Artículo de método

Imagen por resonancia magnética multianimal para mediciones tumorales en modelos de ratón con cáncer de páncreas

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DOI:

10.3791/69927

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3 de febrero de 2026

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

En este artículo

Resumen

Este protocolo utiliza una cama de múltiples cámaras para la resonancia magnética paralela (RM) de hasta cuatro animales para detectar tumores de adenocarcinoma pancreático en modelos de ratón modificados genéticamente. Este protocolo de resonancia magnética multianimal es rápido y rentable para detectar y medir tumores, facilitando la selección animal para estudios preclínicos y el seguimiento longitudinal del crecimiento tumoral.

Resumen

Modalidades avanzadas de imagen in vivo, como la resonancia magnética (RM), son herramientas de investigación esenciales para detectar eficazmente tumores en modelos murinos preclínicos. La resonancia magnética proporciona información anatómica detallada sobre la localización y tamaño del tumor. Sin embargo, esta modalidad de imagen es costosa y lleva mucho tiempo. Para superar esta barrera de acceso sin comprometer la calidad de las imágenes, se implementó un protocolo de resonancia magnética multianimal. Este protocolo utiliza un inserto de cama de cuatro cámaras para obtener resonancias anatómicas de alta resolución con múltiples animales en una sola sesión de adquisición. Imaginar simultáneamente varios ratones reduce el tiempo y el coste de este procedimiento. Este protocolo describe un flujo de trabajo de resonancia magnética multianimal diseñado para aumentar la eficiencia de la detección tumoral y el monitoreo longitudinal tumoral en un modelo murino de adenocarcinoma pancreático ductal (p53-deletado (KPC) impulsado genéticamente por Kras. Este modelo de KPC, bien establecido y clínicamente relevante, ha proporcionado una visión invaluable sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la carcinogénesis pancreática, la progresión tumoral y la resistencia al tratamiento. Como prueba de concepto, este protocolo se aplica para validar el beneficio terapéutico del agente quimioterapéutico estándar gemcitabina en el modelo KPC. Se discuten brevemente las aplicaciones futuras de este diseño de estudio preclínico guiado por IRM para evaluar la eficacia terapéutica de las terapias combinadas.

Introducción

El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) sigue siendo una de las malignidades más letales. A pesar de las modestas mejoras en la supervivencia en los últimos años, la tasa de supervivencia a 5 años sigue siendo solo del 13%. En la mayoría de los casos, el PDAC se detecta en una fase avanzada, a menudo implicando invasión local o metástasis a distancia, lo que complica el tratamiento. La enfermedad es biológicamente diversa y se caracteriza por células tumorales altamente invasivas, un estroma desmotásico denso y una pobrevascularización 2,3,4. Este complejo microambiente tumoral sigue dificultando los esfuerzos para caracterizar completamente los componentes celulares y no celulares que influyen en la progresión de la enfermedad. Para abordar esto, se necesitan modelos preclínicos efectivos que imiten estrechamente la progresión de la enfermedad humana y la desmoplasia.

Se pueden utilizar diversos modelos murinos para estudiar la biología de la progresión del cáncer y evaluar la eficacia de nuevasterapias 5,6. El modelo murino modificado genéticamente impulsado por KRas desarrolla espontáneamente tumores pancreáticos que recapitulan muchas características fisiopatológicas y moleculares de las PDAChumanas 3,7,8,9,10,11. En particular, el modelo KPC impulsado por Kras, eliminado por p53 (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) es un PDAC GEMM 7,8,9 bien caracterizado. La imagen tumoral es un componente importante de los estudios preclínicos. La detección y medición tumoral del tamaño permiten la selección de animales para estudios preclínicos, el seguimiento longitudinal del crecimiento tumoral y la progresión de la enfermedad, así como la evaluación de la respuesta al tratamiento.

Pueden utilizarse para la imagen tumoral en el modelo KPC (BLI), tomografía computarizada (CT), imagen de fluorescencia (FLI), tomografía por emisión de positrones (PET) e imagen por resonancia magnética (RM) para la imagen tumoral en el modelo KPC y en modelos PDACsimilares 12,13,14,15,16. Sin embargo, la imagen tumoral en el modelo KPC puede ser un reto, y cada una de estas modalidades de imagen ofrece fortalezas y limitaciones únicas. Las tecnologías de imagen óptica, como la bioluminiscencia (BLI) y la ecografía (EE.UU.), son no invasivas y rentables. Sin embargo, su limitada resolución espacial, especialmente en órganos internos, puede llevar a una mala correlación con el volumentumoral 12,15,17,18. La bioluminiscencia requiere células genéticamente modificadas que expresen señal de luciferasa, lo que también depende de la administración del sustrato, el flujo sanguíneo y la oxigenación de los tejidos. Un tomógrafo por ordenador proporciona imágenes rápidas con artefactos de movimiento mínimos pero un contraste de tejidos blandos pobre sin agentes de contraste. El contraste yodado puede causar toxicidad en ratones. La imagen por fluorescencia requiere agentes de contraste/sondas fluorescentes, y la autofluorescencia de los órganos abdominales reduce la sensibilidad.

