Method Article

Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

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February 27th, 2026

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1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

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La estructura secundaria del ARN se ha observado principalmente en ARN maduro mediante métodos de sondeo estructural. La secuenciación de seguimiento de estructura co-transcripcional (CoSTseq) unifica el funcionamiento nuclear, que se ha utilizado para estudiar la posición de la polimerasa en ARN naciente, mediante sondeo estructural. CoSTseq permite así la observación de la estructura secundaria del ARN en ARN bajo transcripción activa.

Abstract

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Durante la transcripción, el ARN naciente comienza a emparejar bases al salir de las ARN polimerasas (Pols). Este emparejamiento de bases permite la formación de estructuras de ARN que influyen críticamente en la expresión génica a nivel de procesamiento, traducción y estabilidad del ARN. Los métodos establecidos para estudiar la estructura secundaria del ARN se limitan a los transcritos maduros, mientras que se sabe poco sobre los estados de plegamiento. Además, la abundancia relativamente menor (< 1%) y la naturaleza transitoria del ARN incipiente complican su aislamiento y caracterización. El Seguimiento de Estructura Co-Transcripcional (CoSTseq) aprovecha el proceso transcripcional con la sondaje de biotina-NTP y sulfato de dimetil (DMS) para adquirir simultáneamente la posición Pol y el estado de emparejamiento de bases de los transcritos emergentes. En Saccharomyces cerevisiae, CoSTseq proporciona la secuencia e información estructural cerca del extremo 3' de los ARN incipientes transcritos por cualquiera de los tres polares de ARN. Durante el proceso transcripcional, la biotina-NTP incorporada en el sitio activo detiene eficazmente a los Pols. Luego, el tratamiento con DMS metila nucleótidos A, C y U desapareados. El enriquecimiento posterior de biotina y la síntesis de ADNc con una transcriptasa inversa con conmutación de plantilla permiten la secuenciación de extremos emparejados y el cálculo de reactividades DMS en función de la posición Pol. CoSTseq se realiza fácilmente junto a la sondaje DMS (DMS-MaPseq), lo que permite capturar también el transcrito maduro plegado. Aquí se presenta un protocolo detallado para CoSTseq y DMS-MaPseq paralelos, incluyendo la ejecución transcripcional, la preparación de bibliotecas y el análisis de datos.

Introduction

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El ARN puede plegarse en estructuras secundarias y terciarias debido al apareamiento de bases dentro de las moléculas de ARN, y estas estructuras pueden verse además influenciadas por proteínas que actúan como chaperonas para guiar el plegamiento delARN 1. La estructura del ARN puede ser altamente dinámica, donde los ARN celulares pueden ajustarse a una variedad de estructuras definidas por el paisaje termodinámico para generar conjuntos de posibles conformacionesde ARN 2. Los cambios conformacionales dinámicos tienen el potencial de afectar la regulación y expresióngénica 3,4. Por el contrario, el ARN también puede adoptar estructuras muy favorecidas que están estrechamente relacionadas con su función, como ARNt, ARN nuclear pequeño y ARNr. Aunque estos ejemplos destacan ARN maduros con fuertes roles reguladores, los pasos de procesamiento de ARN eucariota suelen coocurrir con la transcripción, incluyendo el empalme pre-ARNm, la cliveja en extremos 3' y la modificación del ARN. Asimismo, el plegamiento del ARN puede producirse antes de la maduración del transcrito, como se comenta en otrolugar 5.

Aunque la secuencia de ARN puede codificar la estructura secundaria, la determinación precisa suele requerir validación experimental in vitro o in vivo. La llegada de técnicas específicas de modificación química estructural, como DMS-MaPseq (perfilado mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación), ha allanado el camino para determinar la estructura secundaria del ARN celular a partir de célulasvivas 6. El DMS se introduce en las células y metila específicamente las caras de pareamiento de bases Watson-Crick de adenosina, citosina y, en menor medida, uridina, que solo son accesibles cuando no están emparejadas. Tras modificaciones por DMS, una transcriptasa inversa de alta fidelidad y altamente procesiva, como la Transcriptasa Inversa de Intrones del Grupo II Termoestable (TGIRT)7, puede utilizarse para recodificar bases modificadas como mutaciones en la biblioteca de ADNc preparada finalmente. Estas mutaciones pueden luego utilizarse para inferir la accesibilidad del ARN a nivel de nucleótidos. Aunque es una técnica potente, DMS-MaPseq y métodos relacionados se han utilizado principalmente para estudiar ARN maduro que ya está completamenteplegado 6.

Se han desarrollado varios métodos para estudiar la regulación y el procesamiento del ARN naciente. La secuenciación global de secuenciación en continuidad (GROseq) se desarrolló para superar las limitaciones del RNA-seq, que permite la medición en estado estacionario de los niveles de ARN en células y, por tanto, proporciona información que promedia los procesos de transcripción, procesamiento del ARN y degradación que afectan a los niveles de ARN. GROseq utilizó bromouridina para el uso de la base nuclear, donde una ARN polimerasa (Pol) podía añadir nucleótidos al ARN naciente con una resolución de decenas de bases8. La secuenciación de precisión en ejecución (PROseq) se basó en esta metodología para mapear pols de ARN en ARN incipiente a resolución de par de bases utilizando biotin-NTPs. Aquí se añade un NTP biotinilado donde Pol fue detectado por última vez en el extremo 3' delARN 9 recién sintetizado.

