Mediciones Automatizadas de Ultradilución de la Autoasociación para la Identificación de Anticuerpos con Propiedades Favorables de Solución de Alta Concentración

Resumen

Aquí describimos una adaptación de alto rendimiento de un ensayo de estabilidad coloidal de anticuerpos a gran escala para generar grandes conjuntos de datos y apoyar predicciones de desarrollo listas para IA/ML.

Resumen

Uno de los principales retos en la ingeniería de anticuerpos es el desarrollo de métodos analíticos de cribado para evaluar la estabilidad coloidal, asegurando que los biológicos sean adecuados para la formulación y administración en alta concentración. La espectroscopía de nanopartículas de autointeracción con autointeracción estabilizada por carga (CS-SINS), una versión modificada de la espectroscopía convencional de nanopartículas de autointeracción por captura de afinidad (AC-SINS), ha sido adaptada como una evaluación robusta de estabilidad coloidal para predecir el comportamiento de soluciones de alta concentración. Este método permite decisiones críticas de desarrollo en etapas tempranas identificando problemas de estabilidad coloidal antes de invertir recursos significativos, reduciendo sustancialmente las tasas de abandono aguas abajo y acelerando los plazos de selección de candidatos. Este estudio demuestra que el ensayo se integra perfectamente en los flujos de trabajo de descubrimiento existentes y puede realizarse en paralelo con ensayos típicos en fase inicial debido a sus mínimos requisitos muestrales, proporcionando datos valiosos para predecir comportamientos de alta concentración sin comprometer otros esfuerzos de caracterización. Se ha demostrado que las mediciones rutinarias de dispersión dinámica de la luz (DLS), además del desplazamiento en la longitud de onda de la resonancia del plasmón, pueden mejorar la fiabilidad del método HTP descrito aquí. En conjunto, se prevé que la validación cruzada mediante mediciones DLS y programas de análisis automatizados facilite la selección fiable de terapias candidatas a anticuerpos de diversas modalidades.

Introducción

En el desarrollo y formulación de anticuerpos terapéuticos, la opalescencia y la viscosidad son consideraciones clave para desarrollar un producto comercial centrado en^{el paciente} 1,2,3,4,5,6,7,8. Clásicamente, se requieren grandes cantidades de proteína para observar directamente estas propiedades a altas concentraciones, lo que impide efectivamente una identificación óptima de los plomos durante las primeras etapas del descubrimiento de anticuerpos, donde la disponibilidad de proteínas es limitada. La identificación fiable de estos fenómenos es fundamental para las evaluaciones de desarrollabilidad que mitiguen un mal comportamiento de soluciones de alta concentración aguas^abajo 1,2,3,4,5,6,7,8. Por ello, existe un interés significativo en métodos de alto rendimiento y baja concentración que predicen un mal comportamiento de solución en concentraciones^elevadas 9,10,11,12,13,14,15,16. Uno de estos métodos, kD-DLS, ha demostrado ser fiable para predecir propiedades de alta concentración pero no cumple con los requisitos de bajo consumo de proteínas y alto rendimiento de los flujos de trabajo en etapas^{tempranas 12,13}.

Recientemente, se ha demostrado que un ensayo basado en nanopartículas de oro de consumo ultrabajo conocido como CS-SINS tiene una fuerte correlación con los resultados de los experimentos kD-DLS y es razonablemente eficaz para predecir propiedades de solución pobres en alta concentración¹⁶. Estas características hacen de CS-SINS un candidato ideal para su desarrollo como herramienta de cribado de alto rendimiento. El ensayo CS-SINS emplea un anticuerpo de captura inmovilizado en superficies de nanopartículas de oro para anclar los anticuerpos candidatos a través de sus regiones Fc, dejando los brazos Fab accesibles a las interacciones de la solución. Esta configuración significa que las interacciones Fab-Fab dominan la señal de autoasociación medida, lo cual es ventajoso ya que los estudios indican que los dominios Fab contribuyen predominantemente a las características de autoasociación de mAb, probablemente debido a las propiedades superficiales de la región determinante de complementariedad (CDR⁾ 17,18,19,20,21,22,23 . Esta base mecanicista hace que CS-SINS sea especialmente adecuado para predecir riesgos de estabilidad coloidal relevantes para formulaciones de alta concentración. Métodos alternativos de HTP, como la cromatografía de adsorción monocapa de pie (SMAC), un enfoque basado en columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) que simula la autoasociación con una fase estacionaria genérica, y la cromatografía de interacción cruzada (CIC), implican la preparación de columnas y los requisitos de muestras^grandes 17,24,25,26,27.

El método descrito aquí detalla una configuración validada por placa del ensayo CS-SINS y permite el cribado de HTP mediante automatización y análisis en laboratorio, combinando las ventajas de los métodos existentes y aumentando la fiabilidad de los resultados. Este estudio también demuestra cómo varios tipos de muestras ofrecen resultados de alta calidad debido a la naturaleza del enriquecimiento de la autointeracción en el ensayo, estableciendo que el método es agnóstico respecto a las fuentes proteicas. Además, consideramos cómo la comunicación temprana de las propiedades coloidales a los equipos de proyecto puede apoyar aún más el diseño estratégico de fármacos multicuerpos^{multiespecíficos} 28,29,30,31,32,33,34.

El estudio de las propiedades de la solución de alta concentración se realiza típicamente aguas abajo en campañas de selección de candidatos multiespecíficas, tras la selección de la pista y la finalización de la ingeniería (Figura 1A). La predicción temprana de estas propiedades se ha vuelto factible con métodos como CS-SINS, que requieren unos pocos microgramos de muestra, prediciendo así los riesgos de estabilidad coloidal con mediciones^{ultradiluidas 16}. La introducción de cribado temprano de desarrollabilidad (Figura 1A), cuando el grupo de candidatos es grande, y campañas paralelas de generación de datos tanto para formatos monoespecíficos como multiespecíficos podrían informar mejor el proceso de descubrimiento de^{fármacos 31,32}. HTP CS-SINS encaja en el paradigma existente de cribado molecular en paralelo a la unión y la determinación de función, añadiendo así al paquete de información sin interrumpir ni retrasar los flujos de trabajo existentes. La selección de candidatos principales, con énfasis en propiedades coloidales favorables, influirá en la progresión de la selección, tal como se representa en la Figura 1B.