Debido a las limitaciones asociadas a otros métodos de imagen, la resonancia magnética (IRM) se considera generalmente la técnica más fiable para evaluar tumores profundos, ofreciendo un contraste superior de tejidos blandos y sensibilidad molecular para estructuras anatómicasinternas 13,14,15,19 . Sin embargo, los protocolos estándar de resonancia preclínica preclínica conllevan altos costes operativos y largos tiempos de adquisición, y pueden suponer una barrera para muchos laboratorios de investigación. La resonancia magnética multianimal puede superar esta barrera de acceso reduciendo el tiempo de preparación animal previa al escaneo (anestesia), el tiempo de escaneo y la recuperación animal post-escaneo. Este protocolo demuestra la viabilidad técnica de la imagen tumoral PDAC (Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura 4) y el uso de hallazgos de imagen para reclutar animales para tratamiento quimioterapéutico con gemcitabina (Figura 5). Los tumores PDAC presentan múltiples mecanismos inherentes que contribuyen a la resistencia contra los agentes quimioterapéuticos estándar de atención (SOC). como gemcitabina, gemcitabina/nab-paclitaxel o FOLFIRINOX 2,3,4. Este protocolo proporciona una plataforma adecuada y robusta para evaluar nuevos agentes terapéuticos y quimioterapia SOC con el fin de encontrar combinacionesprometedoras 20,21,22,23,24,25,26,27 que podrían mejorar la respuesta terapéutica en los pacientes.

Protocolo

Todos los experimentos descritos se realizaron de acuerdo con protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Michigan. Todos los procedimientos que involucran animales vivos cumplen con las directrices establecidas para garantizar el bienestar y el trato humano de los animales. Este protocolo describe el uso y tratamiento del modelo de ratón KPC de PDAC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Preimagen de la preparación animal

  1. Asegurarse de una verificación adecuada de genotipado de ratones KPC antes de su uso. Transportar ratones experimentales desde la instalación animal hasta la instalación de imagen.
  2. Anestesiar hasta cuatro ratones en una cámara de inducción sellada y precalentada con un 1,5-2% de isoflurano y 0,8-2 L/min de oxígeno. Confirma la anestesia aplicando un estímulo nocivo (pellizco en el dedo del pie).
  3. Aplica lubricante oftálmico en ambos ojos de cada ratón para evitar la desecación corneal.

2. Montaje de camas de resonancia magnética multianimal

  1. Coloca dos ratones anestesiados en posición ventral en la parte inferior (izquierda y derecha) del inserto de cama impreso en 3D, que se coloca en el soporte estándar de PET/MRI para ratas individuales proporcionado por el fabricante. Asegúrate de que los animales estén posicionados con la columna y las extremidades rectas.
    NOTA: Se utilizó una impresora 3D para imprimir los insertos de la cama (Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2).
  2. Conecta la entrada de aire en la cama del fabricante a los conos de morro usando tubería (diámetro interior 1/16", diámetro exterior 1/8"), y conexiones luer (por ejemplo, 7 conectores macho de 1/16", 2 conectores hembra-hembra de 2 conectores hembra-hembra, 2 conectores de toma-zócalo T).
  3. Asegura la cabeza del ratón en un cono nasal para mantener la anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min de oxígeno). Cubre la parte inferior con la parte superior de los insertos impresos en 3D (Figura 2B).
  4. Coloca a los otros dos ratones anestesiados en una posición ventral en la parte superior (izquierda y derecha) del inserto impreso en 3D.
  5. Asegura la cabeza del ratón en un cono nasal para mantener la anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min de oxígeno).
  6. Pega la almohadilla de monitorización respiratoria en la parte superior izquierda del ratón. Asegúrate de que la almohadilla de monitorización esté a la altura del abdomen, no del pecho, para medir la respiración sin señal del latido cardíaco.
  7. Ajusta el nivel de isoflurano para mantener una frecuencia respiratoria de 30-40 lpm durante toda la exploración, normalmente entre 1,5 y 2%. Si la pista de respiración no es visible o la amplitud es demasiado baja, asegúrate de que la almohadilla esté bien sujeta con la cinta y que todas las conexiones del tubo estén bien ajustadas.
  8. Cubre la cama para completar la cámara de resonancia magnética multianimal (Figura 2B).
    NOTA: La cama de PET/MRI para ratas individuales proporcionada por el proveedor está equipada con aire caliente circulante para mantener la temperatura corporal de los animales (~35-37 °C). Se pueden escanear hasta cuatro ratones simultáneamente con insertos impresos en 3D. Los ajustes exactos de la temperatura del agua cálida, así como la entrada y las tasas de extracción de aire, dependerán de la instalación en cada sitio, incluyendo la distancia desde la sala de control hasta la resonancia magnética. Estos pueden configurarse en cada sitio mediante una serie de escaneos piloto donde se monitoriza la temperatura durante todo el proceso y luego se estandariza para cada estudio.