Recientemente, Schärfen et al. desarrollaron y utilizaron el Seguimiento de Estructura Co-Transcripcional (CoSTseq), que aprovecha y adapta el seguimiento de la biotina y el sondeo DMS para permitir la determinación de la estructura de ARN de transcritos incipientes en S. cerevisiae10. CoSTseq permite determinar la estructura secundaria del ARN durante la transcripción activa; este protocolo detalla cómo se combina el funcionamiento nuclear con la sondeación DMS durante los experimentos CoSTseq. Dado que CoSTseq requiere un manejo cuidadoso durante la preparación de la muestra, así como una atención especial a la calidad de los datos al proceder con el análisis CoSTseq, este protocolo detalla las mejores prácticas para generar bibliotecas adecuadas para la secuenciación de extremos emparejados en la plataforma Illumina. El protocolo CoSTseq produce simultáneamente ARN naciente y maduro, este último puede analizarse como un conjunto de datos DMS-MaPseq para permitir una comparación rigurosa entre ARN naciente y maduro (Figura 1). Experimentalmente, se requiere acceso a reactivos necesarios para mantener cultivos de levadura y realizar pruebas nucleares y sondeos DMS, como se detalla en el protocolo a continuación. El rendimiento del ARN naciente es fundamental para el éxito de la preparación de bibliotecas y análisis de datos de CoSTseq; Por ello, las condiciones de crecimiento establecidas por incubadoras y medios adecuados son fundamentales para asegurar suficiente material de partida. Finalmente, para realizar un análisis computacional de datos CoSTseq, el acceso a un clúster de Computación de Alto Rendimiento (HPC) es ideal.

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Figura 1: Visión general de la preparación combinada de la biblioteca CoSTseq y DMS-MaPseq a partir de la misma muestra biológica. (A) La permeabilización de la pared celular y la membrana nuclear de la levadura con sarkosyl permite la incorporación de biotina-NTP en el extremo 3' del ARN naciente durante una reacción nuclear de continuidad. (B) DMS metila los residuos A y C no apareados (a veces U) sobre ARN naciente y maduro en la célula permeabilizada, y el ARN total se obtiene por extracción de fenol/cloroformo. El ARN naciente se purifica entonces del ARN total mediante perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina; La extracción de Trizol libera el ARN incipiente de las perlas. En paralelo, el sobrenadante de perlas que contiene ARNm poliadenilados puede precipitarse por EtOH; a partir de este material, el ARNm puede aislarse mediante pulldown de la perla oligo(dT). Los ARNm poli A+ se fragmentan antes de la preparación de la biblioteca. (C) Se utiliza una transcriptasa inversa con conmutación de plantilla para generar por separado ADNc a partir de ARN naciente o maduro, seguida de la ligadura de adaptadores 5' y 3' para introducir una UMIN 7 y códigos de barras (véase la Figura 2 para detalles de CoSTseq). Cabe señalar que los pasos de transcripción inversa de DMS-MaPseq y CoSTseq usarán adaptadores heterodúplex distintos con voladizos complementarios a biotina-NTP usados en CoSTseq y voladizos N usados en DMS-MaPseq. Se utilizan ciclos mínimos de PCR para amplificar y limitar la polarización en la biblioteca, y se aplica selección de tamaño para eliminar dímeros adaptadores. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Protocol

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NOTA: Antes de comenzar, asegúrate de que todos los buffers listados en la Tabla 1 estén preparados. Todos los reactivos deben prepararse en agua libre de nucleasa. Se recomienda la esterilización por filtro de tampones cuando se utilizan productos químicos/reactivos de grado no biológico molecular para la preparación del tampón. Para las secciones 1 a 4, prepara lo siguiente con antelación:

1. Preparación de materiales y reactivos

  1. Prepara una solución de sarkosyl al 10% (v/v) con al menos un día de antelación para permitir tiempo suficiente para la disolución completa. Esteriliza la solución homogénea con un filtro de 0,22 μm. El día del experimento, utiliza el sarkosyl al 10% para preparar una solución de sarkosyl al 0,5% y déjalo en hielo hasta el uso.
  2. Preenfriar las ultracentrífugas a 4 °C. En la campana extractora, ajusta el termomezclador a 30 °C y precalienta una alicota de 2,5x Structural boling buffer. Este termomezclador se utilizará más adelante para el tratamiento DMS.
  3. En la campana extractora, se ajusta un bloque térmico a 65 °C y calienta 650 μL de fenol ácido: cloroformo por reacción para la extracción de ARN.
  4. Mezcla DTT con 2,5x de tampón de transcripción hasta una concentración final de 2 mM. Preparar y preenfriar frescamente las soluciones de temple y lavar para su uso inmediato tras el tratamiento DMS (véase la Tabla 1).
  5. 40 μL de SDS al 20% en tubos para la lisis de levadura antes de la extracción de ARN. Prepara una solución de 100 mM de cloruro de zinc (ZnCl2) y esteriliza con filtro antes de usarla.
  6. Generar cepas de levadura de deleción, agotamiento o knock-in que puedan ser necesarias para responder a cualquier pregunta específica de investigación sobre el emparejamiento de bases de ARN naciente en comparación con la cepa salvaje de levadura geminadora. Siempre revive frescamente las cepas dejando una placa de agar de levadura adecuada (YPD, dropout o placas antibióticas). Comienza un cultivo líquido de una sola colonia el día antes de comenzar el experimento. Para más instrucciones sobre el crecimiento y manipulación de cepas de levadura, consulte Schärfen et al., 2025.

2. Preparación de células de levadura para CoSTseq

  1. Preparación de un precultivo: Cultivar la cepa BY4741 de S. cerevisiae en 50 mL de medio YPAD hasta que las células alcancen la fase medio logaritarima (Densidad Óptica (OD) a 600 nm = 0,6) a 30 °C con agitación a 200 rpm. Si es necesario, diluir el cultivo a 0,2-0,3 y permitir que la levadura alcance 0,6 OD.
  2. Cosecha de levadura: Recoge y centrifuga 1,8 OD (~3 mL) de cultivo de levadura a 2.500 x g durante 3 minutos en una centrífuga preenfriada (4 °C). Descarta el sobrenadante en un contenedor de basura. Lava el pellet resuspendiendo 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en frío. Centrifuga de nuevo a 2.500 x g durante 3 minutos a 4 °C. Desecha el sobrenadante y guarda la pellet de levadura en hielo.
  3. Permeabilización de las células de levadura: Suspende cuidadosamente el pellet de levadura en 10 mL de sarkosyl frío al 0,5%. Usa una pipeta P1000 para volver a suspender las células y evita crear burbujas. Incuba en hielo durante 20 minutos para promover la permeabilización. Pelleta las células de levadura permeabilizadas a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Resuspende las células permeabilizadas de levadura en 100 μL de agua libre de nucleasa.