En el flujo de trabajo propuesto para el cribado de desarrollo temprano, la identificación de leads considera el panorama completo de las propiedades favorables del medicamento, incluyendo la fabricación y el acceso del paciente, optimizando así el desarrollo posterior³⁴. Las propiedades de alta concentración de los biológicos pueden determinar su vía de administración: inyecciones intravenosas que requieren visitas hospitalarias o inyecciones subcutáneas, que pueden ser administradas en casa por el paciente, pero que a menudo requieren un producto de alta^{concentración 35,36}. Los Mab desarrollables con baja autoasociación suelen formularse a >100 mg/mL ^5,35. La optimización de formulaciones utilizando excipientos, como agentes visco-reductores, puede superar los riesgos de estabilidad coloidal para candidatos deseables con malas propiedades de solución en las etapas de desarrollo^{CMC 34,35}. Sin embargo, esto introduce desafíos posteriores en la fabricación biofarmacéutica y alarga los plazos para aprobarlos exitosos^{de medicamentos 36}. Los excipientes conocidos por reducir la viscosidad (como sales y aminoácidos) también pueden afectar la estabilidad de las proteínas, alterando los perfiles de desarrollabilidad previamente caracterizados y complicando aún más el^{proceso 36,37}. Además, el exceso de excipientes puede limitar la población de pacientes debido a consideraciones de inmunogenicidad, diversas preocupaciones de seguridad o afectar la adherencia al tratamiento y puede introducir nuevos desafíos en el ámbito de producción 38,39,40. Starr et al. publicaron por primera vez el método CS-SINS, describiendo la fracción másica óptima de PLL e IgG como 0,03 y confirmando la estabilización de nanopartículas mediante mediciones de potencial zeta para la autoasociación de mAb en formulaciones^{de histidina 16}. Cabe destacar que añadir demasiada PLL genera sobreestabilización en el ensayo e impide la observación de la autointeracción de los mAb (la mejora de la estabilidad de las nanopartículas de oro mediante PLL se muestra en la Figura Suplementaria 1). El uso de formulaciones de histidina sin sal minimiza el cribado electrostático (aumentando la longitud de Debye), lo que amplía el rango de interacciones intermoleculares, amplificando así señales débiles de autoasociación y imitando comportamientos de alta concentración cuando los anticuerpos están más cerca. En general, se prefieren formulaciones de baja resistencia iónica para formulaciones de alta concentración donde no se observa autoasociación.

Los polímeros PLL grandes impiden la ocupación de más mAbs de captura en las superficies de las nanopartículas de oro, lo que reduce la ventana de desplazamiento plasmónico y requiere un programa de ajuste de curvas más sofisticado y análisis para el análisis posterior de datos. Este estudio utilizó una herramienta de portal web que se sincroniza con bases de datos internas. La principal ventaja de este coste inicial es el potencial de construcción de datos de un gran conjunto de secuencias para maximizar la diversidad de candidatos aguas abajo y mitigar cuellos de botella en las etapas de desarrollo más^{costosas 34, 35, 36}. El ensayo CS-SINS que describimos aquí destaca como un método compatible con HTP, que ha demostrado correlacionarse bien con ensayos de estabilidad coloidal^{en etapa avanzada 16}. Se está desarrollando un perfilado asistido por IA para el diseño reflexivo de multiespecíficos para futuros programas y para la comprensión de las contribuciones individuales de cada dominio en formatos^{complejos 41,42,43,44}. Estos esfuerzos influirán colectivamente en los metaanálisis y en una determinación más detallada de las propiedades de estabilidad coloidal para las terapias de anticuerpos, y por tanto, en última instancia, ahorrarán tiempo en las primeras etapas de investigación y desarrollo.

Protocolo

La Figura 2 muestra la preparación de la conjugación de nanopartículas, la Figura 3 muestra el flujo de trabajo en su totalidad, la Figura 4 traza el proceso de automatización de laboratorio y la Figura 5 contiene un diagrama de la cadena de análisis de datos. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los tampones

NOTA: Semana 1 (preparación de muestras)

1. Preparar histidina (10 mM), pH 6,0 (muestra y tampón de ensayo).
   NOTA: Estos pasos se realizan el Día 1.
   1. Disuelva 5 mM de monocloruro monocloruro de L-histidina y 5 mM de L-histidina en agua ultrapura. Añade ácido clorhídrico gota a gota mientras se remueve hasta que el pH alcance 6,0, medido con un medidor de pH calibrado.
   2. Filtra la solución a través de un filtro de 0,22 μm de tamaño poro bajo vacío y recoge el filtrado en una botella estéril.
   3. Mide la conductividad para fines de control de calidad y asegúrate de una lectura de aproximadamente 500 μS/cm.
2. Preparar acetato de potasio (20 mM), pH 4,3 (tampón de conjugación de captura mAb).
   1. Disuelve acetato de potasio en agua ultrapura y ajusta el pH a 4,3 con ácido acético glacial.
   2. Esteriliza la solución mediante filtración al vacío a través de un filtro de 0,22 μm del tamaño de un poro, como se describe en el paso 1.1.2.
3. Prepara poli-L-lisina.
   1. Prepara una solución de fondo de 5 mg/mL en agua ultrapura y guárdala a −20 °C hasta su uso.

2. Diálisis de todas las muestras (candidatos mAbs)

NOTA: Realiza estos pasos en los días 2 a 5.

1. Pre-remojo 100 μL o 300 μL de dializadores en 10 mM de histidina, pH 6,0, durante 5 minutos.
2. Transfiere todas las muestras (50–100 μL) a casetes de diálisis. Sumergir los casetes en un tampón de histidina de 10 mM, pH 6,0 (700 mL por caja), añadir barras agitadoras a los depósitos, colocar los depósitos sobre placas magnéticas de agitación e incubar a 4 °C durante 2 h 15 min.
3. Realizar siete intercambios de tampón con histidina de 10 mM, pH 6,0, cada 2 h 15 min, o realizar cuatro intercambios de tampón durante la noche para asegurar la eliminación completa de la sal de las muestras.
4. Recuperar las muestras, transfiértalas a viales de matriz limpia y almacenarlas a 4 °C hasta que se realice el ensayo CS-SINS.
5. Mide las concentraciones de la muestra y registra la información de polidispersión tras la diálisis. Calcula las concentraciones corregidas dividiendo los valores de absorbancia bruta a 280 nm por la absorbancia a 280 nm para una solución de 1 mg/mL.
6. Prepara el archivo de entrada del manejador de líquidos con las direcciones y concentraciones del pozo (μg/mL), incluyendo los controles.

