Parches de matriz de microagujas disolvibles fabricados mediante técnica de colada con disolventes y caracterización esencial de dispositivos biomédicos basados en microagujas

Summary

El presente trabajo pretende servir como una guía práctica que permita a los investigadores preparar sus propios dispositivos DMAP utilizando el método de colada con disolventes, también conocido como micromoldeo, y realizar caracterizaciones básicas.

Abstract

La tecnología basada en microagujas ha revolucionado el campo de la investigación sobre la administración de la piel y la administración transdérmica y hoy en día se considera el enfoque más sencillo para administrar fármacos a través de la piel. El éxito de los parches con microneedle array (MAP) se debe principalmente a su capacidad para anular la función de barrera cutánea que dificulta la entrada de fármacos aplicados tópicamente mediante la perforación indolora de la capa del estrato córneo . Los MAPs disolutos (DMAPs) destacan entre otros tipos de dispositivos basados en MAP por la biocompatibilidad de sus materiales constituyentes, la posibilidad de autoadministración por parte de los pacientes y la ausencia de residuos punzantes generados tras su uso. Los DMAP suelen estar hechos de materiales poliméricos que se redispersan al insertarse en la piel cuando entran en contacto con fluidos intersticiales, liberando su carga. A nivel de laboratorio, los DMAP se fabrican comúnmente mediante el método de colada con disolvente, que implica el uso de moldes maestros negativos de la forma y longitud deseadas de los MAPs, sobre los que se funden dispersiones poliméricas cargadas con fármacos. Posteriormente, se ven obligados a rellenar las cavidades del molde mediante la aplicación de una fuerza centrífuga o presión positiva. Tras secarse, los DMAP se solidifican y se despegan de los moldes maestros, y suelen pasar por varios estudios de caracterización antes de su uso. Estos ensayos suelen incluir el estudio de las propiedades mecánicas de los DMAPs, la determinación del contenido residual de agua, la capacidad ex vivo para penetrar la estructura cutánea, el rendimiento de liberación de fármacos y la evaluación in vitro de la biocompatibilidad.

Introduction

Aunque la administración tópica y transdérmica de sustancias farmacológicamente activas a través y hacia la piel se considera una alternativa prometedora a la administración oral de fármacos, presenta desafíos significativos debido a la función natural de barrera cutánea ejercida por la capa del estrato córneo . Esta limitación afecta especialmente a moléculas grandes, especialmente aquellas con peso molecular >500 Da¹. Además, la difusión pasiva a través de la piel de otras moléculas con propiedades fisicoquímicas específicas, como hidrofilia o lipofilicidad notables, también está restringida. Se han propuesto diferentes estrategias tecnológicas para superar esta barrera, incluyendo iontoforesis, sonoforesis, electroporación, el uso de potenciadores químicos, métodos térmicos y sistemas nanodimensionados. No obstante, los parches de microagujas (MAP) destacan entre ellos por varias ventajas: gran eficiencia en anular la función del estrato córneo , rentabilidad, una experiencia indolora para los pacientes y la posibilidad de autoadministración sin necesidad de personal^{médico 2}.

Los MAPs son dispositivos que contienen proyecciones microdimensionales en forma de aguja que perforan la capa del estrato córneo y evitan la barrera epidérmica. En la literatura se describen varios tipos de MAPs, a saber: MAPs sólidos, recubiertos, disolutivos, hinchados y huecos. Los MAP disolutivos (DMAPs) están compuestos por materiales poliméricos solubles en agua y emplean una estrategia de "pinchar y soltar", lo que explica sus características más interesantes. En particular, se disuelven al insertarse en la estructura cutánea cuando entran en contacto con fluidos intersticiales, liberando su contenido. En comparación con la estrategia de "pincha y parche" realizada por las MAP sólidas, donde se utilizan para crear microcanales dentro de la estructura cutánea que permiten el paso de una^{formulación 3,4} aplicada de forma tópica posteriormente, el enfoque de "pinchazo y solta" no se somete al tiempo que los microcanales permanecen abiertos. La estrategia de "pincha y flujo" requiere la preparación de MAPs huecos, cuya arquitectura es considerablemente más compleja y difícil de fabricar. Otra ventaja de los DMAP es que no generan residuos punzantes tras la aplicación, reduciendo así el riesgo de lesiones por aguja y contaminación biológica. Además, su aplicación simple y mínimamente invasiva permite la posible autoadministración por parte de los pacientes, apoyando su uso en entornos con recursos limitados o geográficamente remotos donde el acceso a personal sanitario formado, infraestructura médica y sistemas seguros de eliminación de objetos punzantes es^{limitado 2}. La comunidad científica centrada en la administración dérmica y transdérmica de fármacos ha recurrido cada vez más a la tecnología MAPs, especialmente a los DMAPs, para superar las limitaciones de las estrategias mencionadas. Aunque la primera publicación sobre MAPs data de los años 80, la tecnología experimentó un gran auge a principios de los 2000. Desde entonces, el número de publicaciones ha crecido exponencialmente, alcanzando actualmente aproximadamente 500 artículos al año^.

