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Artículo de método

Modelo novedoso de rata de trombosis sinusal venosa cerebral grave establecido mediante combinación de semiligadura, cloruro férrico y trombina

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DOI:

10.3791/69961

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13 de febrero de 2026

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1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

En este artículo

Resumen

El novedoso modelo en rata de trombosis venosa cerebral severa (CVST), que se construye mediante semiligadura combinada con cloruro férrico y trombina, puede imitar de forma más eficaz el mecanismo fisiopatológico de la CVST grave en humanos.

Resumen

La trombosis del seno venoso cerebral (CVST) es un tipo distinto de ictus que afecta principalmente a personas jóvenes, especialmente a mujeres embarazadas. Aproximadamente el 60% de los pacientes con CVST desarrollan infarto cerebral venoso o hemorragia, que se define como CVST grave. Actualmente, se emplean diversos métodos tanto a nivel nacional como internacional para inducir la CVST en modelos animales. Sin embargo, estos modelos no logran replicar completamente los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la CVST grave, limitando así la investigación básica sobre esta condición. Se puede establecer un modelo novedoso en ratas de CVST grave mediante semiligadura en combinación con cloruro férrico y trombina. La semiligadura se logró midiendo el flujo sanguíneo cerebral (CBF) en la región de interés (ROI) antes y después de la ligadura del seno sagital superior (SSS) utilizando un Imagen de Perfusión Speckle (PSI). La semi-ligadura del SSS induce estasis sanguíneo dentro del seno venoso. La aplicación tópica de cloruro férrico en la superficie del SSS provoca una lesión endotelial, mientras que la inyección directa de trombina en el seno crea un estado hipercoagulable localizado. Este enfoque imita eficazmente los tres componentes clave de la formación de la trombosis: estasis, daño endotelial e hipercoagulabilidad. El modelo resultante presenta una carga trombótica considerable que implica múltiples senos venosos simultáneamente. El trombo inducido permanece estable al menos durante una semana. La tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) demuestra que este modelo puede producir de forma constante un infarto cerebral venoso de gran área, que persiste hasta 7 días. Este modelo incluso puede inducir convulsiones epilépticas en ratas, una capacidad que los modelos anteriores no lograron. La ruptura de la barrera hematoencefálica se observó mediante tinción de azul de Evans (EB). Por lo tanto, el modelo de CVST severo establecido mediante semiligadura combinada con administración de cloruro férrico y trombina replica con mayor precisión la progresión fisiopatológica de la CVST grave en humanos, demostrando estabilidad y fiabilidad.

Introducción

La trombosis del seno venoso cerebral (CVST) es una forma distinta de trastorno cerebrovascular que difiere del ictus arterial. Ocurre con más frecuencia en personas jóvenes 1,2, especialmente en mujeresembarazadas 3, y su incidencia ha ido aumentando de forma constante en los últimos años. Un estudio epidemiológico realizado en Australia indica que la incidencia anual de CVST oscila entre 13,0 y 15,7 casos por millón depersonas 4. En Estados Unidos, la incidencia de CVST muestra una tendencia al alza con la edad. Sin embargo, la edad máxima de inicio en mujeres es menor en comparación con la delos hombres de 5 años. Entre 2021 y 2023, 43 por cada millón de pacientes que acudieron a urgencias en Estados Unidos fueron diagnosticados conCVST 6. En entornos clínicos, la trombosis sinusal múltiple es la forma más comúnmente observada, representando aproximadamente el 57,14% de todos los casos. A esto le sigue la afectación del seno sagital superior (SSS; 16,19%), el seno transverso (11,43%) y el seno sigmoide (8,57%)4. Las principales manifestaciones clínicas incluyen cefalea, que puede ir acompañada de epilepsia, trastornos de la conciencia y síntomas neurológicos focales 7,8,9. Sin embargo, estas manifestaciones no son específicas. Aproximadamente el 60% de los pacientes con CVST desarrollan infarto venoso cerebral o hemorragia, que se clasifica como CVSTgrave 10,11. Aunque el tratamiento de la CVST incluye terapia anticoagulante e intervención quirúrgica, la tasa de mortalidad de la CVST grave sigue siendo tan alta como el 34,2%. Esta alta mortalidad puede atribuirse al hecho de que los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de la CVST grave aún no se comprenden completamente. Por tanto, un modelo animal adecuado de CVST grave es una herramienta experimental esencial para investigar su patogénesis, progresión fisiopatológica y posibles estrategiasterapéuticas 12.