3. Intercambio de búfer de captura mAb (Figura 2, paso 1)

NOTA: Realiza estos pasos el Día 1 de la Semana 2 (ensayo).

1. Retira el buffer de almacenamiento de las columnas de desalación de 2 mL centrifugando durante 2 minutos a 1.000 × g a temperatura ambiente. Prepara dos columnas de desalación por cada 700 μL de mAb de captura necesario. Descarta el flujo de paso tras cada paso de centrifugación.
2. Lava las columnas tres veces con 1 mL de buffer de acetato de potasio de 20 mM, pH 4,3. Centrifuga las columnas durante 2 minutos a 1.000 × g en cada lavado.
3. Añade 700 μL de captura mAb (anticuerpo antihumano específico de cabra Fcγ) a cada columna y eluye en un tubo fresco de 15 mL centrifugando durante 2 minutos a 1.000 × g.
4. Recoge el eluato desalado, aplícalo a una segunda columna de desalación equilibrada y centrifuga durante 2 minutos adicionales a 1.000 × g.
5. Combina todas las muestras eluidas.
6. Mide la concentración de la solución de mAb de captura tras la desalación como se describe en los días 2–5, paso 2.5.
7. Diluye la solución de captura de MAb a 0,8 mg/mL con 20 mM de buffer de acetato de potasio, pH 4,3, y déjala reservar hasta su uso.

4. Preparación de un material de trabajo de poli-L-lisina

1. Diluye una pequeña alicota de la solución de poli-L-lisina a 2,66 mg/mL con agua ultrapura.

5. Concentración de nanopartículas de oro (Figura 2, paso 2)

1. Preparar 1,2 mL de alicotas de la suspensión original en tubos de 1 mL o alicotas de 4,8 mL en tubos de 5 mL utilizando tubos microcentrífugas de polipropileno que contengan nanopartículas de oro de 20 nm. Centrifugar a 21.130 × g durante 6 minutos.
2. Retirar los sobrenacionantes (~1,1–1,15 mL) sin molestar los pellets y transfierelos a un tubo cónico separado.
3. Combina los pellets concentrados y los volúmenes residuales en un tubo de microcentrífuga limpio. Determinar el volumen de nanopartículas pipeteando y ajustar el volumen a (número de tubos de 1 mL × 50 μL) o (número de tubos de 5 mL × 200 μL) usando el sobrenadante reservado. Por ejemplo, tras centrifugar 10 alícuotas de 1,2 mL en tubos de 1 mL, ajusta el volumen final de las nanopartículas concentradas a 500 μL.

6. Ensamblaje de nanopartículas

1. Mezcle cuidadosamente 1,5 μL de la solución de trabajo poli-L-lisina con 48,5 μL del mAb de captura intercambiado por tampón (Figura 2, paso 3).
2. Prepara una mezcla 1:1 de la solución concentrada de nanopartículas del paso 5 y la solución de poli-L-lisina/captura mAb del paso 6.1 (Figura 2, paso 4).
3. Incubar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente (23 °C) (Figura 2, paso 5).

7. Montaje de placas de ensayo para manipuladores de líquidos

NOTA: Realiza estos pasos en el Día 2.

1. Compila los materiales necesarios para el ensayo, incluyendo anticuerpos diálisis, el archivo de entrada del manipulador de líquidos que contiene concentraciones postdiálisis, nanopartículas de oro conjugadas, puntas de manipulación robótica, placas y reservorios (Figura 3, Automatización de Laboratorio, paso 1). Precarga las puntas, muestras, placas y depósitos en la plataforma según el diseño mostrado en la Figura 3 (Automatización de Laboratorio, paso 1).
2. Añadir los controles a los pozos A12–D12 de la placa de muestra (dos controles positivos y dos controles negativos). Deja el pozo H12 vacío para la muestra tampón preparada por el manipulador de líquidos.
3. Abre el método de manipulador de líquidos CS-SINS y comienza el programa (Figura 3, Automatización de Laboratorio, pasos 2–3). Carga el archivo de entrada del manejador de líquidos cuando se le indique e introduce el número de muestras (Figura 4A). Revisa las dos ventanas posteriores de comprobación de cálculo (Figura 4B, C), confirma los valores y procede con la ejecución.
4. Normalizar las muestras, incluidas las de control, a 55,5 μg/mL en un tampón de histidina de 10 mM, pH 6,0, transfiriéndolas desde los tubos de muestra matricial a la placa de reacción en cadena de la polimerasa en un volumen final de 100 μL (Figura 4D, paso 1). Observa el progreso, observando que las áreas de placas terminadas aparecen grises y los pasos activos están resaltados en verde (Figura 4E).
5. Preparar una dilución de mayor volumen de cada muestra a 11,1 μg/mL en un tampón de histidina de 10 mM, pH 6,0, transfiriendo material desde la placa de reacción en cadena de la polimerasa a un bloque de pozo profundo a un volumen final de 200 μL (Figura 4D, paso 2).
6. Permite que el sistema se pause después del paso 2. Cuando se le pida, mezcla las nanopartículas de oro concentradas preparadas en el paso 6.3 invirtiendo el tubo y pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.
   1. Distribuir las nanopartículas de manera uniforme entre dos tubos de microcentrífuga de polipropileno y colocar los tubos, con las tapas abiertas, en la ubicación designada del rack de tubos en la cubierta (Figura 4D, resaltada "AuNP"). Reanuda la operación y permite que el manipulador de líquidos dispense 20 μL de nanopartículas en cada pozo del segundo bloque de pozo profundo, dos pozos a la vez (Figura 4D, paso 3).
7. Permitir que el manipulador de líquidos transfiera 192 μL de muestra desde el bloque de pozo profundo que contiene las muestras de 11,1 μg/mL (Figura 4D, paso 2) al segundo bloque de pozo profundo y mezcle bien. Genera una mezcla master de 4× CS-SINS para cada muestra, resultando en una concentración final de 10 μg/mL tras la adición de 48 μL de nanopartículas de oro a un volumen final de 240 μL (Figura 4D, paso 3). Empieza el cronómetro de incubación de 4 horas en este punto.
8. Permitir que el manipulador de líquidos dispense 30 μL en el pozo fuente y luego dispense 60 μL en tres de los cuatro pozos de cada cuadrante de una placa de 384 pozos para generar triplicados técnicos para cada muestra (Figura 4D, paso 4). Devuelve los 30 μL restantes a la placa fuente.
9. Monitoriza la disposición de la cubierta de manejadores de líquidos a medida que avanza la partida. Observa las puntas utilizadas y los pozos de muestra llenos cambiando de gris claro a gris oscuro en tiempo real, mientras que los movimientos activos se indican en verde (Figura 4E).
10. Quita la placa tras completar la prueba. Sella la placa con un sello transparente mínimamente adhesivo e incuba a temperatura ambiente durante un total de 4 horas. En el punto de tiempo de 3,5 horas, inicie el programa dinámico de dispersión de la luz para equilibrar la cámara a 20 °C usando los ajustes mostrados en la Figura Suplementaria 2.
11. Mide el espectro de absorbancia de cada pozo de 510 a 570 nm en incrementos de 1 nm (30 nm a cada lado del pico) en el punto de tiempo de 4 horas.
12. Mide inmediatamente la placa usando el lector de placas de dispersión dinámica de luz en el punto de tiempo de 4,5 horas con los ajustes mostrados en la Figura Suplementaria 2.
    NOTA: Utilice un lector de placas de alto rendimiento para mediciones espectrales debido al rango dinámico limitado. No uses la función de lectura rápida.

