Artículo de método

Evaluación del efecto de la timoquinona en la señalización de Keap-1/NRF-2, el estrés oxidativo y el comportamiento en ratas

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DOI:

10.3791/69924

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13 de marzo de 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

En este artículo

Resumen

Este protocolo demuestra cómo evaluar los efectos de la timoquinona en la vía Keap-1/Nrf-2, biomarcadores de estrés oxidativo y resultados conductuales en un modelo de rata de exposición subcrónica a deltametrina.

Resumen

Los avances recientes en la investigación sobre la exposición a pesticidas han incrementado el interés en estrategias de protección basadas en antioxidantes. Se ha reportado que la timoquinona (TQ), un compuesto bioactivo de origen vegetal, ejerce efectos protectores contra diversos agentes tóxicos. Este estudio describe un protocolo para evaluar los efectos de la TQ sobre los parámetros de estrés oxidativo, la vía de señalización Keap-1/Nrf-2 y los resultados conductuales en ratas expuestas a dosis bajas de Deltametrina (DTM). Aquí, 24 ratas Wistar albinas machos adultos (250 ± 20 g) fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos (n = 6/grupo): control, TQ, DTM y DTM+TQ. Se administraron intragástricamente DTM (1,28 mg/kg) y TQ (10 mg/kg). Se monitorizó el peso corporal durante todo el estudio. La actividad locomotora y el comportamiento similar a la ansiedad se evaluaron mediante la prueba de campo abierto en el día 31, y el comportamiento similar a la depresión se evaluó mediante la prueba de natación forzada en el día 32. Al finalizar el periodo experimental, se recogieron plasma y tejidos cerebrales para análisis bioquímicos, histopatológicos y moleculares. Se midieron marcadores de estrés oxidativo, incluyendo malondialdehído, óxido nítrico total, glutatión y niveles de grupo sulfhidrilo, en muestras de plasma y corteza cerebral. Se analizaron los niveles de expresión de la proteína asociada a ECH similar a kelch (Keap-1) y del factor 2 relacionado con el factor eritroide 2 (Nrf-2) mediante Western blot e inmunohistoquímica. Este protocolo proporciona un enfoque integral y reproducible para investigar la neurotoxicidad inducida por pesticidas y los efectos moduladores de los compuestos antioxidantes.

Introducción

Los insecticidas se utilizan ampliamente en la agricultura y en entornos domésticos para controlar plagas; Sin embargo, la exposición crónica a dosis bajas puede provocar contaminación ambiental y efectos adversos tanto en humanos como en animales. Esta exposición, especialmente a través de alimentos y agua contaminados, se ha asociado con un mayor riesgo de trastornos neurológicos y otras toxicidadessistémicas.

Los piretroides han sustituido en gran medida a los insecticidas organofosforados debido a regulaciones más estrictas sobre estos últimos y a su toxicidad relativamente menor para mamíferos. El DTM, un piretroide tipo II que contiene un grupo α-ciano, es uno de los insecticidas más utilizados en todo el mundo y se considera altamente eficaz contrainsectos 2. A pesar de ello, estudios experimentales han demostrado que la exposición al DTM induce estrés oxidativo y neurotoxicidad en modelosanimales 3,4.

La DTM es un compuesto altamente lipofílico que atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica y altera la función neuronal al prolongar la apertura de canales de sodio dependientes de voltaje. Este efecto conduce a una activación neuronal repetitiva, un aumento de la entrada intracelular de sodio y una generación aumentada de especies reactivas de oxígeno, lo que finalmente resulta en daño oxidativo, inflamación y alteraciones conductuales, especialmente en regiones cerebrales vulnerables como el hipocampo y la cortezacerebral 1. Dada la creciente preocupación por la neurotoxicidad inducida por pesticidas, se ha prestado cada vez más atención a estrategias protectoras basadas en antioxidantes derivadas de fuentes naturales. Se ha informado que el TQ, un componente bioactivo principal del aceite esencial Nigella sativa, posee potentes propiedades antioxidantes, antiinflamatorias yneuroprotectoras 5. Varios estudios han demostrado sus efectos beneficiosos contra el estrés oxidativo inducido químicamente y los procesosneurodegenerativos 5,6,7,8,9.