Los DMAP suelen fabricarse mediante el método de colada con disolventes o^{micromoldeo 6}. Esta técnica de fabricación se basa en el uso de moldes maestros negativos de la forma y longitud deseadas de los MAPs. Tras fundir dispersiones poliméricas cargadas con fármacos o incluso sistemas de tamaño nanométrico, se aplica una fuerza externa para rellenar las cavidades en forma de microaguja del molde maestro. Una vez secos, los DMAP pueden desmoldearse cuidadosamente despegándolos o disolviendo el molde maestro con un agente químico. Estos moldes maestros están hechos de diferentes materiales, siendo el polidimetilsiloxano (PDMS) el más común, gracias a su flexibilidad y baja adhesividad, lo que facilita el desmoldeado de los DMAP. La preparación de los moldes maestros se realiza típicamente mediante métodos litográficos; sin embargo, ahora existen moldes comerciales PDMS de diversas formas, longitudes y densidades de microagujas.

Aquí se proporciona una guía para la preparación de los DMAP utilizando la técnica de colada con disolvente. En este caso, el proceso se realiza utilizando fuerza centrífuga o la aplicación de una presión positiva. Esto permite un protocolo alternativo de coste eficiente frente a los métodos de fabricación de alto coste de dispositivos biomédicos basados en MAPs, permitiendo que un grupo más amplio de investigadores incorpore los MAPs en su trabajo de investigación relacionado con la piel. Además, la caracterización esencial para fines académicos y de investigación básica que precede a las pruebas in vivo incluye la longitud y geometría de la aguja, la resistencia mecánica a la compresión, el rendimiento de inserción ex vivo , la carga y liberación del fármaco, el contenido residual de agua, la estabilidad, la absorción de fármacos ex vivo y el perfil de seguridad in vitro .

Protocol

Los reactivos y equipos utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación de matrices de microagujas disolutivas por centrifugación

1. Prepara la dispersión coloidal acuosa de los materiales constituyentes de los DMAP disolviéndolos en la cantidad adecuada de agua y removiendo vigorosamente. Dependiendo de los polímeros seleccionados y la concentración, el tiempo de dispersión puede variar. Si es necesario, calienta el agua moderadamente (40-45 °C) para facilitar la dispersión del polímero.
   NOTA: Los polímeros más comunes utilizados para preparar DMAPs son poli(vinil pirrolidona) (PVP), goma karaya, ácido hialurónico (HA), poli(éter vinílico de metilo-ácido alt-maleico) (PMVE-MA), poli(alcohol vinílico) (PVA), carboximetil celulosa (CMC), quitosana, etc.; sin embargo, se puede utilizar cualquier otro material soluble en agua con propiedades óptimas. Para la mayoría de las formulaciones, la concentración de trabajo típica oscila entre el 5% y el 30% en función de la semana. Las concentraciones más bajas generalmente producen DMAP de disolución rápida, mientras que concentraciones más altas producen dispositivos de disolución lenta. Sin embargo, la concentración óptima debe determinarse empíricamente preparando diferentes prototipos de DMAP, ya que depende del peso molecular del polímero, su viscosidad y las propiedades mecánicas deseadas de las microagujas.
2. Deja que los polímeros se remuevan mínimamente durante la noche para lograr una dispersión completa, mientras se eliminan las burbujas de aire.
3. Centrifugar la dispersión polimérica si persisten burbujas de aire (1000 x g; 5 min; 25 °C).
4. Añadir la carga (fármaco o partícula nanodimensionada) a la concentración deseada y remover moderadamente hasta que sea homogénea sin incorporar nuevas burbujas de aire.
5. Desecha los moldes PDMS en placas de 12 pozos. Para ello, acomoda los moldes en los pozos con arcilla para modelar, cemento dental o cualquier material similar.
6. Fundir 50 μL de la mezcla polimérica cargada con fármacos sobre los moldes PDMS y la centrífuga (3000 x g; 5 min; 25 °C). Después, gira las placas 180° y repite el proceso de centrifugación para asegurar el relleno de todas las cavidades en forma de aguja.
7. Elimina cuidadosamente el exceso de dispersión polimérica cargada de fármacos. Utiliza una pipeta para transferir la dispersión polimérica si es líquida; Usa una espátula si es muy viscoso.
8. Repite el proceso de doble centrifugación (paso 1.6) para volver al molde cualquier dispersión polimérica cargada de fármacos que pudiera haberse desbordado durante el paso anterior.
9. Seque la dispersión polimérica cargada de fármacos en los moldes bajo vacío (600 mBar; 30 min; 25 °C).
10. Repite el protocolo al menos dos veces desde el paso 1.6-1.9 para asegurar el relleno correcto de los moldes maestros con la dispersión polimérica cargada de fármacos.
    NOTA: La fuerza centrífuga puede reducirse progresivamente en medio de 500 x g (25 °C) en cada repetición.
11. Prepara una dispersión polimérica altamente concentrada libre de fármaco para fabricar la base del dispositivo DMAP. Esto asegurará que el fármaco presente en la dispersión rellena en las cavidades del moho no vuelva a la placa base.
12. Fundir 50 μL de la dispersión polimérica libre de fármaco sobre los moldes PDMS y extender centrifugando dos veces, incluyendo placas del punto medio, a un giro de 180° (500 x g; 5 min; 25 °C; 2x). Tras la centrifugación, se añaden 100 μL de dispersión a cada molde, seguidos de añadir 50 μL adicionales a la base tras 12 horas.
13. Deja los DMAP en los moldes de PDMS secar durante 3-5 días a temperatura ambiente en un desecador de sellado en seco.
14. Des-molde cuidadosamente los DMAP de PDMS con pinzas o pélalos con cinta de celulosa escocesa (Figura 1).
15. Caracterizar los DMAP fabricados (véase el paso 3).

