Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

Summary

La estructura secundaria del ARN se ha observado principalmente en ARN maduro mediante métodos de sondeo estructural. La secuenciación de seguimiento de estructura co-transcripcional (CoSTseq) unifica el funcionamiento nuclear, que se ha utilizado para estudiar la posición de la polimerasa en ARN naciente, mediante sondeo estructural. CoSTseq permite así la observación de la estructura secundaria del ARN en ARN bajo transcripción activa.

Abstract

Durante la transcripción, el ARN naciente comienza a emparejar bases al salir de las ARN polimerasas (Pols). Este emparejamiento de bases permite la formación de estructuras de ARN que influyen críticamente en la expresión génica a nivel de procesamiento, traducción y estabilidad del ARN. Los métodos establecidos para estudiar la estructura secundaria del ARN se limitan a los transcritos maduros, mientras que se sabe poco sobre los estados de plegamiento. Además, la abundancia relativamente menor (< 1%) y la naturaleza transitoria del ARN incipiente complican su aislamiento y caracterización. El Seguimiento de Estructura Co-Transcripcional (CoSTseq) aprovecha el proceso transcripcional con la sondaje de biotina-NTP y sulfato de dimetil (DMS) para adquirir simultáneamente la posición Pol y el estado de emparejamiento de bases de los transcritos emergentes. En Saccharomyces cerevisiae, CoSTseq proporciona la secuencia e información estructural cerca del extremo 3' de los ARN incipientes transcritos por cualquiera de los tres polares de ARN. Durante el proceso transcripcional, la biotina-NTP incorporada en el sitio activo detiene eficazmente a los Pols. Luego, el tratamiento con DMS metila nucleótidos A, C y U desapareados. El enriquecimiento posterior de biotina y la síntesis de ADNc con una transcriptasa inversa con conmutación de plantilla permiten la secuenciación de extremos emparejados y el cálculo de reactividades DMS en función de la posición Pol. CoSTseq se realiza fácilmente junto a la sondaje DMS (DMS-MaPseq), lo que permite capturar también el transcrito maduro plegado. Aquí se presenta un protocolo detallado para CoSTseq y DMS-MaPseq paralelos, incluyendo la ejecución transcripcional, la preparación de bibliotecas y el análisis de datos.

Introduction

El ARN puede plegarse en estructuras secundarias y terciarias debido al apareamiento de bases dentro de las moléculas de ARN, y estas estructuras pueden verse además influenciadas por proteínas que actúan como chaperonas para guiar el plegamiento del^{ARN 1}. La estructura del ARN puede ser altamente dinámica, donde los ARN celulares pueden ajustarse a una variedad de estructuras definidas por el paisaje termodinámico para generar conjuntos de posibles conformaciones^{de ARN 2}. Los cambios conformacionales dinámicos tienen el potencial de afectar la regulación y expresión^gén....

Protocol

NOTA: Antes de comenzar, asegúrate de que todos los buffers listados en la Tabla 1 estén preparados. Todos los reactivos deben prepararse en agua libre de nucleasa. Se recomienda la esterilización por filtro de tampones cuando se utilizan productos químicos/reactivos de grado no biológico molecular para la preparación del tampón. Para las secciones 1 a 4, prepara lo siguiente con antelación:

1. Preparación de materiales y reactivos

1. Prepara una solución de sarkosyl al 10% (v/v) con al menos un día de antelación para permitir tiempo suficiente para la disolución c....

Results

Esta sección presenta los resultados reales generados al implementar el flujo de trabajo y el análisis de CoSTseq, tal como se describe en este protocolo. En primer lugar, esta sección describe los resultados esperados tras la evaluación de la calidad de preparaciones exitosas de bibliotecas antes y después de la secuenciación. Antes de la secuenciación, los investigadores pueden utilizar una prueba de PCR y un análisis TapeStation para confirmar la presencia de ARN tras el enriquecimien.......

Discussion

El ARN comienza a plegarse co-transcripcionalmente debido a una cinética más rápida de apareamiento de bases en comparación con la velocidad de síntesis 24,25,26,27. Nuestro conocimiento actual sobre el plegamiento de ARN incipiente proviene de estudios de moléculas individuales de ARN procariotas, sondeo in vitro o enfoques in silico. En este.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP 10mM	Invitrogen	18330019
10mM Biotina-11-CTP	Biociencias de Jena	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	New England Biolabs	B7001S	Usado en el paso 7.2.1
Solución salina tamponada con fosfato 10X (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Fenol:cloroformo ácido y nbsp;	Ambión	AM9722
Cuentas AMPure XP para la selección de tamaño	Beckman Coulter	A63880	Usado para la selección de tamaño en el paso 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Extracto de levadura bacto	Gibco	212750
Bicicleta	Sigma Aldrich	B3876-100G
Cloroformo	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLUCOSA	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimetil sulfato	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dinabeads y comercio; Cuentas de estreptavidina C1 MyOne	Invitrogen	65001	Utilizado para el pulldown de biotina en la Sección 4.1
Dinabeads y comercio; ARNm DIRECTO & COMERCIO; Kit de purificación	Invitrogen	61011	Utilizado para la selección Poly A en la Sección 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich y Sigma Aldrich;	03690-100ML
Etanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-precipitante usado en los pasos 4.2.7 y 5.2.4
Induro y reg;   Transcriptasa inversa	New England Biolabs	M0681S	Enzima RT utilizada en el paso 6.3.1
Alcohol isoamílico	Sigma Aldrich y Sigma Aldrich;	W205710-1KG-K
Isopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
Kit de PCR KAPA HiFi HotStart	Roche	07958889001	ADN Pol de alta fidelidad usado en 7.3.2 y 7.4.1 para reacciones PCR
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	SLCM2154
Kit de purificación PCR MinElute	Qiagen	28004	Usado para la limpieza de ADN en los pasos 6.3.3 y 7.2.2
Ligasa de ARN M-ésimo	New England Biolabs	M2611A
Oligo Clean & Concentrador	Zymo Research	D4060	Sugieren para la limpieza de ADN Oligo en el paso 7.1.2
Acetato de Potasio	Sigma Aldrich	236497-500G
Cloruro de potasio	JT Baker	3040-01
Hidróxido de potasio	Avantor	6984-04-01
ARN Limpio y Concentrador-5	Zymo Research	R1014	Kit de limpieza de ARN utilizado en el paso 5.3.2 tras el tratamiento con PNK
RNaseOUT y comercio; Inhibidor de la ribonucleasa recombinante	Thermo Fisher Scientific	10777019	Inhibidor de RNasa utilizado en el paso 5.3.1 durante el tratamiento con PNK
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Acetato de sodio	Calidad Biológico	351-035-721
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S5150-1L
Hidróxido de sodio y nbsp;	Macron	7708-10
SUPERase· En y comercio; Inhibidor de RNasa (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Inhibidor de RNasa usado en el paso 6.3.1
Polinucleótido quinasa T4	New England Biolabs	M0201S
Termoestable 5' App ADN/ARN Ligasa	New England Biolabs	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Termo Científica	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Reactivo	Invitrogen	15596-026	Para la elución de ARN incipiente en la Sección 4.2; también denominado "reactivo de ARN" en la Sección 4
β-mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-1L