8. Análisis de datos (Figura 5, Esquema de procesamiento de datos)

1. Exporta los archivos raw desde la plataforma de espectrofotómetros y guárdalos en una carpeta accesible de la unidad.
2. Accede al portal web de scripting vinculado al servidor interno. Introduce los parámetros de entrada requeridos de CS-SINS, incluyendo: (1) Longitud de onda inicial; (2) Ubicación del directorio del archivo de resultados en bruto; (3) Conjunto de matrículas e identificadores de candidatos; (4) Direcciones de pozo de control positivas y negativas para normalización; (5) Designación de configuración del método ("Manual" o "Manipulador de líquidos"); (6) Instrumentos utilizados para mediciones de escaneo espectral y dispersión dinámica de la luz; (7) Identificador de cuaderno electrónico de laboratorio (ELN); (8) Fecha de adquisición.
3. Envía los parámetros al portal web y verifica que se generen tres archivos Excel en una subcarpeta del directorio de resultados en bruto.
4. Calcula los valores λmax usando el script de ajuste de curvas ejecutado por el portal web.
5. Revisa los dos archivos de salida que contienen valores de réplica, resultados normalizados y gráficos representativos para las mediciones de escaneo espectral y dispersión dinámica de la luz.
6. Utiliza el tercer archivo de salida, que contiene metadatos del ensayo y resultados normalizados, para crear resultados de laboratorio masivo en la interfaz de usuario de la base de datos. Definir los atributos de los informes según los requisitos específicos del grupo y subir los resultados a la base de datos para permitir el acceso a nivel de toda la empresa.

Resultados

La Figura 6 muestra los resultados, la Figura Suplementaria 3A muestra un ejemplo de puntuación CS-SINS de una muestra representativa de crudo y purificada, la Figura Suplementaria 3B muestra la variabilidad de la señal de pozo a pozo en diferentes días, la Figura Suplementaria 4 contiene los resultados del proceso de validación de placas, y la Figura Suplementaria 5 describe el cálculo de normalización para ambas lecturas CS-SINS.

Es importante destacar que se recogieron muestras con concentraciones reportadas de al menos 55 μg/mL tras la diálisis en 10 mM de histidina, pH 6,0, para garantizar la viabilidad del ensayo, ya que esta es la concentración mínima de stock (un mínimo de 6 μg por muestra) y se crearon nuevos identificadores hijos. En total, había 70 muestras purificadas y 20 muestras de expresión de crudo, cada una representando tipos de muestras en diferentes puntos de control de desarrollo (purificadas en la fase de optimización de plomo y materia cruda purificada en 1 o 2 pasos desde la etapa de identificación de plomo destacada en la Figura 1A). El material crudo se generó a partir de un sistema de expresión mamífero totalmente automatizado, la Plataforma de Expresión y Purificación de Proteínas (PEPP; GNF, San Diego, CA, EE. UU.). Los controles se derivaron de material comercial y previamente se validaron como si tuvieran valores de viscosidad máxima o mínima, kD-DLS y CS-SINS. Las alicuotas frescas se almacenan a -80°C, y se utiliza una nueva alicuota para cada ensayo.

Las figuras 6A y B muestran las puntuaciones medias espectrales y DLS representadas por tipo de muestra, y los gráficos de barras muestran barras de error (desviación estándar) con códigos de color coincidentes. La normalización se calcula mediante el script dividiendo la diferencia entre los valores de control de la muestra y los negativos (calculado lambda max por desplazamiento espectral o promedio Z, diámetro hidrodinámico en nm) por la diferencia entre los controles (Figura suplementaria 5). La Figura 6C representa las puntuaciones espectrales frente a las puntuaciones DLS, mostrando una clara correlación entre los enfoques analíticos. La Tabla 1 enumera los identificadores, direcciones de pozo, tipo de muestra, puntuaciones espectrales y puntuaciones DLS junto con sus desviaciones estándar para referencia. El límite para el riesgo de estabilidad coloidal (independientemente de la lectura espectral o DLS) para un IgG monoespecífico es cualquier valor superior a un valor normalizado de 0,35 (indicado por una línea de puntos verde en la Figura 6A,B), 6/70 (excluyendo controles replicados) las muestras purificadas puntuaron alto riesgo, mientras que 64/70 obtuvieron una puntuación baja para el material purificado. Es importante destacar que esperamos que el corte tenda a ser más alto para formatos multiespecíficos. Para las muestras de expresión bruta, 2/20 muestras obtuvieron una puntuación alta, mientras que 18/20 bajó. De los materiales purificados aquí probados, también se cribó la expresión bruta de lotes parentales de un subconjunto y se produjeron resultados similares (representados en la Figura Suplementaria 3A), lo que indica la naturaleza representativa del ensayo tras la ampliación (purificación) de proteínas candidatas de lotes independientes. A pesar de limitar los tamaños de muestra, se observa que el error estándar puede tender a ser más alto para las muestras crudas de PEPP que para las purificadas. El beneficio de realizar CS-SINS en las etapas avanzadas garantiza que se puedan realizar evaluaciones ortogonales con ensayos que requieren más proteína para su análisis, como mediciones de viscosidad y kD-DLS, mientras que el beneficio de realizar CS-SINS en cribados de desarrollo temprano aborda preventivamente los riesgos de estabilidad coloidal, lo que podría influir en el grupo final de candidatos a líder (Figura 1B). Los candidatos límite con alto error pueden confirmarse como de alto o bajo riesgo con ensayos posteriores.