NOTA: Aunque el marcado por DMS no requiere permeabilización de la pared celular, la reacción nuclear de continuidad requiere permeabilización para que los nucleótidos biotinilados lleguen al lugar de transcripción. Esto se consigue mediante el tratamiento con sarkosyl, que permeabiliza tanto la pared celular de la levadura como su membrana nuclear. Además, el tratamiento con sarkosyl facilita el ensayo continuo al prevenir nuevos eventos de inicio de transcripción y desplazar factores negativos de elongación de Pol II ycromatina 11,12. Manipular suavemente las muestras y mantener una baja velocidad centrífuga (400 x g) para evitar la ruptura celular y promover la incorporación exitosa de biotina en transcritos nacientesalargados 13.

3. Operación nuclear y sondeo DMS

NOTA: El uso de biotina con biotina-NTP introduce un obstáculo estérico que detiene a los pols de ARN en su sitio activo y proporciona un mango de biotina para el enriquecimiento selectivo del ARN naciente. Dependiendo de la resolución deseada, se puede realizar un run-on nuclear usando uno, dos o los cuatro ribonucleótidosbiotinilados 9. Por cuestiones de rentabilidad, el flujo de trabajo descrito aquí utiliza solo un nucleótido biotinilado (es decir, biotina-CTP).

  1. Preparando la reacción nuclear de continuidad
    1. Preparar 2,5x solución de trabajo de tampón de transcripción con 5 mM de DTT recién añadido y precalentar un tampón de sondeo de estructura 2,5x a 30 °C (véase la Tabla 1).
    2. En un tubo limpio de 2 mL, añade 120 μL de tampón de transcripción 2,5x, 3,75 μL de 10 mM de ATP, 3,75 μL de 10 mM GTP, 3,75 μL de 10 mM UTP, 7,5 μL de 1 mM Bio-CTP, 15 μL de 10% sarkosyl y eleva el volumen a 200 μL con 46,25 μL de agua libre de nucleasa.
    3. Añade 100 μL de células al tubo e incuba en un termomezclador a 30 °C durante 2 minutos agitando a 500 rpm.
      NOTA: Este paso es muy urgente. Intenta limitar el número de muestras para generar datos fiables. Es buena práctica escalonar el tiempo entre muestras para mantener la consistencia.
  2. Tratamiento DMS: Una vez completada la incubación, añade rápidamente 200 μL de buffer de sondeo estructural precalentado 2,5x y 25 μL de reactivo DMS al tubo simultáneamente. Haz un vórtice suave en dos pulsos y continúa incubando en el termomezclador durante 4 minutos a 30 °C mientras agitas a 500 rpm. Espacia 30 segundos entre muestras para que sea consistente.
    NOTA: La sondeación DMS es una reacción instantánea que permite una alta resolución temporal14 del estado de emparejamiento de bases de ARN. Para evitar la modificación continua del DMS, es fundamental apagar rápidamente el marcaje del DMS utilizando el fuerte agente reductor β-mercaptoetanol. Además, cualquier DMS restante dificultará la recuperación del ARN tras la extracción. La adición de alcohol isoamílico saturado en agua antes de la centrifugación puede eliminar el DMS insoluble residual en la cápsulacelda 15. Este paso es muy urgente. Es esencial trabajar con un número limitado de muestras para generar datos fiables.
    PRECAUCIÓN: El DMS es un líquido altamente tóxico e incoloro con un ligero olor a cebolla. Se requieren precauciones extremas al trabajar con DMS. El contacto directo y/o la inhalación de vapores puede causar necrosis en los ojos, la boca y las vías respiratorias, incluyendo daños graves en órganos. Usa gafas protectoras, bata de laboratorio y guantes adecuados. Doble guante siempre que sea posible y cámbiate los guantes inmediatamente al exponerse o después de usarlos por DMS. Realiza pasos que involucran DMS bajo una campana extractora. Utiliza contenedores dedicados a residuos para la eliminación por DMS.
  3. Temple y lavado
    1. Prepara los amortiguadores de parada y lavado con antelación, como se indica en la Tabla 1 , y colócalos sobre hielo hasta que se usen. Detiene la metilación del DMS añadiendo 1 mL de buffer de parada.
    2. Centrifuga las muestras etiquetadas con DMS durante 5 minutos a 3.500 x g en una centrífuga preenfriada. Desecha los residuos en un recipiente adecuado.
    3. Añade 1 mL de buffer de lavado al pellet y vuelve a suspender. Repite el paso 3.3.2. Proceder inmediatamente a la extracción de ARN. No congeles la pellet de levadura.
  4. Extracción de fenol cloroformo
    1. Resuspende la levadura marcada con DMS en 600 μL de tampón de lisis de ARN y luego transfiere la suspensión a tubos que contienen 40 μL de SDS al 20%. Incubar a 65 °C durante 30 segundos con agitación a 950 rpm.
    2. Añade 650 μL de fenol:cloroformo ácido precalentado al lisato de levadura y continúa calentando en el termomezclador durante 2 minutos a 65 °C agitando a 950 rpm. Deja reposar las muestras sobre hielo durante 5 minutos.
      NOTA: Mientras tanto, cambia el bloque de calor o el termomezclador a temperatura ambiente (RT).
    3. Centrifugar a 20.000 x g durante 3 minutos en RT.
    4. Mueve la capa superior a un tubo nuevo y añade 650 μL de cloroformo. Vórtice brevemente. Centrifugar de nuevo y recoger la capa superior en un tubo nuevo que contenga 700 μL de isopropanol.
    5. Invierte para mezclar e incubar en el congelador a -20 °C durante 30 minutos, permitiendo que el ARN precipite. Centrifugar a 20.000 x g durante 45 minutos a 4 °C. Descarta el sobrenadante. Lava el pellet con 750 μL de etanol al 75% (EtOH).
      NOTA: Este es un punto de parada/pausa en el protocolo. Las muestras pueden dejarse en EtOH al 75% durante la noche a -80 °C.
    6. Centrifuga durante 3 minutos a 20.000 x g y descarta el sobrenadante. Seque al aire el pellet de ARN y disuelvalolo en 81 μL de agua libre de nucleasa. Cuantifica el rendimiento de ARN usando un espectrofotómetro ajustado a una longitud de onda de 260 nm. Aplica 1 μL de la resuspensión anterior para medir. Diluye la muestra de ARN si es necesario. Debe haber al menos 80 μg de ARN total presente para pasar al siguiente paso.
      NOTA: Si es necesario, el ARN marcado con DMS puede almacenarse a -80 °C durante hasta 2 semanas.

