Análisis espectral Raman asistido por aprendizaje automático del nanosensor ssDNA-SWCNT sensible a la serotonina para mejorar la selectividad frente a la dopamina

Summary

El protocolo describe el análisis espectral Raman de nanosensores SWCNT envueltos en ssDNA, lo que permite una medición selectiva mejorada de la serotonina frente a la dopamina con la ayuda de un modelo de aprendizaje automático.

Abstract

La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) desempeña un papel fundamental en la neuromodulación, pero los métodos actuales de detección tienen dificultades para proporcionar una detección en tiempo real de la 5-HT con alta sensibilidad y selectividad. Anteriormente desarrollamos un nanosensor de serotonina en el infrarrojo cercano (nIRHT), que consiste en un nanotubo de carbono de pared simple envuelto en ADN ss, que detecta de forma sensible el 5-HT. Sin embargo, la respuesta de fluorescencia de nIRHT no puede discriminar entre 5HT y dopamina (DA), limitando sus aplicaciones prácticas. En este estudio, la espectroscopía Raman combinada con el aprendizaje automático supera este desafío de selectividad. Las características espectrales de la banda G revelaron firmas distintas para la unión de 5HT frente a la de DA a nIRHT, con la DA provocando una mayor supresión de la banda G. Empleamos Raman diferencial (ΔRaman) para aislar los cambios espectrales específicos del analito y entrenamos tres modelos de aprendizaje automático para su clasificación. El modelo de bosque aleatorio con ΔRaman logró un rendimiento óptimo con un 95,8% de precisión, superando significativamente a los modelos que usaban espectros Raman en bruto. Este enfoque mostró una mayor especificidad, con respuestas despreciables a acetilcolina, GABA y glutamato, y alcanzó un límite de detección de 0,1 μM adecuado para aplicaciones fisiológicas. Este enfoque basado en Raman transforma el sensor de fluorescencia nIRHT no selectivo en una plataforma capaz de una robusta discriminación de neurotransmisores, superando problemas de selectividad en la detección molecular basada en nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT).

Introduction

La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) es un neurotransmisor crítico que regula el estado de ánimo, la cognición, el sueño y el apetito, con disfunciones implicadas en la depresión, la ansiedad y otros trastornos^{neuropsiquiátricos.} El monitoreo en tiempo real de la dinámica de la serotonina en sistemas biológicos sigue siendo un reto debido a la escala de milisegundos de transmisión sináptica y al complejo entorno químico del tejido^{neural 2}. A pesar de los avances significativos en las tecnologías de detección de neurotransmisores, lograr tanto una alta sensibilidad como una selectividad molecular para la serotonina sigue planteando importantes desafíos analíticos.

Los métodos actuales de detección de serotonina abarcan desde técnicas analíticas tradicionales hasta plataformas emergentes de nanosensores. La cromatografía líquida de alto rendimiento con detección electroquímica (HPLC-ED) sigue siendo el estándar de oro, alcanzando límites de detección de 0,056 nM con excelente^{reproducibilidad 3}. Sin embargo, el HPLC requiere una preparación exhaustiva de la muestra y tiempos de análisis de 15-30 minutos, lo que impide la monitorización en tiempo^{real 4}. La voltametría cíclica de barrido rápido (FSCV) permite una resolución temporal de subsegundo en microelectrodos de fibra de carbono, pero sufre de ensuciamiento de electrodos y selectividad limitada entre neurotransmisores estructuralmente^{similares 5,6}. Los desarrollos recientes en sensores fluorescentes codificados genéticamente, incluyendo iSeroSnFR⁷ y GRAB-5HT⁸, alcanzan una sensibilidad y rango dinámico notables, pero requieren modificación genética de los tejidos objetivo, limitando así la traducción clínica.