Debido a la pequeña naturaleza de los desplazamientos plasmónicos detectados, se describió una lectura alternativa para generar confianza en el ensayo, lo que amplía el rango dinámico, lo cual podría resultar especialmente útil en ausencia de un lector de placas de alta gama para detectar cambios mínimos. La lectura DLS distingue entre agrupamiento de nanopartículas y dependencia de las propiedades espectrales de las nanopartículas; sin embargo, ambos descriptores tienen rangos de error estándar similares y son pequeños en relación con sus mediciones. Parece que las muestras más propensas a lecturas atípicas tendrán mayor error (o serán "multimodales" y no reportarán un resultado por DLS), pero los valores CS-SINS dentro del rango de trabajo del ensayo tienen bajas distribuciones de error. Al comparar los valores DLS con los valores de puntuación espectral, la distribución de errores es más ajustada para los resultados DLS obtenidos de muestras brutas que para las puntuaciones espectrales; sin embargo, esto solo marcó la diferencia para un candidato que quedó por debajo del corte como puntuación DLS pero no como espectral. Esto podría resultar útil si los laboratorios disponen de diferentes instrumentos.

Para abordar específicamente la fiabilidad del procesamiento de datos y del propio método, los tiempos de escaneo se modificaron de extremo a extremo para ambas lecturas de los controles positivo y negativo en el conjunto de datos anterior, además de múltiples controles medios y bajos que sirvieron como puntos de referencia intermedios al principio y al final de una placa de 384 pozos. La Figura Suplementaria 4 muestra los resultados de la validación final de la plancha, mostrando valores mayormente insignificantes entre las muestras colocadas al principio y el final de la placa (Figura Suplementaria 4A,B) y alta correlación entre ambos valores de lectura (Figura Suplementaria 4C). Finalmente, el factor Z y el %CV se calcularon para los controles a partir del escaneo espectral y el conjunto de datos DLS en la Figura 6. A partir de los datos generados para los controles y presentados aquí, se determinó que la lectura espectral del escaneo tenía un factor Z de 0,648, con un 0,019% de CV para el control positivo y 0,012% para el control negativo. Para la lectura DLS, se calculó un factor Z de 0,998, con 0,025% de CV para el control positivo y 0,021% para el control negativo. En general, el coeficiente de correlación de Spearman entre los valores de la muestra en este ensayo (Figura 6C) se calculó como fuertemente positivo en 0,829. Estos valores representan una precisión y reproducibilidad sólidas para ambos tipos de medición y, como era de esperar, la nueva y ventajosa estrategia de detección DLS optimiza el factor Z, pero el barrido espectral proporciona una banda de separación suficiente para registrar resultados fiables (Z > 0,5). Es importante señalar que la puntuación DLS es una lectura ortogonal recogida simultáneamente dentro del flujo de trabajo CS-SINS, sin requerir preparación adicional de muestras. La mayor diferencia en los valores de las puntuaciones DLS brutas explica un factor Z mejorado, pero las "puntuaciones" se interpretan igual porque se normalizan a partir de valores en bruto. Además, las lecturas DLS capturan tamaños tridimensionales de los cúmulos de nanopartículas frente a indicaciones indirectas de proximidad derivadas del desplazamiento plasmónico y la información espectral, lo que puede reforzar nuestra comprensión de la dinámica del ensayo CS-SINS. Teniendo en cuenta la naturaleza basada en placas y crítica en tiempo de un ensayo HTP, nuestro objetivo era aumentar la fiabilidad del ensayo con estos métodos.