4. ARN naciente (CoSTseq)

NOTA: El ARN total obtenido de la extracción de fenol: cloroformo contiene ARN maduros marcados con DMS, así como ARN incipientes biotinilados marcados con DMS de las tres polimerasas. Para purificar los ARN nacientes del ARN total, los siguientes pasos utilizarán perlas de estreptavidina para enriquecer el ARN naciente biotinilado. Debido a la fuerte afinidad de la biotina por la estreptavidina (Kd = 10-14 - 10-15 M), se realizan dos extracciones consecutivas de reactivo de ARN (véase Tabla de Materiales) para eluir el ARN de las perlas de estreptavidina. Cabe señalar que menos del 1% del ARN de levadura es ARN naciente, dependiendo de la condición de crecimiento16.

  1. Pulldown de biotina
    1. Preparación de perlas magnéticas de estreptavidina
      1. Preparar el tampón de prelavado A y el tampón de prelavado B como se muestra en la Tabla 1 para la composición. Homogeneizar las perlas magnéticas de estreptavidina mediante vórtice. Obtener 44 μL de perlas magnéticas homogeneizadas por muestra de 80 μg de ARN total.
        NOTA: Escala multiplicando el volumen por el número de muestras.
      2. Coloca las cuentas magnéticas en el soporte magnético y retira la solución de almacenamiento. Resuspende las perlas magnéticas en 1 mL de buffer de prelavado A.
      3. Incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente. Magnetizar y eliminar el sobrenadante. Repite el lavado. Lava 1 vez con 1 mL de buffer de prelavado B. Magnetiza y retira el sobrenadante, y avanza rápidamente con el paso de unión y lavado.
    2. Encuadernación y lavado
      1. Prepara los tampones de 2x de enlace, 1x tampón de unión, alto contenido de sal y bajo en sal como se muestra en la Tabla 1.
      2. Resuspende las cuentas prelavadas añadiendo el doble del volumen original (88 μL) de 2x buffer de unión. Transfiere 80 μL de perlas a un tubo estéril de 1,5 mL que contiene 80 μL de la muestra de ARN biotinilado.
      3. Gira la mezcla de perlas y muestras sobre un rotador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Recoger el ARN maduro de flujo directo por etapa magnética (proceder al paso de precipitación).
      4. Enjuaga el complejo de ARN perla-naciente con 500 μL de tampón alto en sal 2x. Realiza un enjuague con 500 μL de unión 1x seguido de otro enjuague con 500 μL de tampón bajo en sal.
  2. Elución mediante extracción de reactivos de ARN
    1. Precalienta un termomezclador a 60 °C. Enfría una centrifugadora capaz de alcanzar una velocidad de 20.000 g a 4 °C.
    2. Añadir 300 μL de reactivo de ARN (véase Tabla de Materiales) al complejo de ARN perlas-naciente y volver a suspender. Incuba en un termomezclador durante 5 minutos a 60 °C.
    3. Añade 60 μL de cloroformo, vórtice e incuba 3 minutos a la temperatura temporal. Centrifuga a 14.000 x g durante 5 minutos en una centrífuga preenfriada.
    4. Mueva la fase acuosa superior a un nuevo tubo de recogida (~180 μL). Descarta la fase orgánica, dejando atrás las cuentas y la fase acuosa restante.
    5. Repite la extracción para lograr un volumen final de 360 μL de fase acuosa en el tubo de recogida.
    6. Añadir 360 μL de cloroformo al tubo de recogida y al vórtice brevemente. Centrifuga a 14.000 x g durante 5 minutos en una centrífuga preenfriada.
    7. Transfiere (aproximadamente 350 μL) de la capa superior a un tubo nuevo. Precipitar el ARN añadiendo 900 μL de EtOH absoluto y 1 μL de coprecipitante.
    8. Vórtice brevemente y permite que la precipitación ocurra a -20 °C durante 20 minutos o -80 °C durante la noche.
    9. En la centrífuga preenfriada, centrifuga a 20.000 x g durante 20 minutos. Descarta cuidadosamente el sobrenadante.
    10. Lava el pellet con 750 μL de 75% de EtOH, seguido de otra centrifugación en frío a 20.000 x g durante 5 minutos.
    11. Seca el pellet para eliminar el EtOH residual durante 10 minutos. Disuelva el pellet de ARN en 3,75 μL deH2O.
      NOTA: El infiltrado por puntos del ARN eluído seguido de una sondeación con el conjugado estreptavidina-HRP es el método más eficaz para evaluar la reducción de la biotina. Sin embargo, este enfoque consume una cantidad considerable del material de muestra, dejando material insuficiente para la preparación de la biblioteca.
  3. Precipitación del sobrenadante
    1. Precipita el sobrenadante que contiene ARN maduro añadiendo 2,5-3 volúmenes de EtOH. Permitir que la precipitación ocurra a -20 °C durante 1 hora.
    2. En una centrífuga preenfriada, centrifuga durante 45 minutos a 20.000 x g. Aspira cuidadosamente el sobrenadante.
    3. Lava el pellet de ARN con 0,5 mL de EtOH al 75%. Seca y disuelve el pellet en 50 μL de agua libre de nucleasa. Coloque el tubo sobre un bloque térmico a 65 °C para mejorar la disolución del pellet de ARN.
    4. Mide la concentración de ARN usando un espectrofotómetro para los pasos siguientes.

