonal anti-ratón CK18 del conejo | Proteintech | 10830-1-AP | Tinción inmunofluorescente |
| Kit de tinción de senescencia β-Galactosidasa | Beyotime | C0602 | Tinción por envejecimiento |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Tinción inmunofluorescente |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