Figura 1: Paradigma de desarrollabilidad y recogida de datos CS-SINS. (A) El flujo de trabajo típico desde una campaña de descubrimiento hasta la selección de candidatos se representa en este diagrama para anticuerpos multiespecíficos. El proceso de descubrimiento da lugar a candidatos monoespecíficos para filtrar, seguido de una selección de varios paquetes de datos para acotar los monoespecíficos de interés antes de combinarlos en formatos multiespecíficos. Los paquetes de datos se repiten o amplían para reducir la lista de candidatos principales hasta que se elige el mejor candidato para el desarrollo. Los ensayos de menor rendimiento se realizan en la corriente de trabajo actual cuando se selecciona un pequeño panel de moléculas (cajas moradas). Los HTP CS-SINS pueden realizarse en todas las etapas del camino, añadiendo datos valiosos y mejorando el proceso de selección. (B) El resultado hipotético de las propiedades coloidales para los 6 principales candidatos se muestra para 2 posibles caminos: selección de candidatos principales con ensayos de bajo rendimiento, y selección de candidatos principales con HTP CS-SINS. Los candidatos con comportamiento desfavorable de soluciones se representan con un brillo. En el primer escenario, la mitad de los candidatos principales basados en las características óptimas de unión de las pantallas de descubrimiento muestran un comportamiento pobre en alta concentración. En el segundo escenario, solo se incluye 1 candidato con una estabilidad coloidal moderadamente pobre, porque los datos CS-SINS se consideraron en paralelo a los datos de unión en las primeras pantallas de descubrimiento. En el segundo escenario, la diversidad de candidatos viables es mayor que en el primero. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Flujo de trabajo del ensayo SINS. Preparación y conjugación de nanopartículas de oro: (1) El mAb capturado se intercambia por tampón en acetato de potasio de 20 mM, pH 4,3, y se diluye a 0,8 mg/mL. (2) Las nanopartículas de oro se concentran a partir del stock. (3) La poli-l-lisina se mezcla con la captura intercambiada por búfer mAb. (4) Las nanopartículas de oro se incuban con la poli-l-lisina y capturan mAb, y se mezclan exhaustivamente. (5) Incubación del complejo CS-SINS durante la noche a temperatura ambiente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Flujo de trabajo de automatización de laboratorios. Flujo de trabajo de automatización de laboratorio: (1) Se recopilan materiales y muestras para el método de manipulación de líquidos. Se recogen muestras diálisis en 10 mM de histidina, pH 6, en tubos matriciales o placas de 96 pozos. Las concentraciones de muestras se formatean en un archivo de entrada de manejador de líquidos. Se recogen nanopartículas complejas de oro CS-SINS conjugadas para capturar mAb, puntas robóticas para manipulación de líquidos y plásticos en preparación para el montaje de ensayo con manipulador de líquidos. (2) La placa de ensayo se prepara sobre el manipulador de líquidos e incuba durante 4 horas a temperatura ambiente. 3) En la marca de 4 horas, se recogen escaneos espectrales (lectura 1) de pozos de muestra que abarcan 25 minutos; Tras la marca de 4,5 horas, la dispersión dinámica de la luz (lectura 2) recoge información de tamaño de cada población de pozos más uniformes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Programa de manipulación de líquidos y configuración de placas. (A) Al iniciar el programa y después de que el sistema se inicialice, se abrirá una ventana o prompt separado para seleccionar el archivo de entrada con las direcciones designadas del pozo y las concentraciones de muestras. El número de muestras debe especificarse cada vez, pero el volumen de 200 μL (el volumen final de los reactivos mezclados antes del estampado de placas de 384 pozos) se mantiene igual. (B) Tras hacer clic en continuar desde la ventana anterior en (A), aparecerá esta segunda ventana para confirmar las interpretaciones del archivo de entrada a la izquierda y los valores a la derecha. (C) Tras confirmar las interpretaciones de (B), aparece esta tercera ventana con un cuadro de diálogo que verifica dos veces las matemáticas para la concentración de la muestra para la normalización (el volumen de 100 μL) a la placa final del pozo profundo (el volumen de 200 μL). (D) Este diseño proviene de la vista del Editor de Métodos del módulo de software manejador de líquidos. A la izquierda, se cargan puntas estándar de 300 μL, y en el centro del escenario se cargan 1 caja de puntas delgadas de 50 μL y 3 cajas de puntas delgadas de 300 μL, compatibles con robótica de manipulación de líquidos. En la parte frontal se carga un canal de amortiguador con 10 mM de histidina, pH 6 (el tampón en el que se dializaron las muestras). Las nanopartículas de oro se dividen equitativamente en 2 tubos microcentrífugas y se cargan, sin tapa, en la parte trasera del rack de tubos a la derecha. La placa matricial con tubos de muestra se carga en la parte trasera del portador en la columna 10. Tras las muestras, se indican la placa de normalización (1), la placa de pozo profundo con la muestra de 11,1 μg/mL (2), la placa de pozo de 200 μL de la muestra combinada y nanopartículas (3), y la placa formateada de 384 pozos (4). (E) El diseño de la cubierta del manipulador de líquidos muestra la recuperación de las puntas y la dispensación de muestras en tiempo real y marca los pozos a medida que avanza cada paso. Aquí, todas las muestras (imagen de 96 pozos en la parte trasera del portador en la^{tercera columna} ) están en gris, así como la placa de normalización posterior, lo que indica que se han añadido muestras a la placa de normalización desde las placas de matriz fuente. En verde, mostramos la cabeza de 8 canales tras aspirar el buffer del canal y dispensarlo en la primera columna de la placa de normalización durante la mezcla. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Esquema de procesamiento de datos. El esquema de procesamiento de datos: (1) Los archivos de datos en bruto se envían a un servidor interno. (2) Los archivos de datos son leídos y procesados por un script personalizado para ajustar finamente el ajuste de curvas de escaneos espectrales, calcular el máximo lambda para réplicas CS-SINS y evaluar poblaciones multimodales mediante DLS. (3) Los datos se agrupan por réplicas, luego se promedian y normalizan a controles especificados; Se buscan mapas de placas coincidentes en el portal de la base de datos para vincular los resultados. (4) Todos los datos se organizan en una plantilla lista para subirse a la base de datos, y se crean automáticamente gráficos para la elaboración de informes ELN. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Datos representativos de las lecturas 1 y 2. (A) Las puntuaciones normalizadas de desplazamiento espectral se graficaron mediante identificación PPB para muestras purificadas, de expresión bruta y muestras de control donde se indicaba, y separadas por una línea de puntos vertical, en un gráfico de barras para determinar la distribución de barras de error entre tipos de muestras. La línea roja continua indica el límite superior del ensayo, que corresponde al control positivo, mientras que la línea verde punteada indica el valor de corte para un perfil molecular de bajo riesgo para CS-SINS. (B) Las puntuaciones normalizadas del DLS se representaron mediante el ID PPB para muestras purificadas, de expresión bruta y muestras de control, donde se indicaba y estaba separada por una línea de puntos, en un gráfico de barras para determinar la distribución de barras de error entre tipos de muestras. Faltan algunos valores (como el^{segundo valor en} azul claro con una puntuación superior a la media en (A)) debido a escaneos multimodales de la salida DLS, que el portal web del software de scripting determinó como inválidos. La línea roja continua indica el límite superior del ensayo, que corresponde al control positivo, mientras que la línea verde punteada indica el valor de corte para un perfil molecular de bajo riesgo para CS-SINS. (C) Las puntuaciones promediadas normalizadas para los valores de desplazamiento espectral y DLS se compararon mediante un gráfico de puntos de correlación, como se muestra (las puntuaciones de desplazamiento espectral corresponden al eje Y y las puntuaciones DLS corresponden al eje X). El código de colores está coordinado solo con las puntuaciones DLS. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1. Puntuaciones de estabilidad coloidal de muestras de anticuerpos determinadas por CS-SINS. La tabla resume los identificadores de muestras, direcciones de pozo, clasificaciones muestrales, puntuaciones espectrales normalizadas y puntuaciones de dispersión dinámica de luz (DLS) obtenidas a partir del ensayo CS-SINS. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Figura suplementaria 1: PLL mejoró la estabilidad de la AuNP en 10 mM de tampón de His, pH 6, para CS-SINS. Esta figura muestra la superposición cercana del mAb de control negativo unido al complejo CS-SINS recubierto con PLL y al control solo de búfer, en contraste con nanopartículas de oro sin recubrimiento con el control negativo mAb o buffer solo, que tienen picos en rangos completamente diferentes. En azul se muestran los escaneos espectrales incrementales (realizados en incrementos de 1 nm en el punto de tiempo de 4 horas) para AuNP conjugado incubado con 10 mM de su tampón superpuesto con perlas conjugadas incubadas con el control negativo (PPB-117487) en ausencia de una pre-incubación de poli-l-lisina. Se muestran en rojo los escaneos espectrales incrementales (realizados en incrementos de 1 nm en el punto de tiempo de 4 horas) para AuNP conjugado incubado con 10 mM de su tampón superpuesto con perlas conjugadas incubadas con el control negativo (PPB-117487) tras la preincubación de poli-l-lisina. El cálculo de lambda max para ambos controles negativos en presencia de PLL está muy cerca. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Ajustes para DLS y selección de placa de pozo para el lector de placas DLS. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Puntuaciones CS-SINS de ABS expresadas en PEPP frente a purificadas aguas abajo. (A) Las puntuaciones normalizadas de desplazamiento espectral se representaron por pozo y identificación de placa para muestras PEPP (por ejemplo, A1PL1 = pozo A1 desde la placa 1) que expresaban Ab64 y separadas por una línea punteada vertical del desplazamiento espectral normalizado o puntuaciones DLS de Ab64 purificado aguas abajo, en un gráfico de barras para determinar la distribución de barras de error (desviación estándar) entre tipos de muestras. La línea de puntos verde marca el valor de corte para un perfil molecular de bajo riesgo para el CS-SINS. (B) El AUC total y la distribución a lo largo de la placa para todas las muestras en los experimentos realizados en (A) se representan aquí (codificados por colores para los experimentos correspondientes). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 4: Validación de placas de control de extremo a extremo de 384 pozos. (A) Las puntuaciones espectrales promediadas y normalizadas de las muestras en las primeras columnas de la placa de 384 pozos se representan y muestran en rojo, mientras que los valores duplicados escaneados al final de la placa de 384 pozos se muestran en verde lima. Los valores replicados están uno al lado del otro, desde el control positivo (indicado con un signo más junto al ID PPB) hasta el control negativo (indicado con un signo menos junto al ID PPB). El valor del control de buffer preparado por el programa de manipulación de líquidos (independiente del prompt de entrada de la muestra) se muestra en un patrón a cuadros. (B) Las puntuaciones DLS promediadas y normalizadas para las muestras en las columnas iniciales de la placa de 384 pozos se representan y muestran en rojo, mientras que los valores duplicados escaneados al final de la placa de 384 pozos se muestran en verde lima. Los valores replicados están uno al lado del otro, desde el control positivo (indicado con un signo más junto al ID PPB) hasta el control negativo (indicado con un signo menos junto al ID PPB). No hay un valor de control de búfer para la lectura DLS (debido a lecturas multimodales). (C) Las puntuaciones espectrales promediadas y normalizadas se representan en función de las puntuaciones DLS en un diagrama de puntos de correlación para muestras que van desde las primeras columnas de la placa de 384 pozos hasta el final de la placa de 384 pozos. La codificación de colores de los puntos de datos corresponde directamente a las puntuaciones medias normalizadas de escaneo espectral. Dado que no existe un valor de control de búfer para la lectura DLS (debido a lecturas multimodales), solo se comparan los 6 controles duplicados de ambas lecturas en este gráfico. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 5: Los cálculos para la normalización de puntuaciones espectrales o puntuaciones DLS para permitir la notificación y referenciación universal entre usuarios y días. Los valores positivos de control se fijan en 1, mientras que los controles negativos en 0 y las puntuaciones altas se asocian a un mal comportamiento coloidal. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este protocolo representa varias modificaciones clave respecto al método^{original CS-SINS 16}. Es importante destacar que la relación optimizada PLL:IgG y el buffer de histidina se mantuvieron desde el estudio^{original 16}. Lo más destacado es que el ensayo se adaptó para la plataforma robótica manipuladora de líquidos para permitir el procesamiento HTP (hasta 352 muestras en 1 día frente a ~20), reduciendo el tiempo de trabajo manual y mejorando la reproducibilidad mediante la manipulación automatizada de líquidos. El sistema robótico es compatible con formatos basados en placas, incluyendo el estampado en nuevos formatos como la placa de 384 pozos, y varios tipos de material de laboratorio. Los programas pueden ejecutarse de forma independiente, y el flujo de trabajo de extremo a extremo proporciona una lectura de alto volumen con mayor reproducibilidad en un entorno que limita la muestra. Las mediciones DLS también se incorporaron como una lectura ortogonal al desplazamiento espectral con un factor Z más óptimo que las interpretaciones del desplazamiento espectral (0,998 frente a 0,648), lo que resulta especialmente valioso para muestras con puntuaciones espectrales límite o desviaciones estándar altas, y describe la interpretación del desplazamiento plasmónico para mejorar el rango dinámico aparente solo con la salida del lector de placas. Se sugiere que los laboratorios sin lectores de placas multimodo de alta gama podrían usar DLS para realizar CS-SINS de forma fiable. Para abordar la posible variabilidad dependiente del tiempo a lo largo de una placa de 384 pozos, se realizó una validación extensa de la placa (Figura Suplementaria 4) colocando controles tanto al principio como al final de la placa, confirmando efectos mínimos en el tiempo de escaneo. Además, se demostró que las muestras crudas de PEPP ofrecen resultados comparables a los de material purificado (Figura 6, Figura suplementaria 3A), ampliando la aplicabilidad del método a etapas de descubrimiento anteriores donde la proteína purificada no está disponible, lo cual no se había reportado previamente. Los datos de la Figura Suplementaria 3 apuntan a la fiabilidad de la muestra entre fuentes, pero también indican una variabilidad mínima del ensayo día a día, ya que los datos se recogieron y normalizaron a partir de diferentes conjuntos de datos. Más concretamente, la Figura Suplementaria 3B representa el área total bajo la curva para todos los pozos de las respectivas placas experimentales (codificadas por colores para coincidir con la placa del mismo experimento en la Figura Suplementaria 3A) para demostrar la variabilidad esperada, aunque mínima, dentro del mismo experimento y en días diferentes con preparaciones de perlas distintas. En la etapa inicial de descubrimiento, métodos como kD-DLS y enfoques basados en columnas (SMAC, CIC) no son viables debido a mayores requerimientos de consumo de muestras y a la incapacidad para procesar materia^cruda 12,13,24,25,26,27; CS-SINS permite de forma única el cribado de estabilidad coloidal en esta etapa con solo 6 μg por muestra, que puede purificarse en un solo paso. Finalmente, el script de ajuste de curvas se actualizó para permitir el ajuste fino de desplazamientos menores de lambda max y para permitir una mejor gestión de archivos y la automatización de informes de datos a bases de datos internas.