5. ARN maduro (DMS-MaPseq)

  1. Selección Poly A
    NOTA: Los ARN maduros poliadenilados se purifican mediante captura de afinidad basada en perlas oligo(dT). Este protocolo está optimizado para utilizar el Kit de Purificación de ARNm DIRECT de Dynabeads (véase la Tabla de Materiales). Como preparación inicial, se precalienta 1 mL de agua sin nucleasas a 80 °C para la elución y se ajusta un bloque térmico a 70 °C.
    1. Preparación de ARN para pulldown de poli A: Transfiere 50 μg de ARN precipitado y subirlo a un volumen final de 300 μL con agua libre de nucleasa. Calienta el ARN a 70 °C durante 2 minutos para alterar estructuras secundarias y colócalo inmediatamente sobre hielo. Mezcla el ARN con 300 μL de tampón de lisis/unión y vórtice brevemente.
    2. Preparación de las perlas magnéticas: Lleva las perlas magnéticas a la suspensión mediante vórtices durante al menos 30 segundos. Transfiere 100 μL de perlas suspendidas por muestra a un tubo estéril de 1,5 mL. Magnetiza para desechar el buffer de almacenamiento. Enjuaga las perlas magnéticas en un volumen igual de buffer de lisis/unión, magnetiza y descarta el sobrenadante.
    3. Encuadernación y lavado
      1. Añadir los 100 μL de perlas prelavadas a los 600 μL de ARN de muestra preparada. Gira continuamente sobre un rotador durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      2. Recoge las cuentas colocándolas en una rejilla magnética y descarta el flujo directo. Lava las esferas con 600 μL de tampón de lavado A. Píeta para mezclar.
      3. Recoge las cuentas de nuevo para desechar el lavado. Lava las esferas con 300 μL de buffer de lavado B. Pipeta para mezclar.
      4. Recoge las cuentas de nuevo para desechar el lavado. Mezcla las perlas con 90 μL de agua tibia (80 °C) y permite la unión añadiendo 90 μL de tampón de lisis/unión. Repite el paso 5.1.3.1-5.1.3.3.
    4. Elución: Suspender las perlas en 30 μL de agua tibia (80 °C) libre de nucleasas. Incubar entre 75 °C y 80 °C durante 2 minutos. Somete rápidamente las perlas a un campo magnético y recoge el eluato en un tubo libre de RNasa. Repite la elución y recoge el ARN eluído.
  2. Fragmentación
    NOTA: La fragmentación de los ARNm puede lograrse tanto por medios enzimáticos como químicos. Aquí, para la fragmentación se utilizan cloruro de zinc y calor. A diferencia de las enzimas que requieren una secuencia específica o elementos estructurales, los iones de zinc actúan como un ácido de Lewis para activar el ogénito 2' (un nucleófilo) y partir la columna vertebral fosfodiestera. Esto da lugar a la formación de éster fosfato cíclico 5' OH y 2',3' en las cadenas de ARNproducto 17.
    1. Precalienta el termociclador con la temperatura del bloque ajustada a 94 °C y la temperatura de la tapa a 105 °C. Colocar 54 μL de ARNm eluído en un tubo PCR.
    2. Añadir 6 μL de solución de cloruro de zinc de 100 mM (concentración final de 10 mM), vórtice durante 2 s e incubar inmediatamente a 94 °C durante 55 s en el termociclador precalentado.
    3. Al final de la incubación, apagar la reacción de fragmentación con 6,6 μL de 0,5 M EDTA (concentración final de 50 mM), pipetear arriba y abajo para mezclar y colocar rápidamente los tubos sobre hielo. Transfiere el contenido a tubos estériles de 1,5 mL.
    4. Permitir la precipitación de los ARNm fragmentados con la adición de 150 μL de isopropanol, 15 μL de acetato sódico de 3 M, pH 5,2 y 1 μL de co-precipitante.
    5. Coloca a -20 °C durante 30 minutos. Centrifuga a 20.000 x g durante 45 minutos en una centrífuga preenfriada. Lava el pellet con EtOH al 75% y disuelvéalo en 15 μL de agua libre de nucleasa.
  3. Tratamiento PNK
    NOTA: La fragmentación química con ZnCl2 genera extremos 5' y 3' inadecuados para la ligación17. Así, tras la fragmentación química, los ARN se someten a tratamiento con polinucleótido quinasa (PNK), que fosforila los extremos fosfato 5' y desfosforila los extremos fosfato 3', que luego pueden ligarse a los adaptadores18.
    1. Añadir 1 μL de inhibidor de ribonucleasa, 2 μL de 10x PNK Buffer y 2 μL de T4 PNK. Incubar a 37 °C durante 60 minutos. Detener la reacción añadiendo 30 μL de agua libre de nucleasa, 50 μL de tampón de unión al ARN y 50 μL de EtOH.
    2. Utiliza un método de purificación de ARN basado en columnas de spin para eliminar contaminantes y concentrar el ARN. Esto puede hacerse utilizando un kit comercial (kit de limpieza y concentrador de ARN, véase Tabla de Materiales). En resumen, mezcla dos volúmenes de tampón de unión de ARN con 1 volumen de muestra, mezcla un volumen igual de esta mezcla con EtOH al 100% y carga sobre la columna de spin con un tubo de recogida fresco. Haz girar esta muestra y descarta el flujo directo. Lava la columna de espín con 700 μL de tampón de lavado de ARN y una vez con 400 μL de tampón de lavado de ARN. Descarta el flujo a través de la corriente. Gira la columna vacía durante 1 minuto para asegurar la eliminación completa del buffer de lavado.
    3. Eluir el ARN en 10 μL de agua tibia libre de nucleasa.
      NOTA: Realiza todos los pasos de centrifugación a 10.000 - 16.000 x g en RT durante 30 s.

6. Reacción de transcripción inversa con conmutación de plantilla

NOTA: Los ARN incipientes derivados del pulldown de biotina (paso 4.2) y del ARNm fragmentado tras el tratamiento con PNK (paso 5.3) se someten a los siguientes pasos para la preparación de la biblioteca (véase Figura 1 y Figura 2). En resumen, se preparará una plantilla sintética de ARN/dúplex de inicio de cebador de ADN (adaptador heterodúplex R2 ARN/ADN) en la que se pueda realizar el cambio de plantilla. Este heterodúplex proporciona una secuencia complementaria corta que permite el cambio de plantilla por parte de la transcriptasa inversa (RT) para cambiar de cadena, momento en el que el RT cambia de cadena del ARN al cebador de ADN, permitiendo así una síntesis de ADNc sin interrupciones del ARN a la secuencia adaptadora. Aquí se utiliza transcriptasa inversa induro, que ha sido probada y optimizada para este protocolo. Otras transcriptasas inversas con conmutación de plantilla pueden usarse para la preparación de la biblioteca CoSTseq si se desea, pero requieren optimización por parte del usuario.