Actualmente, los métodos para inducir modelos animales CVST pueden clasificarse generalmente en los siguientes tipos: ligadurapermanente 13,14, inducción química 15,16,17, enfoquesintervencionistas 18,19, implantación de injertos hechospor ellos mismos 20,21,22 y electrocoagulación bipolar23,24. El trombo inducido por modelos animales anteriores tuvo una duración corta y no pudo inducir simultáneamente trombos múltiples de senos venosos y un infarto cerebral venoso de gran área. Por ello, el desarrollo de un modelo de CVST severo que implique múltiples senos venosos simultáneamente se ha convertido en una prioridad urgente. El método de semiligadura combinado con cloruro férrico y trombina puede establecer un modelo novedoso en rata de CVST grave. Además, el novedoso modelo de CVST grave simula con mayor precisión el proceso fisiopatológico humano de la CVST grave a través de tres aspectos clave: la carga de trombo del seno venoso, el infarto cerebral venoso y la alteración de la barrera hematoencefálica. Este modelo es aplicable a la investigación sobre mecanismos fisiopatológicos y estrategias de tratamiento para el CVST grave. Este novedoso modelo de rata puede utilizarse en el futuro para investigar el mecanismo fisiopatológico de la CVST grave.

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Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Experimentos Animales y Bienestar Experimental de la Capital Medical University (AEEI-2020-119) en Pekín, China, y se llevó a cabo en cumplimiento con las normativas del Comité de Cuidado y Uso Animal de la institución.

1. Preparación animal

  1. Asignar aleatoriamente ratas machos Sprague-Dawley (SD) adultas sanas, con un peso corporal medio de 300 ± 10 g, al grupo experimental o al grupo de operación simulada. Todos los animales se mantuvieron en un ciclo alterno de 12 horas luz/oscuridad, con acceso a comida y agua ad libitum.

2. Aplicación de la PSI

  1. Utiliza la PSI para monitorizar continuamente las alteraciones en el flujo sanguíneo cerebral (CBF) dentro del SSS de las ratas durante todo el proceso de modelado. Seleccione un área circular fija dentro del SSS como región de interés (ROI). Monitorizando los cambios en el CBF del ROI durante la cirugía, determina la finalización de la semiligadura y el éxito de la inducción por trombo.

3. Establecimiento del modelo de ratas con CVST severo

  1. Anestesian ratas usando 5% de enflurano, con una mezcla gaseosa compuesta por 70% de óxido nitroso y 30% de oxígeno administrados mediante una mascarilla anestésica. Mantener la concentración de enflurano en un rango del 1%-2% durante toda la cirugía. Coloca a las ratas anestesiadas en posición prona con la cabeza fija en la línea media usando un marco estereotaxico. Mantén la temperatura corporal en 37 ± 0,5 °C durante toda la cirugía utilizando una almohadilla térmica termostática.
  2. Realiza una incisión longitudinal de 1,5 cm a lo largo de la línea media de la región craneal de la rata. Disecciona el tejido subcutáneo para exponer el cráneo subyacente.
  3. Bajo visualización microscópica, crea una ventana craneal longitudinal (10 x 4 mm) entre el bregma y el lambda usando un taladro dental de alta velocidad. Exponer la SSS y la corteza cerebral bilateral preservando la integridad de la duramadre. Durante el proceso de perforación craneal, enfría la broca de forma continua con solución salina normal para evitar lesiones térmicas en la duramadre y la corteza.
  4. Tras la exposición al SSS, evalúa el CBF del ROI en el SSS usando el PSI y registra los datos correspondientes. Semi-liga el SSS rostral y caudal usando un 8-0 Suturas de poliamida bajo observación microscópica.
    NOTA: Al ligar el SSS, la fuerza debe ser moderada y no excesiva. De lo contrario, no se puede lograr un efecto de semi-ligadura. Idealmente, la ligadura debería realizarse en un solo procedimiento continuo. Los intentos repetidos de ligadura pueden resultar en la perforación del SSS, comprometiendo así el éxito de la fabricación del modelo.
  5. Utilice el PSI para evaluar el CBF del ROI ubicado en el segmento ligado del SSS, confirmando que el CBF había disminuido a aproximadamente el 50% de ese antes de la semi-ligadura. Registra los resultados de forma sistemática.
  6. En condiciones protegidas de luz, sumerge un hilo de seda 3-0 de 7 mm de longitud en cloruro férrico al 40% y úsalo para cubrir la superficie del sitio de ligadura SSS durante 5 minutos. Lava el campo con solución salina normal después de quitar el hilo de seda.
  7. Inyecta 0,1 mL de solución de trombina (500 U/mL) en la cavidad paranasales del segmento ligado usando un microinyector en un plazo de 1 minuto. Repite la inyección dos veces consecutivas adicionales, para una dosis total de trombina de 150 U. El reflujo de trombona al espacio epidural no provocó trombosis pobre.
    1. Para facilitar la inyección de trombina en el SSS, doble suavemente la aguja del microinyector antes de la inserción. Este ajuste permite un mejor control del ángulo de la aguja durante la perforación y ayuda a prevenir una penetración no intencionada a través del SSS.
  8. Reevalúa el CBF del ROI usando el PSI después de la inyección de trombina. Asegúrese de que los resultados confirmen una disminución significativa de la CBF en comparación con la posterior a la semiligadura, indicando una inducción exitosa de la trombosis. Registrar los datos sistemáticamente para su análisis posterior.
  9. Sella la ventana ósea con cera ósea, seguida de sutura de la incisión. Tras la intervención quirúrgica, administrar ketoprofeno (5 mg/kg) por vía subcutánea a cada rata para aliviar el dolor postoperatorio.
  10. En el grupo de operación simulada, realizar solo la craneotomía, sin intervenciones quirúrgicas adicionales.