2. Fabricación de matrices de microagujas disolutivas aplicando presión positiva

1. Procede de forma similar a como se describió en la sección anterior hasta el paso 1.5.
2. Fundir 150 μL de la mezcla polimérica cargada con fármacos sobre los moldes PDMS y colócalos en un tanque de presión.
3. Llena el depósito de presión con aire hasta que alcance una presión de 3-4 bar durante al menos 15 minutos.
4. Elimina cuidadosamente el exceso de dispersión polimérica cargada de fármacos. Para eso, si la dispersión polimérica es líquida, se utiliza una pipeta, mientras que si es bastante viscosa, se la retira con una espátula.
5. Repite la aplicación de presión (pasos 2.2-2.3) para volver al molde cualquier dispersión polimérica cargada de fármacos que pudiera haberse desbordado durante el paso anterior.
6. Seque la dispersión polimérica cargada de fármacos en los moldes bajo vacío (600 mbar; 30 min; 25 °C).
7. Prepara una dispersión polimérica altamente concentrada libre de fármaco para fabricar la base del dispositivo DMAP. Esto asegurará que el fármaco presente en la dispersión rellena en las cavidades del moho no vuelva a la placa base.
8. Fundir 0,2 g de la dispersión polimérica libre sobre los moldes PDMS y aplicar una presión positiva, como se describe en el paso 2.3.
9. Procede de manera similar a como se describió en la sección anterior del paso 1.13.

3. Caracterización de los DMAP

NOTA: En este paso, se realizaron métodos que implican el uso de tejidos cutáneos humanos y/o animales conforme a las directrices institucionales. Además, los métodos que implicaban el uso de muestras de piel animal se llevaron a cabo de acuerdo con el principio de las 3R para la experimentación animal.

1. Visualiza los DMAP usando una microcámara con la ampliación adecuada para distinguir las proyecciones en forma de^{aguja 7}.
   NOTA: Si han sido cargados con un fármaco o tinte coloreado, debe observarse un color diferente entre las puntas y la placa base.
2. Acopla los DMAP a un dispositivo de soporte y visualiza la morfología y longitud de las proyecciones en forma de microaguja mediante microscopía óptica. Hay que observar una estructura de punta afilada. Registra la duración de las proyecciones similares a microagujas con el software adecuado para tu microscopio óptico.
   NOTA: Para medir la longitud de la microaguja mediante microscopía óptica, los MAPs deben mostrarse perpendicularmente a los objetivos. Las mediciones de longitud y la forma de las proyecciones similares a microagujas deben confirmarse mediante Microscopía Electrónica de Barrido.
3. Evalúa las propiedades mecánicas de los DMAP frente a la deformación de las microagujas tras la compresión en una superficie sólida. Para ello, coloca el dispositivo DMAP en un aplicador DMAP disponible comercialmente y comprime el dispositivo contra una superficie plana de acero inoxidable durante 30 s. Tras comprimir, registrar la longitud de las proyecciones similares a microagujas y calcular el porcentaje de deformación comparándolo con la longitud inicial según la siguiente^{ecuación 7}:
   