  1. Secuencias adaptadoras heterodúplex de ADN/ARN
    NOTA: Los adaptadores heterodúplex de ADN/ARN usados para la transcripción inversa de la muestra DMS-MaPseq son los mismos que los listados en Xu et al.7 y referenciados por Schärfen et al.10.
    1. Para el adaptador heterodúplex de ADN/ARN que se usará para la transcripción inversa de la muestra de CoSTseq, utiliza un adaptador con una 'G' en la región de voladizo. Esto permitirá que G capture la biotina-C en el extremo 3' del ARN. Si se utiliza un NTP biotinilado diferente, edita el cebador de ADN heterodúplex para que el nucleótido de emparejamiento adecuado sirva como voladizo (véase la Tabla 2).
    2. Para el adaptador DMS-MaPseq, asegúrate de que haya un único voladizo de N, dado que el extremo 3' será aleatorio tras la fragmentación. Para una visión general de los siguientes pasos de preparación de la biblioteca, véase la Figura 2.
  2. Preparación del híbrido ADN/ARN para la conmutación de plantillas: Preparar 1 μM de cebadores de ARN R2 y ADN R2R en un tampón compuesto por 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 1 mM EDTA. Incuba la mezcla de cebador a 82 °C durante 2 minutos, luego enfría hasta 25 °C a una velocidad de 0,1 °C/s. Alicota la mezcla y congélalo para usarlo después.
  3. Transcripción inversa por conmutación de plantillas
    1. Añadir los siguientes reactivos e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente: 2 μL de 5x tampón de reacción, 1 μL de 1 μM de ADN/ARN heterodúplex (usar heterodúplex con un solo voladizo de G para la muestra CoSTseq; usar heterodúplex con un voladizo aleatorio de N para la muestra DMS-MaPseq), 0,5 μL de enzima, 0,5 μL de inhibidor de RNasa, 3,75 μL de muestra de ARN (o añadir agua para lograr 7,75 μL de volumen total).
    2. Incuba esta mezcla (sin dNTPs) durante 30 minutos en RT. Luego añade 1,25 μL de 10 mM dNTPs a la reacción y aplica las siguientes condiciones de ciclo en un termociclador: 25 °C durante 10 minutos, 42 °C durante 10 minutos, 50 °C durante 10 minutos, 55 °C durante 10 minutos, 60 °C durante 30 minutos, 65 °C durante 20 minutos, 75 °C durante 15 minutos.
    3. Añade 1 μL de RNasa H e incuba a 37 °C durante 20 minutos. Purificar la reacción PCR utilizando un método de purificación de ADN basado en columnas para eliminar cebadores, nucleótidos y enzimas restantes. Elute en un volumen final de 20 μL.

figure-protocol-1
Figura 2: Representación esquemática detallada de la preparación de la biblioteca CoSTseq. El ARN naciente que presenta un extremo 3' biotinilado se incuba con un adaptador de conmutación plantilla que contiene un voladizo G complementario a la biotina-CTP. Para ARN maduro fragmentado (DMS-MaPseq), se utiliza un adaptador con sobresaliente de N (véase la Figura 1). La síntesis de ADNc se realiza utilizando una transcriptasa inversa altamente procesiva, como la transcriptasa inversa de intrones del grupo II termoestable (TGIRT), seguida de un tratamiento con RNasa H para degradar la cadena de ARN. Posteriormente, la ligasa de ADN/ARN de aplicación 5' vincula el extremo 5' (rA pp) adenilado por ribosa del enlace UMI N7 con el 3' OH del ADNc monocatenario. El adaptador UMI N7 incluye un extremo bloqueado de 3′, lo que impide la autoligación entre adaptadores. Finalmente, la amplificación por PCR se realiza utilizando cebadores que incluyen regiones superpuestas y voladizos de 5′ que llevan códigos de barras únicos Illumina i5 e i7 asignados a cada muestra. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

7. Ligación de adaptador de 5' para la preparación de las bibliotecas finales de cDNA para la secuenciación de etiquetas de extremos emparejados