3. Configuración de preescaneo y calibración de imágenes

  1. Asegúrate de que los ratones estén en el centro de la bobina de la resonancia magnética a lo largo alineando el láser rojo con el centro de la cama multicámara antes de enviar el soporte de la cama al orificio.
  2. Asigna una etiqueta al escaneo usando el ID del ratón y la fecha del escaneo en el siguiente formato: Deformación, ID del ratón, Fecha de escaneo.
  3. Configura un escaneo FLASH ponderado T1 con un corte axial, dos cortes coronales y dos cortes sagitales para visualizar los ratones en el lecho de cuatro cámaras y definir el área de imagen usando los siguientes ajustes: TR/TE 50/2,4 ms, 2 promedios, ángulo de invertimiento 20°, resolución 0,313 mm, grosor de corte de 1 mm, tiempo de escaneo 13 s.
  4. Verifica que todo el cuerpo del ratón esté en el campo de visión y que los ratones estén rectos. Si no, repite los pasos de posicionamiento del ratón y/o mueve la cama del ratón dentro o fuera del orificio.
    NOTA: Estos parámetros se basaron en las especificaciones del sistema de resonancia magnética utilizado. Estos parámetros pueden ajustarse según sea necesario para optimizar la adquisición de imágenes según los requisitos experimentales y/o las capacidades del sistema de resonancia magnética.

4. Imagen por resonancia magnética multianimal

  1. Configura la secuencia de eco rápido de spin ponderada en T2 con los siguientes parámetros: Tiempo de repetición (TR): 3.200 ms, Tiempo de eco: 46 ms, Número de promedios: 10, Resolución en plano: 300 x 300 μm, Número de cortes coronales: 14, Espacio intraslice: 0,3 - 0,7 mm, Supresión de grasa: Activada, Factor raro: 8, Paquetes de cortes: 2, Tiempo total de adquisición de imagen: 14 min.
  2. Haz clic en el centro (traslación) y el borde (rotación) de las cajas amarilla y verde en la imagen localizadora para ajustar la posición del paquete de cortes según sea necesario y así optimizar la cobertura de la región del páncreas y otros órganos abdominales para el conjunto superior e inferior de animales.
  3. Confirma que los cuatro ratones estén correctamente alineados en la cama multianimal antes de proceder con el escaneo.
  4. Monitorizar la respiración durante las secuencias de imagen y ajustar el nivel de isoflurano si es necesario.
  5. Una vez completada la resonancia, comprueba que la calidad de imagen sea adecuada. Busca artefactos de movimiento, que se muestran como desenfoque, si un ratón se movió durante el escaneo. Comprueba que el abdomen cubra completamente. Si es necesario, recoloca los ratones y vuelve a hacer el escaneo.

5. Recuperación del ratón

  1. Cuando la exploración esté terminada y verificada, retira la cama del sistema de resonancia magnética.
  2. Abre la parte superior de la cama de varias cámaras. Retira el monitor respiratorio del ratón superior izquierdo y transfiere a los animales de la parte superior e inferior de los insertos impresos en 3D a la jaula de recuperación.
  3. Coloca a los animales en una jaula de recuperación sobre una almohadilla térmica a 37 °C para la recuperación postanestesia.
  4. Monitoriza la frecuencia respiratoria y el movimiento para asegurar una recuperación completa tras la anestesia antes de devolver a los ratones a las jaulas de casa. Los signos de recuperación incluyen respiración y movimiento normales (caminar).