Uno de los principales mecanismos subyacentes a los efectos protectores de la TQ implica la modulación de la vía de señalización Keap-1/Nrf-2. Esta vía desempeña un papel central en el mantenimiento de la homeostasis redox celular al regular la expresión de enzimas antioxidantes y desintoxicantes. Bajo condiciones de estrés oxidativo, se alivia la represión mediada por Keap-1 de Nrf-2, permitiendo que Nrf-2 se transloque al núcleo y active la expresión génica dependiente de elementos de respuestaantioxidante 9.

Debido a que la exposición al DTM induce alteraciones a nivel molecular, bioquímico, histológico y conductual, un único enfoque analítico es insuficiente para captar la magnitud total de sus efectos neurotóxicos. Por ello, este protocolo integra evaluaciones conductuales, análisis de biomarcadores de estrés oxidativo, evaluación histopatológica e investigación molecular de la vía Keap-1/Nrf-2 para proporcionar un marco integral y reproducible para estudiar la neurotoxicidad inducida por pesticidas y los efectos moduladores de compuestos antioxidantes como TQ.

En conjunto, la evidencia resumida anteriormente destaca la necesidad de un enfoque experimental integrado para clarificar los mecanismos subyacentes a la neurotoxicidad inducida por el DTM y evaluar posibles intervenciones protectoras. Al combinar evaluaciones conductuales con análisis bioquímicos, histopatológicos y moleculares de la vía Keap-1/Nrf-2, el presente protocolo permite una evaluación multidimensional del daño neuronal relacionado con el estrés oxidativo. La interpretación de los hallazgos experimentales dentro de este marco mecanicista enfatiza cómo la TQ modula la señalización redox, atenúa la lesión tisular y mejora los resultados conductuales en el contexto de la exposición subcrónica a DTM.

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Protocolo

El Comité Local de Ética de Experimentación Institucional con Animales aprobó el protocolo experimental bajo el número de registro 68429034/35. La duración total del estudio fue de 32 días. Antes de los experimentos, los animales estaban aclimatados a condiciones estándar de laboratorio. Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo estrictamente con las directrices institucionales e internacionales de ética animal. Los materiales experimentales utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

NOTA: Los residuos químicos y biológicos se eliminaron conforme a las directrices de seguridad y gestión de residuos en el laboratorio de la institución. Los ácidos, bases y disolventes orgánicos se recogían en recipientes separados y etiquetados y se entregaban a la unidad de residuos peligrosos institucionales. Los materiales biológicos y los consumibles contaminados se recogían en contenedores de riesgo biológicos, se esterilizaban y se transferían a la instalación institucional correspondiente para su disposición final.

1. Diseño experimental

  1. Obtén 24 ratas albanas Wistar machos adultas que pesan 250 ± 20 g del Laboratorio de Experimentos Animales. Alojar a cada rata individualmente en jaulas a 24 ± 2 °C bajo un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad, con acceso improvisado a comida estándar para ratas y agua del grifo.
  2. Dividir aleatoriamente los animales en cuatro grupos (n = 6 por grupo): Grupo 1: Control (C), Grupo 2: TQ, Grupo 3: DTM, Grupo 4: DTM + TQ.
  3. Disuelva DTM (98% de pureza) en aceite de maíz y administre a una dosis de 1,28 mg/kg mediante gavage intragástrico durante 30 días.
  4. Disuelve TQ con una dosis de 10 mg/kg en aceite de maíz y administra mediante gavage intragástrico durante 30 días. Prepara todos los medicamentos frescos diariamente y administra en un volumen total de 1 mL/kg.
  5. En el grupo de tratamiento combinado, administrar la QT inmediatamente después de la DTM. Administrar aceite de maíz solo al grupo de control para compensar el estrés relacionado con el vaivén.
    NOTA: La dosis de DTM fue seleccionada en base a la literatura previa para inducir estrés oxidativo sin causar morbilidad y corresponde aproximadamente a 1/100 de la DL501.

