Criosección de implantes sintéticos biocompatibles utilizando resina curable por rayos UV para un análisis mejorado de inmunofluorescencia

Summary

Este trabajo presenta un protocolo de criosección que utiliza estabilización con resina curable por UV para mantener la integridad de la interfaz implante-tejido mientras preserva la accesibilidad al antígeno, permitiendo un análisis fiable y de alta resolución de inmunofluorescencia de implantes de polímero sintético.

Abstract

La evaluación histológica de implantes sintéticos y biocompatibles plantea importantes desafíos técnicos debido a la incompatibilidad entre los métodos convencionales de procesamiento de tejidos y las propiedades fisicoquímicas de estos materiales. Los enfoques actuales que utilizan incrustación completa de resina proporcionan una preservación estructural adecuada, pero comprometen gravemente la accesibilidad del epítopo, limitando así las aplicaciones inmunohistoquímicas esenciales para caracterizar las respuestas inmunitarias del huésped. Por el contrario, la incrustación convencional de parafina muestra una mala adhesión a los sustratos sintéticos y limita la selección de anticuerpos para un perfil inmunológico completo. Los protocolos estándar de criosección mejoran la compatibilidad inmunohistoquímica al mejorar la preservación de antígenos; sin embargo, estos métodos a menudo resultan en una integridad estructural inadecuada de los especímenes que contienen implantes, comprometiendo la evaluación morfológica y la calidad de la sección. Para abordar estas limitaciones, se desarrolló un protocolo de procesamiento novedoso que incorpora una resina curable por UV para la estabilización selectiva de constructos de tejido implantado antes de la criosección. Esta metodología emplea una resina fotopolimerizable para proporcionar soporte mecánico preservando la accesibilidad del epítopo y los determinantes antigénicos, que normalmente se ven comprometidos por la polimerización total de resina. El protocolo permite la generación reproducible de secciones de alta calidad con un grosor óptimo para la evaluación de inmunofluorescencia, logrando una preservación estructural superior en comparación con la sección congelada estándar sin la extensa reticulación que limita la penetración de anticuerpos en muestras convencionales embebidas en resina. Este enfoque representa una solución práctica y rentable para el procesamiento histológico de implantes sintéticos, ofreciendo capacidades analíticas mejoradas para la evaluación de biocompatibilidad y facilitando la caracterización detallada de las respuestas inmunitarias locales en las interfaces implante-tejido.

Introduction

La microscopía de inmunofluorescencia es una técnica analítica esencial en la investigación en medicina regenerativa, que facilita la visualización de la arquitectura tisular y la composición celular utilizando anticuerpos conjugados con fluoróforos. Esta metodología integra la especificidad molecular del reconocimiento inmunoquímico con la sensibilidad y versatilidad de la detección de fluorescencia, permitiendo una observación detallada de las distribuciones celulares de los blancos dentro de sus microambientes tisulares. Los enfoques de inmunofluorescencia abarcan tanto estrategias de marcado directo como indirecto, con protocolos de inmunofluorescencia indirecta que proporcionan una amplificación mejorada de la señal a través de sistemas secundarios de anticuerpos conjugados a diversos fluoróforos que abarcan el espectro visible y el infrarrojo^{cercano 1}. La capacidad inherente de la metodología para la detección simultánea de múltiples objetivos mediante separación espectral facilita la caracterización fenotípica integral de poblaciones celulares heterogéneas y sus relaciones espaciales dentro de microambientes tisulares^{complejos 2}.

Las capacidades técnicas de la microscopía de inmunofluorescencia van más allá de la localización convencional de proteínas para abarcar aplicaciones analíticas cuantitativas, incluyendo mediciones de intensidad de fluorescencia, análisis de colocalización y evaluaciones de distribución espacial críticas para comprender la función celular y la organización^{tisular 3}. En el contexto de la investigación sobre biocompatibilidad de implantes, el análisis de inmunofluorescencia proporciona conocimientos fundamentales sobre las respuestas inmunitarias del huésped, incluyendo reacciones a cuerpos extraños, cascadas inflamatorias y procesos de integración tisular que determinan la aceptación o rechazo del implante a nivel celular y^{molecular 4}.