6. Procesamiento y análisis de archivos por resonancia magnética

  1. Exporta las imágenes DICOM desde el software de resonancia magnética a un programa de análisis de imágenes para recortar las imágenes de una imagen con cuatro ratones a una imagen para cada ratón individual.
  2. En el software, abre la imagen del conjunto superior de animales en el módulo View . La configuración automática de ventana/nivel es suficiente, pero puedes ajustarla en la pestaña de control general de imagen si es necesario, para que los ratones sean visibles. En la pestaña VOI , dibuja manualmente un cuadro generoso alrededor de la parte superior derecha del ratón usando un objeto analítico tipo cubo; luego recorta la imagen alrededor de ese cuadro desde la pestaña de operaciones de enmascaramiento y contorno . Al guardar el nuevo archivo, editar los metadatos y el nombre del archivo DICOM al ID correcto del ratón; luego, repite para el ratón superior izquierdo usando la misma imagen, abre la imagen para el conjunto inferior de ratones y repite el recorte y guardado del retorno de inversión.
    NOTA: El VOI no tiene por qué ser preciso.
  3. Utiliza el software de visualización de resonancia magnética para analizar imágenes almacenadas en archivos DICOM.
  4. Analizar cortes de imagen desde dorsal hasta ventral o ventral a dorsal. Localiza el bazo y el estómago para establecer un contexto adecuado para la identificación de páncreas y/o tumores pancreáticos.
  5. Define la "Región de Interés" (ROI) dibujando una línea en el límite del tumor y realiza una segmentación semiautomatizada para calcular el volumen tumoral. Fíjate en quistes de líquido y otros hallazgos hipercromáticos (Figura 3 y Figura 4).
    NOTA: Se debe utilizar un visor de resonancia magnética para analizar archivos DICOM.

7. Tratamiento con gemcitabina

  1. Realizar resonancias magnéticas semanales a animales con KPC hasta que el tumor empiece a formarse y pueda detectarse (volumen de ≥20mm 3). Antes de hacer la exploración, asegúrate de que los ratones estén en buena salud (sin pérdida excesiva de peso ni signos de malestar, dificultad para respirar y/o jadeos).
  2. Establece un régimen de tratamiento una vez que se hayan cumplido los criterios tumorales.
    NOTA: Para el grupo tratado, la gemcitabina se inyectó intraperitonealmente (i.p.) a una dosis de 100 mg/kg dos veces por semana.
    PRECAUCIÓN: La gemcitabina es un agente quimioterapéutico citotóxico. Manipular con el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo guantes y bata de laboratorio. Eliminar jeringuillas y materiales contaminados conforme a los protocolos institucionales de residuos peligrosos.
  3. Realizar resonancias magnéticas (tras las secciones 1-6) una vez por semana para monitorizar la respuesta tumoral a la gemcitabina.
  4. Sacrificar animales cuando el tumor cumple los criterios de eutanasia basados en mediciones de volumen de la resonancia magnética (Sección 6) y/o otros síntomas.
  5. Cuando se realice una resonancia magnética en ratones tratados, se coloca una barrera protectora para evitar la posible transferencia del agente quimioterapéutico a través de las excreciones. Durante y después de trabajar con gemcitabina, sigue buenas prácticas de higiene personal. Desecha las jeringuillas vacías usadas en un recipiente para objetos punzantes de quimioterapia.
  6. Tras completar el trabajo, rocía todo el equipo de anestesia, las camas de resonancia magnética y todas las superficies de trabajo con etanol al 70%. Coloca barreras protectoras y guantes contaminados químicamente usados durante la imagen en una bolsa de plástico, ata la bolsa y colócala en un barril de fibra para incineración.
  7. Programa sesiones de imagen antes de la siguiente ronda de tratamiento para minimizar la exposición al agente quimioterapéutico.
    NOTA: Se puede considerar una frecuencia de resonancias magnéticas cada dos semanas dependiendo de la tasa de crecimiento tumoral y el régimen de tratamiento. Las respuestas al tratamiento mediante la cinética tumoral pueden evaluarse mediante imagen longitudinal (Figura 5).

Resultados

Los animales KPC desarrollan tumores pancreáticos a las 12 semanas de edadde 9 años. Utilizando una cama de resonancia magnética multicámara, se inició el cribado tumoral en ratones KPC a las 10 semanas de edad. Esto permitió reclutar animales con tumores de aproximadamente 200 mm3 para el estudio preclínico con el tratamiento con gemcitabina. Se observaron diferencias en la cinética tumoral y variaciones en la presentación tumoral. La mayoría de los tumores KPC mostraron un patrón de crecimiento sólido con un enfoque único o predominante (Figura 4A), lo que facilitó el reclutamiento animal para tratamientos y evaluación del volumen tumoral. Sin embargo, también se observaron animales con múltiples tumores sólidos pequeños distribuidos por todo el páncreas (Figura 4A). Algunos casos de PDAC también pueden presentar lesiones quísticas intratumorales llenas de líquido, acompañadas de lesiones quísticas peritumorales no neoplásicas y retención de líquidos resultante de una obstrucción ductal de la vesícula biliar y/o del páncreas. (Figura 4A).