  1. Preparación del adaptador de extremo 5'
    1. Adenilato el adaptador de extremo 5' usando una reacción basada en ligasa de ARN (por ejemplo, ligasa de ARN M, listada en la Tabla de Materiales) con los siguientes componentes de reacción: 8 μL de buffer de reacción de adenilación de ADN 5' 10x, 8 μL de 1 mM ATP, 100 μM de ADN R1R (este es el cebador TruSeq que contiene un identificador molecular único o UMI), 8 μL de ligasa de ARN M, 52 μL de agua libre de nucleasa.
      NOTA: Para detalles relacionados con el diseño del adaptador UMI N7 , véase la Tabla 2 y la Figura 2.
    2. Incuba esta reacción a 65 °C durante 1 hora, luego a 85 °C durante 5 minutos. Proceder a purificar el producto mediante precipitación de EtOH o mediante un método de limpieza de ADN basado en columnas de espín de membrana de sílice para aislar el ADNc, según las instrucciones del fabricante.
    3. Para la precipitación de EtOH, el ADN puede precipitarse a -20 °C (mínimo 20 min) utilizando acetato de sodio (pH 5,2) a una concentración final de 0,3 M y 2x-2,5 veces el 95%-100% de EtOH frío. Centrifugar la reacción precipitada por EtOH durante 15 minutos a máxima velocidad en una centrifugadora preenfriada (4 °C), lavar el pellet usando 70% de EtOH, volver a centrifugar y secar al aire el pellet. Resuspende (o elute, si se utiliza una columna de spin) el pellet en 40 μL de agua libre de nucleasa. Conservar a -20 °C a largo plazo.
  2. Ligación de adaptadores de 5'
    1. Para un solo volumen de reacción de 20 μL, añadir los siguientes componentes a 10 μL de ADNc: 2 μL de 10x NE Buffer 1, 2 μL de 50 mMMnCl 2, 2 μL de ligasa de AppDNA/ARN 5', 4 μL de 10 μM (100 ng/μL) del adaptador adenilado del paso 7.1.
    2. Incuba esta reacción a 65 °C durante 1 hora, luego 3 minutos a 90 °C. Limpia la reacción utilizando el kit de purificación PCR minElute y elute en un volumen final de 20 μL de agua libre de nucleasa.
  3. Amplificación mínima por PCR de bibliotecas de ADNc con prueba piloto
    1. Antes de continuar, prepare un stock de 10 μM de cebadores de índice que contengan códigos de barras únicos. Cada muestra única de CoSTseq o DMS-MaPseq debe tener un código de barras único asociado para un análisis posterior fluido. Véanse las secuencias de cebadores en la Tabla 2. Los cebadores individuales que contienen códigos de barras hacia adelante y hacia atrás pueden combinarse en una mezcla 1:1 y almacenarse como un premezclado con código de barras.
    2. Utilizando 2 μL del producto PCR del paso 7.2, añadir 2,5 μL de búfer de PCR de alta fidelidad (por ejemplo, un buffer HiFi comercial), 0,375 μL de dNTP (10 mM), 0,75 μL de premezcla de código de barras (o 0,375 μL de cebadores únicos individuales i5 e i7), 0,25 μL de ADN polimerasa de arranque en caliente de alta fidelidad (por ejemplo, enzima comercial HiFi de arranque en caliente). 6,625 μL de agua libre de nucleasa.
    3. Incubar esta reacción a 95 °C y repetir [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] durante 23 ciclos, terminando con 1 minuto de incubación a 72 °C. Corre con un gel de agarosa al 1% para decidir el número óptimo de ciclo.
      NOTA: Para probar condiciones de ciclo más bajas, se puede preparar una muestra al final de un ciclo inferior (por ejemplo, al final de 15 o 16 ciclos) y ejercerla sobre un gel de agarosa para comparar la intensidad de la extensión de la biblioteca de ADNc en un gel de agarosa a lo largo de las longitudes de ciclo.
  4. PCR final para amplificación de librerías
    1. Utilizando 18 μL del producto PCR del paso 7.2, añade lo siguiente del Kit de PCR KAPA HiFi: 22,5 μL de tampón de PCR de alta fidelidad, 3,375 μL de dNTP (10 mM), 6,75 μL de premezcla de codificación de barras (o 3,375 μL de cebadores únicos individuales i5 e i7), 2,25 μL de ADN polimerasa de arranque en caliente de alta fidelidad y 59,625 μL de agua libre de nucleasa.
    2. Incubar esta reacción a 95 °C y repetir [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] para el número de ciclos determinado en el paso 7.3. Termina con una incubación de 1 minuto a 72 °C.
  5. Selección de tamaño
    1. Realizar la selección de tamaño en el producto PCR mediante purificación basada en perlas paramagnéticas (por ejemplo, AMPure XP o equivalente). Usa 1,3 veces el volumen de perlas (por ejemplo, para una reacción PCR de 50 μL, usa 65 μL de suspensión de perlas) y mezcla bien hasta que quede homogéneo. Deja que las perlas unan la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: Esta proporción de 1:1,3x entre muestra y perlas permite la eliminación de dímeros adaptadores de cebador y garantiza que los fragmentos de ADN retenidos no sean menores de 150 pb ni mayores de 800 pb.
    2. Retira el sobrenadante sin alterar las cuentas y procede a lavar las perlas con 80% de EtOH según el protocolo del fabricante.
    3. Eluir el producto final en 11 μL. Aplicar 1 μL en un gel de agarosa para verificar las bibliotecas. Envía el producto final para secuenciación.

8. Análisis de datos

NOTA: El paquete completo de CoSTseq y el código de análisis están disponibles en GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), y el flujo de trabajo para el análisis se muestra en la Figura 3. Esta canalización está diseñada para gestionar tanto datos de secuenciación CoSTseq como DMS-MaPseq. CoSTseq utiliza Snakemake, un flujo de trabajo bioinformático que paraleliza fácilmente el análisis optimizando el número de núcleos de CPUdisponibles 19. El flujo de trabajo está definido por un Snakefile, que consiste en un conjunto de reglas que establecen los análisis que se ejecutarán. No es necesario modificar el Snakefile que está disponible al instalar el paquete de GitHub.

  1. Ajusta el archivo de configuración (archivo .yaml) con las rutas correctas hasta donde se almacenan los datos en bruto. En estos ajustes debería incluirse una ruta hacia las secuencias de adaptadores y los nombres de muestras asociados. Altera el archivo de configuración para ejecutar análisis específicos definidos en el Snakefile.
  2. Para comenzar el análisis, descarga las lecturas finales emparejadas en fastq.gz formato. Lecturas de proceso usando fastp20 para recortar secuencias adaptadoras y filtro de calidad para lecturas con puntuaciones Phred de al menos 20. Alinea estas lecturas al genoma de referencia usando STAR21 para generar archivos BAM.
  3. Como confirmación adicional, visualiza los archivos BAM generados tras ejecutar la cadena de análisis CoSTseq en el navegador Integrated Genome Viewer (IGV). Usando IGV, los archivos BAM deberían ser fácilmente interpretables para mostrar lecturas a lo largo de todas las partes de los genes de interés, indicando que las lecturas representan ARN naciente. Como era de esperar, las lecturas de ARN maduro deberían mostrar una cobertura mínima en las regiones intrónicas, dado que se espera que estas lecturas deriven de transcritos maduros y probablemente empalmados de forma eficiente.
  4. Utiliza la salida fastp (un archivo .html que puede abrirse en un navegador web) para un porcentaje estimado de lecturas duplicadas. Ten en cuenta que las lecturas de CoSTseq pueden estar muy altamente duplicadas, lo que resalta la importancia del siguiente paso.
  5. Usando UMICollapse22, se deduplican lecturas para colapsar lecturas con UMIs y alineaciones idénticas, permitiendo preservar solo lecturas únicas y mitigando el sesgo de PCR. Los archivos resultantes deben estar libres de lecturas duplicadas y en formato BAM, donde las lecturas alineadas con el ARNr se separarán de las asociadas a genes no ARNr.
  6. Para el componente principal final de la pipeline modular CoSTseq, utiliza una implementación personalizada de Python para calcular el recuento de mutaciones y la cobertura de lectura sobre cada nucleótido. Las funciones que describen esta implementación se pueden encontrar en el código fuente de GitHub, y el archivo Snake detalla la entrada, salida, parámetros y funciones para generar estos datos almacenados en formato .pkl.
    NOTA: Existen multitud de otros análisis que pueden realizarse utilizando la cadena de análisis CoSTseq, aunque los parámetros pueden requerir optimización para necesidades de análisis personalizadas. Un método valioso adaptado para CoSTseq es HDProbe, un paquete R que permite comparaciones genómicas de tasas demutación 10. En resumen, HDProbe requiere datos de todos los replicados y puede categorizar metódicamente diferencias significativas en las tasas de mutación en comparación con el control. Otros tipos de análisis que se pueden querer realizar incluyen la predicción de estructuras basada en las reactividades experimentales del DMS. Esto puede realizarse utilizando el paqueteRNAstructure 23.