   Donde, h_o y_{h f} representan la longitud de las microagujas antes y después de la compresión, respectivamente.
   NOTA: Si está disponible, el uso de un analizador de texturas estandariza la fuerza de compresión. En ese caso, una fuerza de 32 N/array imita la fuerza media del pulgar que los pacientes aplican al autoadministrar dispositivos DMAP.
4. Determinar la capacidad preliminar de inserción de los DMAPs mediante un método sustituto de piel artificial basado en láminas termoplásticas hechas de material tipo^{olefina 8}. Para ello, comprime el dispositivo DMAP contra ocho hojas encuadernadas siguiendo las condiciones descritas en el paso 3.4. El número de agujeros creados en cada capa se observa mediante microscopía óptica o utilizando una cámara de microscopio, y se calcula el porcentaje de penetración a diferentes profundidades.
   NOTA: Las láminas termoplásticas comercialmente disponibles suelen tener un grosor de 127 μm.
5. Determinar la capacidad de inserción ex vivo de los DMAP utilizando explantes de piel humana, porcina o de roedor previamente extirpadas y cuidadosamente recortadas. Limpia la explanta de la piel con abundante agua remojándola 1-2 minutos en agua y luego colócala sobre un material de espuma envuelto en papel de aluminio con el lado del estrato córneo hacia arriba.
   1. Proceder con la inserción bajo las condiciones descritas en el paso 3.4. Deja los DMAP insertados en la piel hasta que se disuelvan las puntas de las microagujas. Si los DMAP están cargados con un tinte o fármaco coloreado, el colorado de los lados interno y externo de la piel revela una inserción exitosa de los^{DMAPs 9}. Además, los microcanales pueden observarse mediante análisis histológico de las secciones de^{la piel 7}.
      NOTA: Este paso, que involucra piel humana o animal ex vivo , se llevó a cabo conforme a las directrices y aprobación del Comité de Ética en Investigación Humana y Animal de la Universidad de Valencia. Se obtuvo el consentimiento informado cuando fue aplicable, y todos los experimentos cumplieron con los estándares éticos institucionales y europeos para el uso de tejidos humanos y animales en la investigación biomédica.
6. Determinar el contenido residual de agua mediante análisis termogravimétrico. La pérdida de peso observada hasta 100-110 °C se atribuye al agua^{residual 10}.
   NOTA: Dependiendo de la fuente bibliográfica, el contenido máximo residual permitido es del 5%-10% del peso total para asegurar un secado óptimo de los DMAP.
7. Cuantifique la carga sumergiendo los DMAPs en 5-10 mL de agua (o alternativamente, en un medio acuoso adecuado para el fármaco analizado) a 32-37 °C y cuantificando la cantidad de carga utilizando un método analítico óptimo.
   NOTA: La espectrofotometría UV-Vis se utiliza comúnmente para el análisis de moléculas pequeñas. Para compuestos con límites bajos de detección y cuantificación, se recomienda encarecidamente la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) combinada con detección UV-Vis, fluorescencia o electroquímica. La HPLC junto con espectrometría de masas puede emplearse cuando se requiere una sensibilidad y especificidad excepcionales. La determinación analítica de las cargas de proteínas y anticuerpos se realiza típicamente mediante ensayos de ácido bicinconinico (BCA) e inmunoensayos, como el ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas (ELISA) o Western bloting, respectivamente. Los perfiles de liberación de fármacos se obtienen mediante muestreo (0,2-1 mL) en momentos predeterminados a partir del medio^{acuoso de liberación 11}. Después de cada punto de muestreo, el volumen restado se reemplaza por el mismo volumen de medio de liberación templado para evitar errores relacionados con la autoconcentración de muestras.
8. Evalúa la estabilidad de los DMAP repitiendo los ensayos de caracterización mencionados para asegurar que las características de los DMAP permanezcan constantes durante el periodo de almacenamiento bajo las condiciones diseñadas.
   NOTA: Si la carga es termoestable, los DMAP suelen almacenarse a temperatura ambiente (25 °C). Para los ingredientes activos termosensibles, los DMAP se almacenan a 4 °C. La humedad relativa debe mantenerse por debajo del 30%. La estabilidad de los DMAP se monitoriza rutinariamente durante un periodo de seis meses.
9. Determina la deposición y absorción de la piel ex vivo a través de la piel utilizando un sistema de células de difusión de Franz (FDC). Para ello, prepara la piel como se describe e inserta los DMAP en la estructura de la piel durante 30 s, tal como se describe en el paso 3.6.
   1. Después, pega la cámara donante de FDC a la piel con la cantidad adecuada de cianoacrilato. Cuando esté seca, fije el complejo de cámara donante de piel a la cámara receptora usando pinzas^{apropiadas 12}. Finalmente, proceda con el protocolo de muestreo tal como se describe en el apartado 3.5.
      NOTA: Este paso que involucra piel humana o animal ex vivo se llevó a cabo de acuerdo con las directrices y aprobación del Comité de Ética en Investigación Humana y Animal de la Universidad de Valencia. Se obtuvo el consentimiento informado cuando fue aplicable, y todos los experimentos cumplieron con los estándares éticos institucionales y europeos para el uso de tejidos humanos y animales en la investigación biomédica. Si los DMAP se disuelven lentamente, fíjalos a la piel usando bandas adhesivas quirúrgicas para evitar la auto-expulsión de la estructura cutánea.
10. Evalúa la biocompatibilidad in vitro mediante ensayos de actividad metabólica, como ensayos basados en tetrazolio y resazurina, o pruebas de proliferación, incluyendo ensayos de 5-bromo-2'-desoxiuridina bromodeoxiuridina (BrdU), según las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Las líneas celulares preferidas son queratinocitos, fibroblastos o melanocitos. Las células no expuestas a DMAPs suelen usarse como controles negativos, mientras que las células tratadas con dodecilo sulfato de sodio (SDS) al 1% sirven como controles positivos. La evaluación de biocompatibilidad depende del perfil de disolución de los DMAP. Para los DMAP de disolución rápida (que se disuelven en 24 horas), se utiliza el método basado en extracto, donde el dispositivo se disuelve antes de la exposición celular. Para los DMAP de disolución lenta, se aplica el método de contacto directo, añadiendo el dispositivo directamente a los pozos sembrados. Según la normativa internacional ISO 10993, los resultados de viabilidad celular >70% se consideran no tóxicos.