4. Carga de trombosis del seno venoso e infarto cerebral

  1. Evalúa la carga de la trombosis del seno venoso en tres momentos: 1 día, 2 días y 7 días después de la creación del modelo. Sacrificar ratas y realizar perfusión cardíaca con solución salina normal en diferentes momentos.
  2. Realizar una craneotomía para evaluar visualmente el grado de afectación de la trombosis del seno venoso. Aislar el trombo y someterlo a un análisis cuantitativo. Extirpa el tejido cerebral y seccionarlo en cortes coronales de 2 mm de grosor.
  3. Sumerge las rodajas en una solución al 2% para intentar congelar y incubar en un baño maria a 37 °C durante 20 minutos para facilitar la tinción. A continuación, evalúa visualmente el infarto venoso cerebral y cuantifica el volumen del infarto utilizando el software ImageJ para el análisis estadístico posterior.
    Volumen del infarto = área del infarto en mm cuadrados x espesor [2 mm]

5. Alteración de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB)

  1. Al segundo día tras la cirugía, selecciona aleatoriamente ratas tanto del grupo modelo como del grupo de operación simulada y administra una inyección intravenosa de azul de Evans (EB) al 2% a través de la vena caudal.
  2. Tras 2 horas de administración exitosa de la inyección, se eutanasia a las ratas y se perfunde con solución salina con fosfato tamponado (PBS) a través del ventrículo izquierdo. Extrae los tejidos cerebrales y los secciona en rodajas de 2 mm de grosor para evaluar el grado de penetración del EB.

6. Análisis estadístico

  1. Realizar análisis estadísticos utilizando el software SPSS 17.0. Presenta los datos de medición como media ± desviación estándar. Utiliza el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) o una prueba t de muestras independientes para comparaciones de grupos.
  2. Para el análisis de variables continuas medidas en múltiples puntos temporales dentro del mismo grupo, se utilizan medidas repetidas ANOVA para evaluar diferencias entre grupos entre los tiempos. Se consideró estadísticamente significativo un valor p inferior a 0,05.

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Resultados

Proceso de modelado
La Figura 1A muestra el SSS de la rata, denotado por la flecha. El rostral y caudal del SSS fueron semi-ligados (Figura 1B), seguidos de la aplicación de hilo empapado en cloruro férrico sobre la superficie de las regiones ligadas (Figura 1C). Posteriormente se inyectó trombina en los segmentos ligados para inducir la trombosis. El área indicada por la flecha...

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Discusión

Un modelo novedoso de rata de CVST severo construido por semiligadura combinada con cloruro férrico y trombina no solo simula la estasis sanguínea y la lesión endotelial, sino también el estado hipercoagulable de la sangre, es decir, simula los tres elementos de la formación dela trombosis 25. Lo que resulta aún más emocionante es que el modelo de rata desarrollado con este método es capaz de presentar convulsiones epilépticas. Las crisis epilépticas representan u...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos al Instituto de Enfermedades Cerebrales Críticas de la Universidad Médica Capital por su apoyo técnico. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Pekín (Nº 7182064).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro 2,3,5-trifeniltetrazolioSigma-Aldrich
40% cloruro férrico  Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., China
Evans blue Sigma-Aldrich
Almohadilla térmica yAparato de Harvard Holliston, MA, EE. UU.50-7061-f,  
Taladro dental de alta velocidad y bbsp;Saeshin, Busan, Corea del SurStrong-207B
Medidor de speckles láser  Sistema PSI PeriCam, Suecia
MicroscopioCarl Zeiss, Inc., Berlín, Alemania
Sutura de poliamida  Fábrica de Microaparatos Ningbo Chenghe, China
Marco estereotáxicoDavid Kopf Instruments, Tujunga, California, EE. UU.
TrombinaChang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., China