La implementación exitosa de protocolos de inmunofluorescencia requiere una cuidadosa consideración de metodologías de procesamiento tisular que preserven la integridad morfológica manteniendo la señal fluorescente y minimizando la autofluorescencia de fondo. La selección tradicional de medios de incrustación depende del tipo de tejido, los requisitos analíticos posteriores y los antígenos específicos de interés. Para materiales sintéticos e implantes, la literatura actual recomienda principalmente la incrustación completa de resina para mantener la estabilidad estructural durante los procedimientos de^sección. Sin embargo, este enfoque presenta limitaciones significativas debido a la necesidad de ultramicrotomos y cuchillas especializadas para seccionar bloques de resina polimerizada, lo que representa una inversión considerable en equipos y experiencia técnica. La incrustación de parafina, aunque proporciona un soporte estructural adecuado para la sección, introduce cambios conformacionales en los determinantes antigénicos durante la fijación y el procesamiento mediante una deshidratación extensa, endurecimiento químico e infiltración con disolventes orgánicos que pueden desnaturalizar proteínas y enmascarar epítopos. El procesamiento de parafina también produce interferencias intrínsecas de autofluorescencia que comprometen la detección de señales y el análisis cuantitativo. Estas alteraciones requieren procedimientos de recuperación de antígenos, que normalmente implican la recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) o la recuperación de epítopos inducida por proteolíticos (PIER), para restaurar la accesibilidad de^{anticuerpos 6}. A pesar de estas intervenciones, numerosos anticuerpos disponibles comercialmente siguen siendo incompatibles con los ejemplares incrustados en parafina, y las duras condiciones de recuperación pueden comprometer aún más la calidad de la señal fluorescente e introducir artefactos de fotoblanqueamiento.

La criosección ofrece una metodología alternativa de procesamiento para aplicaciones de inmunofluorescencia. Se pueden emplear dos métodos de criopreservación para la preparación de tejidos. El primer enfoque consiste en criopreservación rápida mediante la inmersión directa de muestras de tejido fresco en un baño de isopentano preenfriado con nitrógeno líquido para alcanzar temperaturas inferiores a –20 °C, seguida de la sección utilizando microtomos criostaticos equipados con cámaras de corte controladas por temperatura. El segundo protocolo utiliza un periodo de fijación corto en paraformaldehído (PFA) o formalina, seguido de crioprotección mediante infiltración graduada de sacarosa antes de congelación. El proceso de criopreservación crea una matriz rígida que mantiene la integridad tisular mientras preserva las conformaciones proteicas nativas esenciales para el reconocimiento de anticuerpos. La sección congelada mantiene los tejidos en un estado casi nativo con modificaciones químicas^mínimas, reduciendo así la necesidad de procedimientos agresivos de recuperación de antígenos y permitiendo el uso de una gama más amplia de anticuerpos primarios, incluidos aquellos incompatibles con tejidos incrustados en parafina debido al enmascaramiento o desnaturalización del^{epítopo 8}.

El proceso de criosección utiliza típicamente un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), un medio de incrustación soluble en agua compuesto de alcohol polivinílico y polietilenglicol que proporciona soporte estructural durante la sección, manteniendo la transparencia y la compatibilidad con los sistemas de detección de fluorescencia. La incrustación OCT facilita la generación de secciones finas y uniformes de entre 5 y 15 μm de grosor, dependiendo de los requisitos analíticos específicos y las características del^{tejido 9}. La preservación de conformaciones proteicas nativas en secciones congeladas mantiene relaciones señal-ruido óptimas esenciales para el análisis cuantitativo de inmunofluorescencia, al tiempo que conserva epítopos intactos que permiten el uso de una gama más amplia de anticuerpos primarios, incluidos aquellos incompatibles con tejidos incrustados en^{parafina 8}.