Tras el reclutamiento, los animales fueron asignados aleatoriamente a dos grupos experimentales: un grupo de control que no recibió tratamiento y un grupo tratado que recibió administración intraperitoneal (p) de gemcitabina a una dosis de 100 mg/kg dos veces por semana. De los 23 animales elegibles en total, se asignaron 4 hembras y 7 machos al grupo de control, y 6 hembras y 6 machos al grupo tratado. Se realizaron resonancias magnéticas semanales utilizando el sistema de cama multianimal (Figura 5A), lo que nos permitió monitorizar continuamente los cambios en la cinética de crecimiento tumoral tanto en el grupo control como en el tratado (Figura 5B).

Los datos de imagen procesados demuestran que los tumores en el modelo KPC tratado con gemcitabina presentaron un patrón de crecimiento más lento en comparación con el grupo de control no tratado (Figura 5C), lo que se asoció con un aumento estadísticamente significativo (Log rank test, p = 0,04) en la supervivencia global de la cohorte tratada (Figura 5D). La supervivencia mediana para la KPC no tratada fue de 20 semanas, mientras que el grupo tratado mostró una prolongación de la supervivencia mediana de más de 23 semanas (Figura 5D).

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo del procedimiento de imagen por resonancia magnética multianimal, procesamiento y análisis de imágenes. Se destacan los pasos clave del protocolo de resonancia magnética multianimal desde la preparación previa hasta los estudios preclínicos guiados por imagen. Hasta 4 animales son anestesiados en una cámara de inducción (preparación preescaneada) y preparados para su colocación en una cama multianimal (sistema de cama de resonancia magnética multianimal). Una imagen preescaneada de los animales en configuración 2 x 2 (2 en el compartimento superior, 2 en el inferior) seguida de un escaneo por resonancia magnética (imagen por RM). Los datos de imagen de cada animal se guardan como archivos individuales y se analizan de forma independiente (Análisis de Imágenes). La búsqueda de imágenes y el tamaño tumoral se utilizan para seleccionar animales para estudios preclínicos y monitorizar la respuesta al tratamiento (ensayos preclínicos). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Pasos clave para una resonancia magnética multianimal desde la configuración hasta el escaneo. (A) Panel superior, montaje del sistema personalizado de cama de resonancia multianimal. Insertos de cama impresos en 3D diseñados a medida con puertos anestésicos integrados encajan en un soporte estándar para PET/MRI para una sola rata. En el panel inferior, estos insertos impresos en 3D dividen la cama en dos cámaras, permitiendo la imagen simultánea de hasta cuatro animales: los animales 1 y 2 en la parte superior del inserto superior, y los animales 3 y 4 en la parte superior del inserto inferior. Se muestran los planos transversales y los planos modificados frontales de los insertos de la impresora 3D desde el visor STL. (B) Colocación secuencial de ratones en una cama de resonancia magnética multicámara (de arriba a abajo). Imagen superior, dos animales colocados en posición ventral en la parte inferior (izquierda y derecha) del inserto impreso en 3D, que está dentro de la cama PET/MRI proporcionada por el fabricante. Imagen central, los otros dos ratones están colocados en posición ventral en la parte superior (izquierda y derecha) del inserto impreso en 3D; El ratón situado en el lado izquierdo del inserto superior lleva un monitor respiratorio acoplado. Imagen inferior: montaje terminado de cuatro animales con la cubierta superior. Todos los animales tienen cabezas sujetas en un cono nasale para mantener la anestesia (1,5-2% de isoflurano, 0,8-2 L/min de oxígeno). Disposición final de los cuatro animales en el soporte de cama para resonancia magnética con administración de anestesia, calentador de agua y sistema de monitorización de signos vitales para permitir escaneos por resonancia magnética y adquisición de datos de todos los animales en una sola sesión. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3