2. Medición del peso corporal

  1. Mide el peso corporal en los días 1, 10, 20 y 30 del estudio (Figura 1).

3. Parámetros conductuales

  1. Realizar todas las pruebas de comportamiento bajo condiciones estandarizadas para garantizar la coherencia. Grabar tanto la Prueba de Natación Forzada (FST) como la Prueba en Campo Abierto (OFT) utilizando una cámara aérea que proporcione una vista completa del aparato de prueba. Mantener la iluminación en aproximadamente 100–150 lux. Define inmovilidad como la ausencia de movimiento activo, salvo por los movimientos mínimos necesarios para mantener la postura y la respiración. Limpia todas las arenas de análisis con un 70% de etanol entre animales para evitar influencias olfativas.
  2. FST
    1. Realizar la FST en el día 32 para evaluar comportamientos similares a la depresión. Realiza una sesión previa a la prueba de 15 minutos 24 horas antes de la sesión de 5 minutos para acostumbrar a los animales al entorno acuático y minimizar el estrés inducido por la novedad. No realices puntuaciones conductuales durante la sesión previa al examen.
    2. Coloca individualmente las ratas en recipientes cilíndricos (diámetro: 35 cm, altura: 50 cm) que contienen 30 cm de agua mantenida a 25 ± 1 °C durante 5 minutos.
    3. Graba las duraciones de la natación, la escalada y la inmovilidad usando una cámara de vídeo. Cuantifica los parámetros de comportamiento en segundos a partir de grabacionesde vídeo 10.
    4. Defina los comportamientos de la siguiente manera:
      Inmovilidad: Considera al animal inmóvil cuando permanece flotando sin movimientos activos, haciendo solo movimientos mínimos necesarios para mantener la cabeza fuera del agua.
      Natación: Define la natación como el movimiento horizontal activo a lo largo del cilindro con movimientos coordinados de las cuatro patas.
      Escalada: Define trepar como movimientos vigorosos dirigidos hacia arriba de las patas delanteras contra la pared cilíndrica mientras el animal permanece en posición vertical.
    5. Si el animal permanece completamente inmóvil, califique el comportamiento como inmovilidad según los criterios predefinidos.
    6. No apliques estimulación externa ni corrección de curso durante la sesión de prueba. Permite que el animal se comporte libremente durante todo el periodo de 5 minutos, salvo que se requiera intervención por motivos de seguridad (por ejemplo, riesgo de ahogamiento).
  3. OFT
    1. Realizar OFT el día 31 para evaluar la actividad locomotora y el comportamiento similar a laansiedad 11. Graba movimientos individuales durante 5 minutos en una arena de 90 x 35 cm, divididos en 24 unidades iguales por líneas negras.
    2. Cuantifique los siguientes parámetros conductuales a partir de grabaciones de vídeo realizadas por un investigador cegado a la asignación de grupos:
      El número de cruces con las cuatro patas (actividad locomotora)
      Tiempo pasado en las zonas centrales y periféricas (comportamiento similar a la ansiedad)
    3. Si un animal permanece completamente inmóvil, registrar el comportamiento como inmovilidad y asignar cruces cero para ese periodo.
    4. No aplique estimulación externa, reposicionamiento ni corrección de curso durante la sesión de prueba.
    5. Permite que el animal se comporte libremente durante los 5 minutos completos, salvo que sea necesaria la intervención por motivos de seguridad.
    6. Limpia la arena con etanol al 70% entre animales para eliminar las señales olfativas.