Sin embargo, la sección de tejidos congelados presenta desafíos técnicos únicos, especialmente al procesar materiales sintéticos implantados que poseen propiedades fisicoquímicas distintas en comparación con los tejidos biológicos nativos. La expansión térmica diferencial entre polímeros sintéticos y interfaces tejidos biológicas durante la congelación puede provocar tensiones mecánicas localizadas que comprometen la integridad estructural y generan artefactos de^{seccionamiento 10}. Además, la rigidez inherente de muchos materiales sintéticos en relación con tejidos biológicos congelados puede causar la deflexión de la hoja durante la sección, resultando en un grosor desigual de la sección y daños tanto en la muestra como en el equipo de corte. Estas limitaciones técnicas requieren protocolos de procesamiento especializados que puedan adaptarse a los requisitos únicos de muestras que contienen implantes, manteniendo al mismo tiempo las ventajas del seccionado congelado para aplicaciones de inmunofluorescencia.

Para abordar estas limitaciones, este estudio desarrolló un protocolo de criosección que combina estabilización selectiva con resina curable por UV con parámetros controlados de sección criográfica para permitir un análisis inmunofluorescente multiparámetro de alta resolución de constructos de tejido implantado.

Protocol

Esta investigación se realizó conforme a las directrices del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales de la Clínica Mayo (IACUC) bajo el número de aprobación A00003765-18-24. Todos los procedimientos que implicaron implantes sintéticos biocompatibles se realizaron en condiciones estériles, de acuerdo con los protocolos de bioseguridad apropiados.

1. Procesamiento de muestras y crioprotección

NOTA: Manipular formalina exclusivamente en una campana extractora química y usar el equipo de protección individual (EPP) adecuado, ya que el formol contiene formaldehído, un potente irritante, sensibilizante y carcinógeno.

1. Fijar muestras sintéticas integradas en tejido en formol tamponado al 10% de neutro durante la noche a 4° C utilizando un mínimo de 10 volúmenes de fijador en relación con el volumen del tejido para asegurar una inmersión completa y una penetración adecuada. El objetivo de este periodo limitado de fijación es lograr una reticulación mínima mientras se preserva la morfología tisular. (Véase la Tabla de Materiales para los materiales utilizados en el Protocolo.)
2. Transfiere las muestras a una solución de sacarosa al 15% preparada en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para incubación nocturna a 4° C con agitación suave. Asegura una infiltración completa de sacarosa, como se evidencia en el hundimiento del tejido.
3. Transfiere las muestras a una solución de sacarosa al 30% en PBS para una segunda incubación nocturna a 4° C. Confirma el equilibrio completo hundiéndose el tejido en el fondo del recipiente, indicando una infiltración adecuada de sacarosa y desplazamiento de agua.
4. Prepara una proporción volumétrica 1:1 de solución de sacarosa al 30% y compuesto OCT. Incubar muestras en este medio de transición durante 2 horas a 4° C, luego transfierirlas al 100% de OCT durante 1 hora para lograr un equilibrio completo, como indica un aspecto uniformemente opaco del tejido.
5. Colocar las muestras cuidadosamente en criomoldes estándar llenos de compuesto fresco de OCT, asegurando una orientación óptima para los planos de sección. Orienta con la interfaz implante-tejido disponible para procedimientos posteriores. Elimina las burbujas de aire usando pinzas preenfriadas.
6. Colocar criomoldes llenos inmediatamente sobre la plataforma de hielo seco para crear un gradiente de temperatura que promueva la rápida formación de cristales de hielo desde abajo hacia arriba. Monitorizar durante 10–15 minutos hasta la solidificación completa, confirmado por la característica apariencia opaca y blanca del compuesto OCT congelado. Transfiere los bloques congelados a almacenamiento a –80° C o directamente a la cámara del criostato para seccionar inmediatamente.

2. Montaje del criostato y seccionamiento inicial

1. Mantener la cámara controlada por temperatura del criostato a –15° °C. Verificar la temperatura mediante monitorización digital integrada y equilibrar durante la noche antes de la introducción de la muestra.
2. Instala cuchillas desechables nuevas. Ajusta el ángulo de la pala para la sección combinada de material sintético-biológico según las especificaciones del fabricante.
3. El grosor deseado de la sección (50–100 μm) se programa en el criostato seleccionando la configuración de Grosor en el panel de control, ajustando con las teclas de flecha y confirmando el parámetro pulsando la tecla Set .
4. Avanzar a través de la muestra incrustada para alcanzar la profundidad predeterminada correspondiente a la interfaz implante-tejido. Monitorizar la superficie avanzada de la sección para identificar el plano óptimo para la aplicación de resina UV, caracterizada por cambios sutiles en la opacidad tisular y la exposición inicial de la periferia del implante, y la profundidad se confirma cuando estas características permanecen consistentemente visibles en secciones recortadas sucesivas.
   NOTA: Detener la sección inmediatamente al llegar a la interfaz crítica para evitar el avance más allá de la región objetivo.