Figura 3: Recogida y procesamiento de datos a partir de resonancias magnéticas multianimal. (A) Vista representativa (plano medial) de la resonancia magnética inicial de los cuatro animales. (B) Escaneo de resonancia magnética (plano dorsal) de los cuatro ratones en una cama de varias cámaras: dos ratones situados en la parte inferior (3, 4) y dos ratones en la parte superior (1, 2) de los insertos impresos en 3D. (C) Archivo final de resonancia magnética de alta resolución de cada escaneo individual del ratón. Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Presentaciones diversas de tumores PDAC: análisis integrado de resonancia magnética e histológica. (A) Imagen representativa de resonancia magnética (plano dorsal) que ilustra la variabilidad anatómica de los tumores PDAC (de izquierda a derecha): páncreas normal, tumores multifocales con lesiones quísticas llenas de líquido y masa tumoral sólida. Los órganos anatómicos se codifican por colores de la siguiente manera: estómago (amarillo), bazo (verde), tumor (morado), acumulación de líquido debido a obstrucción de conductos (azul). Barra de escala blanca = 1 cm. (B) Secciones histológicas de tumores teñidos con H&E junto a clases celulares basadas en superposiciones de clasificadores entrenados asistidos por ordenador, destacando las características histopatológicas de los tumores alineadas con los hallazgos de la resonancia magnética. Área tumoral (T) delimitada en negro para todas las muestras cuando el tumor está presente. Las clases celulares se muestran en color: tejido pancreático normal (gris), tumor (rojo) y células inmunitarias (amarillo). Barra de escamas negras = 0,5 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Aplicación de resonancia magnética multianimal para el reclutamiento de animales y el seguimiento del crecimiento tumoral durante el tratamiento con gemcitabina. (A) Cronología del diseño experimental: Se reclutaron animales (14+ semanas de edad) tras una resonancia magnética que detectó un tumor ≥ 200 mm3. Los ratones del grupo tratado recibieron gemcitabina (100 mg/kg, i.p., b.i.w.) hasta alcanzar los criterios de eutanasia. Durante todo el experimento se realizaron resonancias magnéticas multianimales para todos los animales para monitorizar la cinética del crecimiento tumoral. (B) Imágenes representativas de resonancia magnética (plano dorsal) que muestran la progresión tumoral de un animal del grupo no tratado y uno del grupo tratado, desde el día 0 hasta el último día del experimento (punto final de supervivencia). Barra de escala blanca = 1 cm. (C,D) Gráficos que ilustran la cinética de crecimiento tumoral (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) y la supervivencia global (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) en el grupo no tratado y tratado. La significación estadística para las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se determinó mediante la prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox) (* p < 0,05). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Archivo STL para impresión 3D del inserto inferior con puertos anestésicos integrados que cabe en un soporte estándar para camas PET/MRI de una sola rata. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Archivo STL para impresión 3D del inserto superior con puertos anestésicos integrados que cabe en un soporte estándar para PET/MRI de una sola rata. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo utiliza una cama estándar de PET/MRI para ratas individuales proporcionada por el fabricante, modificada con insertos impresos en 3D hechos a medida, que permiten el escaneo simultáneo de hasta cuatro ratones (Figura 1). Esta configuración multianimal reduce sustancialmente no solo el costoso tiempo de escaneo de resonancia magnética, sino también la duración total del procedimiento. Permite la preparación paralela (anestesia, colocación en cama y carga de cama), escaneo y recuperación de cuatro animales en una sola sesión, en comparación con el tiempo adicional requerido para preparar, escanear y recuperar a cada animal individualmente en cuatro sesiones separadas. El montaje también incluye conos nasales individuales para la administración controlada de anestesia a cada animal, monitorización vital dedicada para cada animal y capacidades integradas de calefacción para mantener la temperatura corporal de todos los ratones escaneados (Figura 2). Los insertos impresos en 3D proporcionan una alineación consistente de los animales y mejoran la consistencia de la segmentación. La monitorización respiratoria en tiempo real permite la evaluación y ajuste continuos de la anestesia durante el escaneo, minimizando así los artefactos de movimiento.