figure-protocol-2
Figura 3: Pasos de análisis y resultados esperados de la cadena de análisis modular CoSTseq. Pasos de análisis, que indican el uso recomendado de herramientas existentes además de la cadena de análisis CoSTseq lista para usar con los archivos de salida y contenido esperados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta sección presenta los resultados reales generados al implementar el flujo de trabajo y el análisis de CoSTseq, tal como se describe en este protocolo. En primer lugar, esta sección describe los resultados esperados tras la evaluación de la calidad de preparaciones exitosas de bibliotecas antes y después de la secuenciación. Antes de la secuenciación, los investigadores pueden utilizar una prueba de PCR y un análisis TapeStation para confirmar la presencia de ARN tras el enriquecimien...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El ARN comienza a plegarse co-transcripcionalmente debido a una cinética más rápida de apareamiento de bases en comparación con la velocidad de síntesis 24,25,26,27. Nuestro conocimiento actual sobre el plegamiento de ARN incipiente proviene de estudios de moléculas individuales de ARN procariotas, sondeo in vitro o enfoques in silico. En este...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores quieren agradecer al Dr. SK Boopathy Jegathambal por su programación y a los miembros del laboratorio de Neugebauer, especialmente a P. Bech, por sus valiosas discusiones. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01GM112766 a KMN) y una beca predoctoral de la American Heart Association (908949 a LS). LPS contó con una subvención de formación del NIH 5T32GM14943803. LRAB contó con el apoyo de una beca postdoctoral de la American Heart Association (26POST1569544). La adquisición de datos en el Centro de Análisis Genómico de Yale fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número 1S10OD03036301A1. Esta obra es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del NIH.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATP 10mMInvitrogen18330019
10mM Biotina-11-CTPBiociencias de JenaNU-831-BIOX
10mM GTPInvitrogen18332015
10mM UTPInvitrogen18333013
10X NEBuffer 1New England BiolabsB7001SUsado en el paso 7.2.1
Solución salina tamponada con fosfato 10X (PBS)Gibco70011-044
20% SDSRPI L23100-500
Fenol:cloroformo ácido y nbsp;AmbiónAM9722
Cuentas AMPure XP para la selección de tamañoBeckman Coulter A63880Usado para la selección de tamaño en el paso 7.5.1
Bacto PeptoneGibco211677
Extracto de levadura bactoGibco212750
BicicletaSigma AldrichB3876-100G
CloroformoSigma Aldrich319988
D-(+)-GLUCOSASigma AldrichG5767-500G
DIFCO AGARBD DIFCO214010
Dimetil sulfatoSigma AldrichD186309-5ML
Dinabeads y comercio; Cuentas de estreptavidina C1 MyOne  Invitrogen65001Utilizado para el pulldown de biotina en la Sección 4.1
Dinabeads y comercio; ARNm DIRECTO & COMERCIO; Kit de purificaciónInvitrogen61011Utilizado para la selección Poly A en la Sección 5.1
EDTA, pH 8, 0,5MSigma Aldrich y Sigma Aldrich;03690-100ML
EtanolSigma AldrichE7023-500ML
GlycoBlueInvitrogenAM9516Co-precipitante usado en los pasos 4.2.7 y 5.2.4
Induro y reg;   Transcriptasa inversaNew England BiolabsM0681SEnzima RT utilizada en el paso 6.3.1
Alcohol isoamílicoSigma Aldrich y Sigma Aldrich;W205710-1KG-K
IsopropanolJT-BAKER9084-05-01
Kit de PCR KAPA HiFi HotStart    Roche07958889001ADN Pol de alta fidelidad usado en 7.3.2 y 7.4.1 para reacciones PCR
Cloruro de magnesioSigma AldrichSLCM2154
Kit de purificación PCR MinEluteQiagen28004Usado para la limpieza de ADN en los pasos 6.3.3 y 7.2.2
Ligasa de ARN M-ésimoNew England BiolabsM2611A
Oligo Clean & ConcentradorZymo ResearchD4060Sugieren para la limpieza de ADN Oligo en el paso 7.1.2
Acetato de Potasio Sigma Aldrich236497-500G
Cloruro de potasioJT Baker3040-01
Hidróxido de potasioAvantor6984-04-01
ARN Limpio y Concentrador-5Zymo ResearchR1014Kit de limpieza de ARN utilizado en el paso 5.3.2 tras el tratamiento con PNK
RNaseOUT y comercio; Inhibidor de la ribonucleasa recombinanteThermo Fisher Scientific10777019Inhibidor de RNasa utilizado en el paso 5.3.1 durante el tratamiento con PNK
SarkosylIBI ScientificIB07080
Acetato de sodioCalidad Biológico351-035-721
Cloruro de sodioSigma AldrichS5150-1L
Hidróxido de sodio y nbsp;Macron7708-10
SUPERase· En y comercio; Inhibidor de RNasa (20 U/μ L)Thermo Fisher ScientificAM2696Inhibidor de RNasa usado en el paso 6.3.1
Polinucleótido quinasa T4New England BiolabsM0201S
Termoestable 5' App ADN/ARN LigasaNew England BiolabsM0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1MTermo CientíficaJ60202. K2
Triton X-100TEKNOVAT1105
TRIzol™ ReactivoInvitrogen15596-026Para la elución de ARN incipiente en la Sección 4.2; también denominado "reactivo de ARN" en la Sección 4
β-mercaptoetanolSigma AldrichM6250-1L

References

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