Los escenarios comunes de solución de problemas incluyen: (1) desviaciones estándar altas en las puntuaciones espectrales o DLS, que a menudo indican mezcla incompleta de nanopartículas (paso 7.6) o agregación de muestras; en tales casos, se recomienda realizar una comprobación de control de calidad frente a las muestras dializadas por DLS para asegurar la integridad tras la diálisis y utilizar por defecto las puntuaciones espectrales como lectura estándar; (2) distribuciones DLS multimodales o lecturas fallidas de DLS, normalmente causadas por agregación de muestras preexistentes o contaminación por polvo: la filtración mediante filtros de 0,22 μm antes de la diálisis puede mitigar esto; (3) discrepancias entre las puntuaciones espectrales y DLS, que normalmente se atribuyen a mediciones DLS sesgadas (probablemente debido a la alta polidispersión, que se reflejaría dentro del rango normal-alto según la puntuación espectral); (4) valores positivos de control inconsistentes, generalmente resultado de almacenamiento inadecuado de nanopartículas o captura degradada de mAb; Se deben usar alicotas frescas almacenadas a -80 °C para cada ensayo (no almacenadas a 4 °C durante más de unos pocos días).

Algunas limitaciones del ensayo incluyen la necesidad de disponer de tiempo para dializar las muestras a fondo y preparar las nanopartículas conjugadas de forma semi-manual el día anterior al ensayo; sin embargo, el tiempo de diálisis es equivalente independientemente del tamaño del conjunto de muestras. En cuanto a los riesgos de obstrucción en la punta, las puntas de manipulación de líquidos monitorizan los cambios de presión durante la aspiración, y aparecerían errores relevantes durante la operación. Durante la fase de desarrollo del método, revisamos los archivos de registro (y continuamos hasta después del servicio) para asegurarnos de que los volúmenes esperados están siendo calculados por el script. Las funciones de alicuación han sido probadas para preparar las perlas concentradas y no anticipan problemas. Reconocemos la naturaleza sensible al tiempo del ensayo, la naturaleza dominada por Fab de la evaluación y su papel como ensayo sustituto sin medir directamente comportamientos coloidales como la viscosidad y la opalescencia. Sin embargo, esta adaptación permite caracterizar eficientemente conjuntos de datos más grandes más temprano en el proceso de descubrimiento de fármacos, sirviendo como una herramienta de cribado potente donde antes no existía ninguna.

Varios pasos críticos de este protocolo requieren una atención cuidadosa para garantizar resultados reproducibles. En primer lugar, es esencial un ajuste preciso del pH durante la preparación del tampón (pasos 1.1.1 y 1.2.1), ya que desviaciones superiores a ±0,1 unidades de pH pueden afectar la estabilidad de las nanopartículas y la eficiencia de captura de anticuerpos. El tampón de pH bajo utilizado para la preparación de anticuerpos de captura garantiza una conjugación óptima, y las condiciones de tampón especificadas estaban optimizadas para la estabilización de carga y una amplia compatibilidad de anticuerpos (normalmente en un contexto de formulación). El tampón de histidina de 10 mM pH 6.0 proporciona interacciones electrostáticas óptimas manteniendo la estabilidad de las proteicas. Segundo, es crucial una diálisis exhaustiva con eliminación completa de la sal (paso 2.3); La diálisis incompleta puede interferir con las interacciones electrostáticas durante el ensamblaje de nanopartículas. En tercer lugar, el paso de concentración de nanopartículas de oro (pasos de protocolo 5.1–5.3) debe realizarse con cuidado para evitar alterar el pellet, ya que las concentraciones inconsistentes de nanopartículas afectan directamente a la sensibilidad del ensayo. Cuarto, la relación PLL:captura mAb de 0,03 (paso 4,1) está optimizada para la máxima cobertura superficial manteniendo una ventana de desplazamiento plasmónico suficiente, como se estableció^{previamente 16}. En cuanto a la dinámica de manipulación de líquidos, se utilizaron puntas de detección de líquidos para realizar normalizaciones y mezclar placas hasta que se introducen nanopartículas de oro, que no se miden de forma fiable en solución (y por tanto fijan los volúmenes de dispensación a cantidades estándar). La detección de líquidos aguas arriba permite que el operador detecte problemas de desalineación de placas o muestras faltantes, mientras que el paso de estampado de 384 pozos identificará problemas de alineación Z. Finalmente, es fundamental seguir estrictamente el tiempo de incubación de 4 horas (pasos del protocolo 7.10–7.12) y leer consistentemente la placa de principio a fin (independientemente de que la placa esté incompleta), ya que el desplazamiento plasmónico y el agrupamiento de nanopartículas son fenómenos dependientes del tiempo; retrasos o lecturas tempranas pueden llevar a puntuaciones inexactas de CS-SINS, mientras que leer la plancha completa garantiza la consistencia de las puntuaciones a lo largo de los días en el formato HTP.

A medida que se investiga cada vez más la estabilidad coloidal de anticuerpos multiespecíficos, los grandes conjuntos de datos proporcionados por ensayos biofísicos HTP como CS-SINS tienen el potencial de alimentar modelos de IA/ML para comprender mejor los efectos combinatorios sobre la estabilidad molecular. Los estudios han demostrado que, a medida que aumenta la diversidad de secuencias, la necesidad de conjuntos de datos más grandes aumenta para mejorar la precisión de los resultados de IA/^ML 41,42,43. Las propiedades y descriptores moleculares de los monoespecíficos pueden cambiar al reformatearse a biespecíficos o triespecíficos, considerando la distribución y el equilibrio de carga molecular en lugar de consideraciones específicas de secuencia o motivo para atributos como las responsabilidades por degradación^química 17,18,19,20,21,22 . Cabe destacar que características estructurales como las manchas electrostáticas previstas, la hidrofobia y el área superficial accesible con disolventes pueden mejorar las predicciones de agregación y estabilidad independientemente de características específicas de la secuencia, haciendo que varios conjuntos de datos más pequeños sean compatibles con la preparación^{de predicciones} 17,18,19,20,21,22 . La simplicidad de la puntuación CS-SINS como referencia a la culminación representativa del perfil biofísico de una molécula hace que el ensayo sea adecuado para entrenar modelos de IA/ML.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	Prepare final concentration of 5 mM per reagent in ultra-pure water, adjust pH to 6.0, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Prepare a 5 mg/mL stock solution in ultra-pure water
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm spectral shift and DLS size of 250-300 nm for positive control; negligible spectral shift and DLS size comparable to buffer only control
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	Prepare final concentration of 10 mM reagent in ultra-pure water, adjust pH to 4.3 with acetic acid, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893