4. Evaluación de marcadores de estrés oxidativo

  1. Realiza todos los procedimientos en el día 32. Anestesiar profundamente a las ratas con xilazina intramuscular (5 mg/kg) y ketamina (45 mg/kg). Confirma la anestesia profunda por la ausencia del reflejo de retirada del pedal. Recoge aproximadamente entre 3 y 5 mL de sangre mediante punción cardíaca en tubos recubiertos de EDTA.
  2. Eutanasia completa por exanguinación bajo anestesia profunda y confirmación de la muerte antes de la recogida de tejido. Centrifugar muestras de sangre a 3.000 x g durante 10–15 minutos a 4 °C. Recoge cuidadosamente plasma sin alterar la capa buffy y almacena las alicuotas a −80 °C. Diseccionar el cerebro rápidamente sobre hielo. Separar el hemisferio cerebral izquierdo y el hipocampo para análisis bioquímicos y congelar rápidamente en nitrógeno líquido (almacenamiento de −80 °C). Fijar el hemisferio cerebral derecho con formalina tampón neutra al 10% para evaluación histológica.
  3. Análisis de estrés oxidativo plasmático
    1. Peroxidación lipídica plasmática (ensayo TBARS)
      1. Muestras de plasma de centrifugadora (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Mezclar 0,5 mL de plasma con 1 mL de reactivo TCA–TBA–HCl (15% ácido tricloroacético (TCA), 0,375% ácido tiobarbitúrico (TBA), 0,25 N ácido clorhídrico (HCl)). Centrifuga a 1.000 x g durante 10 minutos y transfiere el sobrenadante a tubos de vidrio. Añadir 50 μL de hidroxitoluno butilado al 0,02% (BHT) para evitar la oxidación artificial.
      2. Calienta a 100 °C durante 15 minutos, enfría a temperatura ambiente, centrifuga a 1.000 x g durante 10 minutos y mide la absorbancia sobrenadante a 532nm 10. Calcular la concentración de MDA usando la ley de Beer–Lambert
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm y expresado como plasma nmol/mL.
    2. Niveles de Tiol en Plasma (RSH)
      1. Mezclar 0,5 mL de plasma con tampón Tris-HCl (100 mM, pH 8,2) que contenga 1% de dodecilo sulfato de sodio (SDS) y 2 mM de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA). Incubar 5 minutos a 25 °C y centrifugar (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Usa el sobrenadante para el análisis.
      2. Añade 0,3 mM 5,5′-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) e incuba a 37 °C durante 15 minutos. Mide la absorbancia a 412nm 10. Calcular las concentraciones de RSH usando ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 y expresarse como plasma μmol/L.
    3. Niveles de NOx en plasma (reacción Griess)
      1. Desproteinizar plasma con hidróxido de sodio (NaOH) 0,3 M y sulfato de zinc al 5% (ZnSO₄). Centrifuga a 20.000 x g durante 5 minutos y recoge el sobrenadante.
      2. Preparar soluciones de stock de nitrato (100, 10 y 1 mmol/L) y generar una curva estándar (1–100 μmol/L). Carga 100 μL de sobrenadante (pozos duplicados) en una microplaca.
      3. Añadir 100 μL de cloruro de vanadio (III) (VCl₃) seguido de 50 μL de sulfanilamida y 50 μL de etilendiamina N-(1-naftil). Incubar 30–45 minutos a temperatura ambiente y medir la absorbancia a 540nm 10. Determinar las concentraciones de NOx a partir de la curva estándar y expresar como plasma μmol/L.
  4. Análisis de estrés oxidativo tisular
    1. Utilice aproximadamente 100 mg de tejido del hemisferio cerebral izquierdo para todos los análisis bioquímicos.
    2. Peroxidación de lípidos tisulares (ensayo TBARS)
      1. Homogeneizar tejido (1:10 p/v) en un ATC al 10% helado. Añade un volumen igual de 0,67% TBA y calienta a 100 °C durante 15 minutos. Enfría y centrifuga (3.000 x g, 10 min, 4 °C)10. Mide la absorbancia sobrenadante a 535 nm. Calcular la MDA usando ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 y expresarse como nmol/g tejido húmedo.
    3. Niveles de glutatión tisular (GSH)
      1. Homogeneizar tejido en un 10% de TCA (1:10 p/v) y centrifugar (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Mezcla 0,5 mL de sobrenadante con 2 mL de solución DTNB (0,4 mg/mL en citrato de sodio al 1%). Mide la absorbancia a 412 nm inmediatamente. Calcular GSH usando ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 y expresarlo como μmol/g tejido húmedo.
    4. Niveles de NOx tisulares (reacción de Griess)
      1. Homogeneizar tejido en solución fisiológica tamponada con fosfato (PBS) (1:5 p/v) y en centrifugadora (2.000 x g, 5 min). Desproteinizar el sobrenadante con 0,3 M de NaOH y 5% de ZnSO₄. Centrifuga (3.000 x g, 20 min) y recoge el sobrenadante transparente.
      2. Preparar estándares de nitrato (1–100 μmol/L). Carga 100 μL de sobrenadante en pozos duplicados. Añade VCl₃ y reactivos Griess como se ha descrito arriba. Incubar durante 45 minutos a 37 °C y medir la absorbancia a 540nm 10. Determina las concentraciones a partir de la curva estándar y expresa como tejido μmol/g.
        PRECAUCIÓN: Los procedimientos que involucraban productos químicos peligrosos, incluyendo TCA, HCl, NaOH y disolventes orgánicos, se realizaron en una campana extractora certificada para químicos. Se utilizaron equipos de protección individual (EPP) apropiados, como batas de laboratorio, guantes resistentes a productos químicos, gafas de protección y, cuando era necesario, pantallas faciales, en todos los experimentos. Todos los productos químicos se manipularon conforme a las directrices de seguridad institucionales y a las hojas de datos relevantes de seguridad de materiales (MSDS).