Results

Los DMAP fabricados deben denotar una apariencia homogénea con una formación exitosa de proyecciones similares a microagujas, como se muestra en la Figura 2A. Cuando una carga de color se carga únicamente en la estructura de microaguja, una pequeña cantidad de fármaco puede contaminar la placa base de los DMAP debido a desbordamientos de las puntas o a una limpieza incompleta antes de fundir la dispersión polimérica libre. Sin embargo, se observa una diferen...

Discussion

El protocolo descrito aquí permite la preparación de DMAPs. Sin embargo, la versatilidad y la amplia gama de materiales poliméricos que pueden utilizarse para fabricar DMAP permiten la producción de dispositivos disolvientes con diferentes características. Los resultados presentados corresponden a DMAPs de disolución rápida, ya que se produjeron con PVP, un polímero altamente dispersable en agua a baja concentración. El tiempo de disolución de los DMAP puede ajustarse fácilmente simpleme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de cultivo celular de 12 pozos	N/A	N/A	Sin especificaciones. Cualquier placa comercial de cultivo celular de 12 pozos es adecuada
Centrifugadora	Eppendorf	Centrífuga 5810 G	Reemplazable por cualquier otra centrífuga adaptable a placas de cultivo celular
Azul de metileno	Sigma Aldrich	66720	CAS 122965-43-9. Sustituible por cualquier otro tinte o marca
Arcilla para modelar	N/A	N/A	Sin especificaciones. Cualquier arcilla comercial para modelar es adecuada
Láminas termoplásticas tipo olefina	Amcor	PM996	Parafilm M
Poliuretano (alcohol vinílico) (PVA) MW: 9-10 kDa	Sigma Aldrich	363146	CAS 9002-89-5. Sustituible por cualquier otra marca
Poliuretano (vinilo pirrolidona) (PVP) MW: 40 kDa	Sigma Aldrich	PVP40	CAS 9003-39-8. Sustituible por cualquier otra marca
Moldes de polidimetilsiloxano (PDMS)	Tecnologías Micropuntuales	ST-06	Distribución de agujas de matriz 15 x 15; Altura 600 y micro; m; Base 200 y micro; m; Paso de aguja 500 y micros. Reemplazable por cualquier otro molde PDMS con otra forma y longitud de cavidad
Tanque de presión	Protrima	AT-10HT	Sustituible por cualquier otro depósito de presión que soporte 4 bar de presión