Este protocolo se utilizó para detectar y monitorizar longitudinalmente la progresión del tumor pancreático en el modelo KPC (Figura 5A-C) tratado con el agente quimioterapéutico gemcitabina, sirviendo como prueba de concepto para un estudio preclínico. La gemcitabina, sola o en combinación, es un tratamiento de primera o segunda línea para pacientes con cáncer de páncreas local ometastásico 28,29,30. Estos resultados en animales tratados con gemcitabina son consistentes con informes previos, que también han mostrado un beneficio desupervivencia 31. Más importante aún, este protocolo proporciona una plataforma adecuada y robusta para estudiar terapias combinadas de nuevos agentes terapéuticos y quimioterapia SOC en el modelo KPC o modelos similares de PDAC. Estas terapias combinadas pueden ser inhibidores de moléculas pequeñas, inmunoterapia, siRNAs, moduladores de la actividad de microARN y otros oligonucleótidos terapéuticos contra objetivos molecularesclave 20,21,22,23,24,25,26,27 . Estas terapias combinadas también pueden incluir dianas genéticamente modificadas para comprender su interacción con la quimioterapia SOC u otras terapias en una fase temprana deldesarrollo 9,20,32.

Aunque el enfoque de este protocolo es la imagen del páncreas y otros órganos de la cavidad abdominal, este protocolo multianimal y las secuencias descritas de resonancia magnética pueden aplicarse para la caracterización anatómica de otros modelos murinos de cáncer, como el cáncer de mama y glioblastoma, u otras enfermedades que afectan al riñón y/oal hígado 33. Conocemos otros protocolos que describen la resonancia magnéticamultianimal 18,34. Por ejemplo, Dazai et al. describieron escaneos de resonancia magnética neuroanatómica de hasta sieteratones 18. Aunque este sistema permite la imagen cerebral de siete animales, no permite el control individual de la anestesia y la temperatura para cada ratón. Su cámara de alojamiento está diseñada para ratones que pesan menos de aproximadamente 32 g; En cambio, nuestra cama multiroom soporta una gama más amplia de tamaños corporales de ratón. Dependiendo del órgano previsto, el tiempo de escaneo y la resolución, el protocolo de Dazai et al. puede ofrecer algunas ventajas sobre el protocolo descrito aquí.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado, en parte, por la subvención R01 CA258314 del Instituto Nacional del Cáncer y la subvención MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research edición 2024 a LFS. Estamos agradecidos al Núcleo de Análisis de Tejidos del Programa de Salud de Precisión de MSU, a la Instalación Avanzada de Imagen Molecular del Instituto de Ciencias y Ingeniería Cuantitativa de la Salud de la Salud de MSU/Programa de Salud de Precisión, a los Recursos Animales del Campus de MSU, al Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de MSU y al Centro de Análisis y Mapeado Cuantitativo de Bioelementos (QBEAM) por su asistencia técnica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Impresora 3D StratasysJ750 Para insertos de cama de resonancia magnética multi-animal
Gemcitabina HClApexBioA1402-500Para inyecciones de IP y nbsp;
HOROSHOROShttps://horosproject.org/Para el análisis de resonancia magnética
IsofluranoCovetrus11695067772Para anestesia de ratón
Vaporizador de isofluranoSOMNI ScientificVS6002Para anestesia de ratón
Jeringuillas de insulina U-100 de dosis bajaBD14-826-79Para inyecciones de IP y nbsp;
Acoplamientos de tubo Luer Lock, bujones rectos de nailon, con púas para diámetro de tubo de 1/16" x7McMaster51525K521Para montaje de camas de resonancia magnética multi-animales
acoplamientos de tubo Luer Lock, tapón, para tubo de bardo de 1/16" de diámetro x2McMaster7466N11Para montaje de camas de resonancia magnética multi-animales
Conector Luer macho a macho X2SAIMMLPara montaje de camas de resonancia magnética multi-animales
Sistema de monitorización y repuerta de pequeños animales compatible con RMSAIIModelo 1030monitorizar animales durante la resonancia magnética
Adaptador de cama para resonancia magnéticaBrukerT150743Componente de cama de resonancia magnética proporcionada por el proveedor
Bobina de resonancia magnética, 72 mm de diámetro internoBrukerT20209V3Bobina de resonancia magnética proporcionada por el proveedor
Rata media multimodal de cunaBrukerT151629Camilla de resonancia magnética proporcionada por el proveedor
lubricante oftálmico  Covetrus75848Para su uso durante la anestesia
Software ParaVision 360Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlPara el análisis de resonancia magnética
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlPara el análisis de resonancia magnética
sistema de resonancia preclínica y nbsp;BrukerBioSpec 70/30Para la resonancia magnética
Resina Stratasys Vero ClearStratasysRGD810Para fabricación de camas de resonancia magnética multi-animales
Conectores de toma a cavidad en T, tubo Luer Lock x2McMaster51525K443Para cama de resonancia magnética de varios animales y nbsp;
tubería (diámetro interior 1/16", diámetro exterior 1/8")BrukerT12330Para montaje de camas de resonancia magnética multi-animales