5. Determinación de los niveles de Keap-1 y Nrf-2 mediante análisis de Western blot

  1. Cortar tejido hipocampal en trozos de 50 mg y colocarlos en tubos de homogeneización que contienen 500 μL de buffer RIPA suplementado con cóctel inhibidor de proteasas.
  2. Añade una cantidad adecuada de perlas magnéticas y homogeneiza a 1.000 x g durante dos ciclos. Centrifugar a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 °C.
  3. Transfiere el sobrenadante para limpiar los tubos de la microcentrífuga y centrifugar de nuevo bajo las mismas condiciones. Guarda muestras sobre hielo y determina las concentraciones de proteínas.
  4. Mide las concentraciones de proteínas usando un fluorómetro con el Protein BR Assay Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
  5. Preparar geles SDS–PAGE al 10% para electroforesis. Ajusta la concentración de proteínas a 30 μg/μL.
  6. Añade 4 tampones de Laemmli en una proporción 3:1 y complementa con un 10% de β-mercaptoetanol. Calienta muestras a 95 °C durante 5 minutos y luego centrifuga brevemente.
  7. Carga 5 μL de marcador proteico y 30 μg de proteína por carril. Haz correr geles a 110 V durante 60–90 minutos.
  8. Activa las membranas PVDF en metanol al 100% durante 3–5 minutos, luego equilibra en 1× amortiguador de transferencia durante 10 minutos a temperatura ambiente antes de la transferencia.
  9. Módea los papeles filtro y esponjas con el buffer de transferencia y monta cuidadosamente el sándwich de transferencia, asegurando la eliminación completa de las burbujas de aire. Realizar la transferencia de proteínas utilizando un sistema de transferencia húmeda a 100 V durante 90 minutos a 4 °C (voltaje constante).
  10. Bloquear membranas en albúmina sérica bovina al 3% (BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente sobre un agitador orbital. Incubar las membranas durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en 3% de BSA (Keap-1 y Nrf-2, 1:3.000; β-actina, 1:1.000).
  11. Lava las membranas 5 veces durante 5 minutos con 1 × suero salino con Tris-buffer y detergente Tween 20 al 0,1% (TBS-T). Incubar con anticuerpo secundario (1:15.000) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad.
  12. Lavar las membranas según lo descrito e incubar con un sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (por ejemplo, sustrato HRP a base de luminol) según las instrucciones del fabricante (mezclando volúmenes iguales de reactivo A y B justo antes de su uso). Aplicar suficiente sustrato para cubrir completamente la superficie de la membrana (aproximadamente 1 mL por membrana) e incubar durante 1–2 minutos a temperatura ambiente.
  13. Detectar señales quimioluminiscentes mediante un sistema de imagen digital equipado para la detección de quimiluminiscencia (no se requiere una longitud de onda específica de excitación, ya que la emisión de luz resulta de la reacción HRP–luminol). Adquiere imágenes usando ajustes automáticos de exposición asegurando bandas no saturadas. Mantén los mismos parámetros de exposición para todas las muestras dentro del mismo blot.
  14. Realizar análisis densitométricos utilizando software de análisis de imágenes bajo parámetros idénticos de selección de retorno de inversión, resta de fondo y normalización. Normalizar las intensidades de las bandas Keap-1 y Nrf-2 a la proteína de mantenimiento correspondiente, β-actina. Exporta valores normalizados como archivos .csv para análisis estadístico.

6. Análisis histopatológico

  1. Fija el hemisferio cerebral derecho con un 10% de formalina neutra durante 72 horas. Deshidratar mediante una serie graduada de etanol (70%–100%), incrustarse en parafina y seccionar a 5 μm.
    Obtén secciones cerebrales coronales en los niveles de la corteza hipocampal y entorrinal según las coordenadas estereotáxicas definidas en Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Utiliza el visor interactivo del atlas cerebral de rata (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas para verificar y refinar la localización anatómica11.
  2. Prepara cuatro secciones coronales consecutivas (5 μm de espesor) a partir de tejido cerebral incrustado en parafina utilizando procedimientos histológicos estándar. Tinte las secciones con hematoxilina y eosina (H&E) según los protocolosconvencionales 12. Examina todas las láminas bajo un microscopio óptico a una magnificación del 200×. Asegúrese de que la evaluación histológica sea realizada por un investigador ciego para minimizar el sesgo delobservador 13.
    NOTA: Este procedimiento aseguró una comparación anatómica consistente entre grupos.
  3. Evalúa semicuantitativamente la pérdida neuronal, el edema celular, la picnosis nuclear, la infiltración inflamatoria y la congestión vascular en 10 campos aleatorios por sección.
  4. Calcula las puntuaciones medias para cada parámetro por grupo. Los criterios de puntuación fueron los siguientes: 0 (ninguno, <5%), 1 (leve, <33%), 2 (moderado, 33–66%) y 3 (grave, >66%; Tabla 1).