Los sensores ópticos de nanotubos de carbono de pared simple (SWCNT) han surgido como plataformas prometedoras para la detección de neurotransmisores sin etiqueta⁹. Los SWCNTs funcionalizados por ADN exhiben modulación de fluorescencia en el infrarrojo cercano (nIR) al unirse al analito, lo que permite la detección en la ventana transparente al tejido (900-1400 nm^)10,11. El grupo de Landry desarrolló el sensor nIRHT mediante la evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEC), cribado ~10¹⁰ secuencias únicas de ADNSSSs para identificar constructos sensibles a la^{serotonina 12}. Este sensor alcanza una sensibilidad micromolar con un aumento de fluorescencia del 200% al unirse a la serotonina, funcionando de forma independiente de la oxidación de dopamina o serotonina. Para descartar interferencias oxidativas, nuestro estudio previo confirmó la estabilidad de estas soluciones de neurotransmisores; Los análisis UV-Vis y RMN no revelaron cambios oxidativos ni nuevas formaciones de picos en comparación con el^5HT-12 puro. Además, el corto tiempo de incubación y las condiciones de pH neutro utilizadas en el sistema están diseñados para evitar la formación significativa de quinona. De manera similar, el grupo de Strano fue pionero en el reconocimiento molecular de la fase corona (CoPhMoRe), demostrando que los SWCNTs envueltos en (GT)₁₅ detectan dopamina a 11 nM concentraciones¹³. Nuestro grupo avanzó recientemente en este campo mediante optimización guiada por aprendizaje automático, logrando mejoras de sensibilidad de 2,5 veces mediante el cribado de alto rendimiento de secuencias sistemáticamente^{mutadas 14}.

A pesar de estos avances, persiste una limitación fundamental en la insuficiente selectividad entre serotonina y dopamina. Ambos neurotransmisores contienen anillos aromáticos y cadenas de etilamina, que difieren solo por un único grupo^{hidroxilo 15}. Los sensores SWCNT actuales basados en fluorescencia suelen alcanzar proporciones de selectividad inferiores a 5:1, insuficientes para distinguir neurotransmisores coliberados en ambientes^{sinápticos 16}. Este desafío de selectividad es especialmente crítico dado que la serotonina y la dopamina suelen colocalizarse en regiones cerebrales que regulan la recompensa y la^{motivación 17}.

La espectroscopía Raman ofrece información química complementaria mediante el análisis de modos vibracionales del complejo^{SWCNT-analito 18}. La banda G (~1580 cm⁻¹) de los SWCNTs se divide en componentes G⁺ y G⁻, con frecuencias sensibles a la adsorción molecular y al dopaje^{electrónico 19}. Un estudio previo demostró que los tensioactivos no covalentes en SWCNT inducen cambios espectrales Raman distintos en la región²⁰ de la banda G.

En este trabajo, demostramos el análisis espectral Raman asistido por aprendizaje automático del sensor nIRHT para lograr una mayor selectividad entre serotonina y dopamina. Caracterizamos sistemáticamente respuestas Raman dependientes de la concentración de 0,01 a 100 μM, revelando huellas espectrales distintas para cada neurotransmisor. Se entrenaron tres modelos de aprendizaje automático — red neuronal convolucional (CNN), máquina vectorial de soporte (SVM) y bosque aleatorio (RF) — con conjuntos de datos espectrales para clasificar la identidad del analito. De forma crítica, introducimos el procesamiento Raman diferencial, que elimina señales de línea base para aislar características específicas del analito. El modelo RF optimizado con procesamiento DR alcanza una precisión de clasificación del 95,8%, lo que representa un avance significativo en la discriminación molecular. Este enfoque multimodal que combina la sensibilidad a la fluorescencia del nIR con la especificidad química Raman proporciona una vía hacia la monitorización selectiva y en tiempo real de la serotonina en entornos biológicos complejos.

Protocol

1. fabricación de nanosensores SWCNT nIRHT funcionalizada por ADN ss.

1. Combina 1 mg de nanotubos de carbono de pared simple (SWCNTs), 100 μL de 1 mM de ADN E6#9 y 900 μL de 1 suero salino tamponado con fosfato (PBS) en un tubo de 1,5 mL.
   PRECAUCIÓN: El polvo seco de SWCNT es un posible riesgo de inhalación. Manipula el polvo dentro de una campana extractora certificada y lleva el equipo de protección personal adecuado, incluyendo mascarilla y guantes.
2. Dispersa la mezcla usando un sonicador de baño durante 5 minutos. Sonica la mezcla usando un sonicador de punta equipado con una sonda de 3 mm al 50% de amplitud durante 30 minutos en un baño de hielo.
3. Centrifugar la solución sonicada a 21.500 x g durante 1 hora para precipitar SWCNTs no dispersos. Recoger cuidadosamente 850 μL del sobrenadante y transfiererlo a un nuevo tubo.
4. Mide la absorbancia de la suspensión SWCNT recogida a una longitud de onda de 632 nm. Calcular la concentración utilizando el coeficiente de extinción SWCNT de 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Guarda la solución final del sensor nIRHT a 4 °C hasta su uso posterior.