Referencias

  1. Silvis, S. M., de Sousa, D. A., Ferro, J. M., Coutinho, J. M. Cerebral venous thrombosis. Nat Rev Neurol. 13 (9), 555-565 (2017).
  2. Ferro, J. M., Aguiar de Sousa, D. Cerebral venous thrombosis: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 19 (10), 74(2019).
  3. Kashkoush, A. I., et al. Cerebral venous sinus thrombosis in pregnancy and puerperium: A pooled, systematic review. J Clin Neurosci. 39 (5), 9-15 (2017).
  4. Devasagayam, R., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis Incidence Is Higher Than Previously Thought: A Retrospective Population-Based Study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  5. Payne, A. B., et al. Epidemiology of cerebral venous sinus thrombosis and cerebral venous sinus thrombosis with thrombocytopenia in the United States, 2018 and 2019. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12682(2022).
  6. Ruderman, A., Hogan, A., Epley, C., Courtney, D. M., Milman, B. Epidemiology of Cerebral Venous Sinus Thrombosis: 2021-2023. Cureus. 17 (10), e93654(2025).
  7. Singh, R. J., Saini, J., Varadharajan, S., Kulkarni, G. B., Veerendrakumar, M. Headache in cerebral venous sinus thrombosis revisited: exploring the role of vascular congestion and cortical vein thrombosis. Cephalalgia. 38 (3), 503-510 (2018).
  8. Mahale, R., et al. Acute seizures in cerebral venous sinus thrombosis: what predicts it. Epilepsy Res. 123 (7), 1-5 (2016).
  9. Luo, Y., Tian, X., Wang, X. Diagnosis and treatment of cerebral venous thrombosis: a review. Front Aging Neurosci. 30 (1), 102(2018).
  10. Kowoll, C. M., et al. Severe cerebral venous and sinus thrombosis: Clinical course, imaging correlates, and prognosis. Neurocritical care. 25 (3), 392-399 (2016).
  11. Stam, J., Majoie, C. B. L. M., van Delden, O. M., van Lienden, K. P., Reekers, J. A. Endovascular thrombectomy and thrombolysis for severe cerebral sinus thrombosis: A prospective study. Stroke. 39 (5), 1487-1490 (2008).
  12. Yenigün, M., Jünemann, M., Gerriets, T., Stolz, E. Sinus thrombosis: do animal models really cover the clinical syndrome. Ann Transl Med. 3 (10), 138(2015).
  13. Frerichs, K. U., et al. Cerebral sinus and venous thrombosis in rats induces long-term deficits in brain function and morphology--evidence for a cytotoxic genesis. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (2), 289-300 (1994).
  14. Li, G., et al. A new thrombosis model of the superior sagittal sinus involving cortical veins. World Neurosurg. 82 (1/2), 169-174 (2014).
  15. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  16. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306 (10), 39-49 (2015).
  17. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neurosci Lett. 662 (1), 205-212 (2018).
  18. Wang, J., et al. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats. Brain Res. 1181 (11), 118-124 (2007).
  19. Wang, J., et al. Development of a new model of transvenous thrombosis in the pig superior sagittal sinus using thrombin injection and balloon occlusion. J Neuroradiol. 37 (2), 109-115 (2010).
  20. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. J Neurosci Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  21. Bourrienne, M. C., et al. A Novel Mouse Model for Cerebral Venous Sinus Thrombosis. Transl Stroke Res. 12 (6), 1055-1066 (2021).
  22. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  23. Sakaki, T., Kakizaki, T., Takeshima, T., Miyamoto, K., Tsujimoto, S. Importance of prevention of intravenous thrombosis and preservation of the venous collateral flow in bridging vein injury during surgery: an experimental study. Surg Neurol. 44 (2), 158-162 (1995).
  24. Cokluk, C., Aydin, K., Yemisci, M., Colakoglu, S., Kaplan, S. Cortical anastomotic veins occlusion in the rat including the assessment of cerebral swelling. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 203-210 (2006).
  25. Kyrle, P. A., Eichinger, S. Deep vein thrombosis. Lancet. 365, 1163-1174 (2005).
  26. Lindgren, E., et al. Acute symptomatic seizures in cerebral venous thrombosis. Neurology. 95 (12), e1706-e1715 (2020).
  27. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  28. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  29. Duan, J., et al. Identifying Biomarkers Associated with Venous Infarction in Acute/Subacute Cerebral Venous Thrombosis. Aging Dis. 12 (1), 93-101 (2021).

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