Referencias

  1. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  2. Lafaro, K. J., Melstrom, L. G. The paradoxical web of pancreatic cancer tumor microenvironment. Am J Pathol. 189 (1), 44-57 (2019).
  3. Kleeff, J., et al. Pancreatic cancer. Nat Rev Dis Primers. 2, 16022(2016).
  4. Collisson, E. A., Bailey, P., Chang, D. K., Biankin, A. V. Molecular subtypes of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (4), 207-220 (2019).
  5. Grimm, J., Potthast, A., Wunder, A., Moore, A. Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer. 106 (5), 806-811 (2003).
  6. Ireson, C. R., Alavijeh, M. S., Palmer, A. M., Fowler, E. R., Jones, H. J. The role of mouse tumour models in the discovery and development of anticancer drugs. Br J Cancer. 121 (2), 101-108 (2019).
  7. Westphalen, C. B., Olive, K. P. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer. Cancer J. 18 (6), 502-510 (2012).
  8. Cook, N., Olive, K. P., Frese, K., Tuveson, D. A. K-ras-driven pancreatic cancer mouse model for anticancer inhibitor analyses. Methods Enzymol. 439, 73-85 (2008).
  9. Schipper, J., et al. Loss of microRNA-21 leads to profound stromal remodeling and short survival in K-ras-driven mouse models of pancreatic cancer. Int J Cancer. 147 (8), 2265-2278 (2020).
  10. Uprety, D., Adjei, A. A. KRAS: from undruggable to a druggable cancer target. Cancer Treat Rev. 89, 102070(2020).
  11. Buscail, L., Bournet, B., Cordelier, P. Role of oncogenic KRAS in the diagnosis, prognosis and treatment of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (3), 153-168 (2020).
  12. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
  13. Farr, N., et al. Noninvasive characterization of pancreatic tumor mouse models using magnetic resonance imaging. Cancer Med. 6 (5), 1082-1090 (2017).
  14. Yin, T., Liu, Y., Peeters, R., Feng, Y., Ni, Y. Pancreatic imaging: current status of clinical practices and small animal studies. World J Methodol. 7 (3), 101-107 (2017).
  15. Rojas, J. D., et al. Validation of a combined ultrasound and bioluminescence imaging system with magnetic resonance imaging in orthotopic pancreatic murine tumors. Sci Rep. 12 (1), 102(2022).
  16. Vohra, R., et al. Evaluation of pancreatic tumor development in KPC mice using multiparametric MRI. Cancer Imaging. 18 (1), 41(2018).
  17. Serkova, N. J., et al. Preclinical applications of multi-platform imaging in animal models of cancer. Cancer Res. 81 (5), 1189-1200 (2021).
  18. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse neuroanatomical magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (48), e2497(2011).
  19. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  20. Sempere, L. F., Powell, K., Rana, J., Brock, A. A., Schmittgen, T. D. Role of non-coding RNAs in tumor progression and metastasis in pancreatic cancer. Cancer Metastasis Rev. 40 (1), 1-20 (2021).
  21. Smith, E. S., et al. Clinical applications of short non-coding RNA-based therapies in the era of precision medicine. Cancers (Basel). 14 (6), 1588(2022).
  22. Sempere, L. F., Keto, J., Fabbri, M. Exosomal microRNAs in breast cancer towards diagnostic and therapeutic applications. Cancers (Basel). 9 (7), 71(2017).
  23. Sempere, L. F., Azmi, A. S., Moore, A. MicroRNA-based diagnostic and therapeutic applications in cancer medicine. Wiley Interdiscip Rev RNA. 12, e1662(2021).
  24. Nakisa, A., et al. Tumor-associated carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9), a promising target for antibody-based detection, diagnosis, and immunotherapy of cancer. ChemMedChem. 19 (24), e202400491(2024).
  25. Miller, A. L., Garcia, P. L., Yoon, K. J. Developing effective combination therapy for pancreatic cancer: an overview. Pharmacol Res. 155, 104740(2020).
  26. Dreyer, S. B., Beer, P., Hingorani, S. R., Biankin, A. V. Improving outcomes of patients with pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 22 (6), 439-456 (2025).
  27. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 17 (2), 108-123 (2020).
  28. Koltai, T., et al. Resistance to gemcitabine in pancreatic ductal adenocarcinoma: a physiopathologic and pharmacologic review. Cancers (Basel). 14 (10), 2486(2022).
  29. Casper, E. S., et al. Phase II trial of gemcitabine (2,2′-difluorodeoxycytidine) in patients with adenocarcinoma of the pancreas. Invest New Drugs. 12 (1), 29-34 (1994).
  30. Moore, M. Activity of gemcitabine in patients with advanced pancreatic carcinoma: a review. Cancer. 78 (3 Suppl), 633-638 (1996).
  31. Ho, T. T. B., et al. Combination of gemcitabine and anti-PD-1 antibody enhances the anticancer effect of M1 macrophages and the Th1 response in a murine model of pancreatic cancer liver metastasis. J Immunother Cancer. 8 (2), e001367(2020).
  32. Kempinska, K., et al. Genetic ablation of microRNA-10b improves treatment outcomes in mouse models of pancreatic cancer. Cancer Res. 84 (6 Suppl), Abstract 467 (2024).
  33. Fan, J., et al. Species-specific hepatic uptake of [64Cu]Cu-EOB-NOTA, a newly designed hepatospecific PET agent. Mol Imaging Biol. 27 (3), 305-312 (2025).
  34. Ramirez, M. S., Esparza-Coss, E., Bankson, J. A. Multiple-mouse MRI with multiple arrays of receive coils. Magn Reson Med. 63 (3), 803-810 (2010).

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