2. Medición de espectros Raman

1. Carga 90 μL de la dispersión nIRHT de 10 mg/L en una placa de 96 pozos. Mide el espectro Raman del sensor en un buffer PBS usando una fuente de excitación láser de 532 nm. Establece este espectro registrado como línea base.
   PRECAUCIÓN: Es fundamental mantener estrictamente la potencia láser en 10 mW y la longitud de onda en 532nm al investigar muestras biológicas vivas. Potencias láser más altas pueden inducir una fototoxicidad severa y comprometer la viabilidad celular. El láser de 532 nm a 10 mW utilizado en este protocolo ha demostrado ser seguro y no destructivo para el análisis de células vivas, preservando los orgánulos^{sensibles 21} y la actividad electrofisiológica de las neuronas^{primarias 22} , asegurando al tiempo una adquisición robusta de señales Raman.
2. Aumenta cada solución sensor de 90 μL (10 mg/L) con 10 μL de la solución del analito para alcanzar concentraciones finales de 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 y 100 μM. Espera 5 minutos después de la adición del analito para permitir una incubación suficiente.
3. Mide los espectros Raman de las muestras incubadas. Prepara muestras en triplicado para cada concentración y repite los pasos 2.1 a 2.2 para asegurar la reproducibilidad.

3. Análisis de datos basado en aprendizaje automático

1. Construir el conjunto de datos a partir de un total de 208 espectros Raman, que comprenden 77 respuestas a dopamina (DA), 76 respuestas a serotonina (5HT) y 47 respuestas de grupo control (PBS).
2. Realizar la resta de fondo en la región de banda G de los datos espectrales. Normaliza los datos restados del fondo basándose en el pico de la banda G+.
3. Aplica un filtro mediano para reducir el ruido en los espectros normalizados. Aislar los cambios espectrales (ΔRaman) restando el espectro de control normalizado de cada espectro tratado con analito.
4. Desarrollar un modelo de Red Neuronal Convolucional (CNN), un Bosque Aleatorio (RF) y una Máquina de Vectores de Soporte (SVM) para la clasificación ternaria de 5HT, DA o el control.
5. Divide todo el conjunto de datos en conjuntos de entrenamiento, validación y prueba usando una proporción de 6:2:2.
6. Configura la arquitectura CNN con tres capas de convolución 1D utilizando una función de activación de ReLU y un tamaño máximo de pooling de 2, seguido de dos capas completamente conectadas.
7. Configura la SVM usando un núcleo de Función Base Radial (RBF) para una clasificación no lineal.
8. Configura el modelo RF usando hiperparámetros por defecto.
9. Entrena los modelos construidos usando la validación cruzada de 5 órdenes. Calcula las métricas medias de rendimiento en los cinco puntos para asegurar la robustez estadística.
10. Selecciona el modelo que proporcione mayor precisión en los datos de validación para el análisis final.
11. Evalúa el modelo seleccionado en el conjunto de pruebas para verificar su capacidad de generalización.
12. Determinar el límite indirecto de detección (LOD) excluyendo secuencialmente los datos del conjunto de entrenamiento que caigan por debajo de un umbral de concentración de 0,1 μM.
13. Prueba el modelo entrenado en todo el rango de concentraciones, incluyendo concentraciones por debajo de los criterios, para establecer el LOD final.

Results

El nanosensor SWCNT funcionalizado por ADN E6#9 (nIRHT), desarrollado previamente mediante la metodología SELEC, demuestra una mejora reversible de la fluorescencia nIR al unirse a 5HT, permitiendo la imagen en tiempo real con 5HT in vitro y ex^{vivo 12}. La secuencia E6#9 (5'-CCCCCCAGCACCACAGCACACTCCCCCCCC-3') rodea los SWCNTs para crear sitios de unión para 5HT. Sin embargo, este sensor carece de especificidad: tanto el 5-HT como el DA provocan un...

Discussion

El análisis espectroscópico Raman proporcionó una mejora significativa en la especificidad del sensor nIRHT, una capacidad no alcanzable con su respuesta convencional de fluorescencia. Observamos que la DA inducía una supresión más pronunciada de la banda G⁻ (1570 ^cm-1) en comparación con la 5HT. Estas firmas diferenciales probablemente surgen de diferentes orientaciones moleculares y geometrías de unión en la superficie del SWCNT. Específicamente, la mitad catecol de DA proba...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Fotón
Vibra Cell 130	SONICS