7. Análisis inmunohistoquímico de la reactividad de Nrf-2 y Keap-1 en el hipocampo y la corteza entorrinal

  1. Prepara secciones de 5 μm de grosor del hipocampo y la corteza entorinal y móntalas sobre portaobjetos de vidrio.
  2. Deparafina y rehidrata las secciones, luego lava en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
  3. Incubar secciones con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Lavar secciones con PBS
  4. Realiza la recuperación de antígenos calentando las láminas en un tampón de citrato de sodio (pH 6,0) durante 10–15 minutos. Deja que las láminas se enfríen durante 30 minutos y luego lava con PBS.
  5. Incubar de nuevo con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos para asegurar una inhibición completa de la peroxidasa. Lava las secciones con PBS.
  6. Aplica una solución bloqueante durante 10 minutos para reducir la unión inespecífica. Incubar las secciones durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Nrf-2 (dilución 1:100) y Keap-1 (dilución 1:200). Lava las secciones con PBS después de la incubación.
  7. Incubar secciones con un anticuerpo secundario adecuado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lava las secciones con PBS.
  8. Aplicar estreptavidina–peroxidasa a las secciones e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada (mantener una humedad relativa del 95–100% usando una caja de incubación sellada que contiene papel de filtro humedecido). Lava las secciones con PBS tras la incubación.
  9. Aplica cromógeno DAB y monitoriza el desarrollo del color bajo un microscopio óptico a una magnificación del 100×. Detiene la reacción enjuagando los portaobjetos con agua del grifo.
  10. Contrateñe las secciones con hematoxilina diluida 1:9 durante 5 minutos a temperatura ambiente. Enjuaga bien con PBS y agua destilada. Monta las secciones usando un medio de montaje permanente.
  11. Examina las secciones teñidas bajo un microscopio óptico. Captura fotomicrografías a ×400 de aumento a partir de 16 campos representativos por sección.
  12. Cuantifiquen la inmunorreactividad de Nrf-2 y Keap-1 utilizando software de análisis de imágenes. Registrar y analizar los datos cuantificados para una evaluación estadística adicional.
  13. Para el análisis inmunohistoquímico, abre las imágenes en ImageJ y calibra usando la herramienta Set Scale. Convierte todas las imágenes a escala de grises de 8 bits para estandarizar las mediciones de intensidad. Define manualmente las regiones de interés (ROIs) para áreas teñidas positivamente y regiones de fondo adyacentes y guárdalas en el Gestor de ROI.
  14. Cuantifique la intensidad de la tinción usando una deconvolución de color H-DAB consistente, seguida de parámetros de umbral idénticos en todas las muestras. Mide el valor medio de gris, la densidad óptica y el porcentaje de área positiva.
  15. Para análisis basado en células, segmenta imágenes con umbral usando la herramienta Watershed y cuantifica las células positivas usando Analyze Particles. Todos los datos se exportaban como archivos .csv para análisis estadístico.

8. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando la versión 29.0 de SPSS. Introduce los datos en bruto en la pestaña de Vista de Datos, donde cada fila representa un animal individual y variables definidas en la pestaña Vista de Variables; el grupo experimental se codificaba como una variable categórica (Control, TQ, DTM y DTM+TQ).
  2. Evalúa la normalidad de los datos usando la prueba de Shapiro–Wilk seleccionando Analizar > Estadísticas Descriptivas > Explorar, asignando variables de resultado a la Lista de Dependientes y Grupo a la Lista de Factores, y habilitando gráficos de Normalidad con pruebas. Para variables normalmente distribuidas, realiza comparaciones de grupos utilizando análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) mediante Analizar > Comparar Medias > ANOVA Unidireccional, con estadísticas descriptivas y la prueba de Levene para homogeneidad de varianzas habilitadas bajo Opciones.
  3. Cuando se detecta un efecto principal significativo, se aplica la prueba post hoc de Tukey a través del menú Post Hoc para identificar diferencias de grupo por pares. Utiliza los resultados de las pruebas de Levene para confirmar la homogeneidad de varianzas (p > 0,05).
  4. Para datos histopatológicos de puntuación que no cumplen con las suposiciones paramétricas, realiza un análisis no paramétrico usando la prueba de Kruskal–Wallis seleccionando Analizar > Pruebas No Paramétricas > Diálogos Legados > K Muestras Independientes, seguida de la prueba post hoc de Dunn con corrección de Bonferroni usando el módulo de prueba no paramétrica de Muestras Independientes.
  5. Exportando las salidas estadísticas y tablas resumen como archivos .xls o .csv, los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (SD), y se consideró estadísticamente significativo un valor p < 0,05.

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Resultados

Mediciones de peso corporal
El peso corporal se registró en los días 1, 10, 20 y 30. Las ratas de los grupos C y TQ mostraron un aumento progresivo del peso corporal durante el periodo experimental, sin diferencias significativas entre estos grupos al día 30. En cambio, las ratas expuestas al DTM mostraron una reducción significativa del peso corporal en comparación con los controles. La coadministración de TQ atenuó la pérdida de peso asociada al DTM. No se observó m...

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Discusión

Este estudio demuestra que la exposición oral subcrónica al DTM induce alteraciones conductuales, bioquímicas, moleculares e histopatológicas constantes en las ratas, y que la TQ mitiga eficazmente estos efectos cuando se administra de forma simultánea. Al integrar pruebas conductuales estandarizadas con perfilado de estrés oxidativo, análisis a nivel de vía de la señalización Keap-1/Nrf-2 y evaluación histopatológica, el protocolo proporciona un marco robusto y reproducible para evaluar...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses ni intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Esta investigación no recibió financiación externa.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
5,5'-Dithiobis (ácido 2-nitrobenzoico)Thermo Scientific y nbsp;  69-78-3 
Centrífuga de sobremesa NF048Nü ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, Estados Unidos7D2C10
Solución BSA  Proteintech, Estados Unidos)66201-1-IG
Hidroxitolueno butiladoSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö R Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
Hematoxilina y guion; eosina Bio OpticaW01030708
Ácido clorhídricoMerck7647-01-0
Programa de software Image J NIH; Washington, EE.UU.https://imagej.net/ij/
Kit de tinción inmunohistoquímica  Sistema de detección de gran volumen Lab VisionTM UltraVisionTM: antipolivalenteHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Alemaniahttps://www.leicabiosystems
.com/equipamiento de histología/mi
crotomas/histocore-autocut/
Microscopio óptico  Nikon, Eclipse y nbsp;Ni-U, 940728
N-(1-Naftil)etilendiaminaThermo Scientific y nbsp;1465-25-4
Lector de microplacas nanoBMG LABTECHSPECTROstar Nano
solución salina tamponada con fosfato  MerckP4417
Anticuerpos primarios Keap-1 ProteintechCat No. 10503-2-AP, 1:200
Anticuerpos primarios Nrf-2 y nbsp;ProteintechNúmero de referencia 16396-1-AP, 1/100
Kit de ensayo BR de proteínas de qubits  ThermoFisher Scientific-INVITROGENP33211
Citrato de sodioMerck03-04-6132
Dodecilo sulfato de sodioThermo Scientific y nbsp;151-21-3
Hidróxido de sodioMerck1310-73-2
Nitrato de sodioMerck7631-99-4
Estreptavidina Peroxidasa Thermo Scientific y nbsp;SHRP248-B
SulfanilamidaThermo Scientific y nbsp;  63-74-1 
ácido tiobarbitúrico y nbsp;Merck504-17-6
TQ CAIMÁN  490-91-5
Ácido tricarbílico, 99%Química Termocientífica  139360500
Ácido tricloroacéticoQuímica Termocientífica76-03-9
Tris-HClThermo Scientific y nbsp;  1185-53-1 
Cloruro de vanadio(III)Sigma Aldrich7718-98-1
Sustrato quimioluminiscente West Pico PLUS y el iBright 750 Sistema científico Thermo Fisherhttps://www.clinxsci.com/product
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Solución de sulfato de zincMerck7733-02-0

Referencias

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

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