3. Aplicación de resina curable por UV

NOTA: Manipula resina curable por UV en un área bien ventilada usando el EPI adecuado y protege los ojos y la piel de la luz de curado LED-UV. Estas resinas contienen irritantes que pueden causar reacciones en la piel y los ojos, y la exposición a LED-UV puede provocar lesiones oculares inducidas por los rayos UV.

1. Corta la parapelícula con tijeras a dimensiones de 2–3 mm que superen el perímetro del implante. Separa cuidadosamente del respaldo protector de papel usando pinzas estériles.
2. Dispensar 5–10 μL de resina curable por UV sobre la superficie de parafilm expuesta (Figura 1A). El volumen de resina se optimiza realizando aplicaciones de prueba preliminares en las que se dispensan volúmenes incrementales, y la dispersión resultante se evalúa visualmente para asegurar una cobertura uniforme de la superficie de la muestra sin desbordamientos ni acumulación excesiva de resina que interferiría con la sección.
3. Sustituye inmediatamente el respaldo de papel protector sobre el parafilm cargado de resina. Aplicar un rodillo de junta de poliuretano (2 pulgadas) con presión constante en pasadas paralelas y superpuestas, seguidas de pasadas perpendiculares para lograr una capa fina y uniforme de resina (Figura 1B).
4. Retira cuidadosamente la capa de papel protector, revelando una película de resina distribuida uniformemente. Colocar la resina-parafilm directamente sobre la superficie expuesta del implante, asegurando una alineación precisa con la interfaz implante-tejido (Figura 1C).
5. Aplica un rodillo de unión de poliuretano desde el centro del implante hacia afuera para eliminar burbujas de aire y asegurar un contacto íntimo entre la resina y tanto las superficies sintéticas como biológicas (Figura 1D).
6. Posición de una fuente de luz LED UV de longitud de onda de 405 nm a una distancia de 2–3 cm, directamente en la superficie del implante. Exponer durante 90 s para asegurar una polimerización completa, verificada mediante una evaluación táctil de la dureza de la resina y características no pegajosas (Figura 1E). Coloque una cubierta protectora UV sobre la ventana de la cámara crioplástica antes de la fotopolimerización UV para proteger al operador de la exposición dañina a los UV durante el procedimiento de curado con resina.

4. Recuperación de sección y preparación de la corredera

1. Retirar la parapelícula mediante un solo movimiento continuo para evitar la interrupción mecánica de la interfaz resina-tejido. La adherencia completa de la resina se confirma inspeccionando la superficie expuesta bajo luz criostatica para comprobar que la resina es uniforme, la ausencia de levantamiento en el borde del tejido y la ausencia de residuos visibles de parapelícula.
2. Muestras de sección a un espesor predeterminado de 8 μm utilizando un mecanismo calibrado de avance de microtomo. Monitoriza cada sección para detectar un grosor consistente y la ausencia de artefactos (compresión, desgarros, secciones incompletas). Coloca la placa anti-rodillo de forma óptima para evitar que se enrolle (Figura 1F).
   NOTA: Se utilizan portaobjetos adhesivos hidrofílicos y cargados positivamente porque proporcionan una mejor retención de muestras difíciles, mejorando la adherencia durante la transferencia de sección y el procesamiento posterior. Etiqueta las diapositivas individualmente antes de la transferencia de sección.
3. Coloca la superficie adhesiva de la corredera, asegurando el contacto inicial en el borde de la sección antes del contacto progresivo en toda la zona. Asegúrese de que la superficie de resina curada por UV se adhiera al portaobjetos mientras mantiene la superficie tisular hacia arriba para la inmunofluorescencia (Figura 1G).
4. Presiona suavemente el conjunto de la corredera de sección para eliminar las burbujas de aire. Verifica la orientación correcta bajo la iluminación criostatica, confirmando la interfaz implante-tejido intacta.

5. Almacenamiento y preservación

1. Coloque las diapositivas terminadas en cajas de almacenamiento preetiquetadas a –20° C para aplicaciones que requieran procesamiento en un plazo de 72 horas.
2. Utilizar condiciones de 80° C para periodos de conservación superiores a una semana.

6. Protocolo de tinción por inmunofluorescencia

NOTA: Manipula la pepsina con el EPI adecuado, ya que es un irritante para la piel y las respiraciones.

1. Recuperar las láminas del almacenamiento y transferirlas a cámaras de humedad durante 15–20 minutos para equilibrar la temperatura ambiente.
2. Realiza tres ciclos de lavado PBS de 2 minutos cada uno.
3. Obtención de antígenos:
   1. Método de recuperación de epítopos inducidos por calor (HIER): Posiciona las láminas horizontalmente en recipientes seguros para microondas con una solución de recuperación 1x objetivo. Microondas (salida de 1000 vatios) a alta potencia, durante 15 minutos, seguido de refrigeración a temperatura ambiente.
   2. Método de recuperación de epítopos inducida por proteolíticos (PIER): Aplicar 100–150 μL de solución de pepsina lista para usar por sección. Cubre con cubiertas de plástico temporales e incuba a 37° C durante 10 minutos en una cámara humidificada.
4. Realiza tres ciclos de lavado PBS secuenciales (2 minutos cada uno).
5. Aplica 1 mL de solución bloqueadora que contiene 0,1% de saponina y 2,5% de suero normal de cabra en PBS. Incuba 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
6. Realiza tres ciclos de lavado PBS secuenciales (2 minutos cada uno).
7. Aplicar soluciones primarias de anticuerpos de 100 μL en concentraciones optimizadas:
   1. Anticolágeno IV conejo policlonal a 1:100 de dilución.
   2. Anti-Laminina conejo policlonal a 1:500 de dilución.
   3. Anticuerpo monoclonal anti-F4/80 de conejo a 1:500 de dilución.
8. Cubre con coberturas plásticas temporales e incuba durante la noche a 4° C en cámaras humidificadas.
9. Realiza tres ciclos de lavado PBS (2 minutos cada uno).
10. Aplica anticuerpos secundarios a una concentración de 10 μg/mL.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. Anti-Conejo IgG Alexa Fluor 488 para Cabra
11. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad.
12. Tinción opcional de aglutinina con germen de trigo (WGA):
    1. Aplica WGA-Alexa Fluor 647 a 5 μg/mL en PBS con un 2,5% de suero normal de cabra.
    2. Cubre e incuba a 37° C durante 30 minutos. Realiza tres ciclos de lavado PBS de 2 minutos cada uno.
13. Aplica un medio de montaje endurecido de 80 μL con contratinte nuclear por sección.
14. Cubre la cubierta con el cristal de la cubierta para eliminar burbujas de aire.
15. Deja que las láminas curen horizontalmente a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad.
16. Guarda a 4° C hasta una semana para obtener una calidad óptima de imagen.

7. Microscopía de fluorescencia y adquisición de imágenes

1. Realizar imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con los juegos de filtros del fabricante: excitación/emisión 360/460 nm, excitación/emisión 470/525 nm, excitación/emisión 545/605 nm, excitación/emisión 620/700 nm.
2. Las imágenes se capturan seleccionando cada canal de fluorescencia dentro del menú de Filtro del software del microscopio. Antes de la optimización de la exposición, se realiza un procedimiento de balance de negros seleccionando Ajustar Balance de Negros para asegurar una corrección de línea base precisa para cada canal. Los parámetros de exposición se optimizan abriendo la ventana de Captura de Imagen , activando el modo Live y ajustando los controles de Exposición e Intensidad de Luz hasta lograr una alta relación señal-ruido sin saturación de píxeles. La saturación se monitoriza mediante la pantalla de histogramas del software y la herramienta Resaltar Píxeles Saturados . Cada canal se ajusta de forma independiente antes de la adquisición de la imagen.
3. Realizar adquisición automatizada de losetas con el 10% de solapamiento del fabricante entre campos adyacentes. Mantener el ajuste automático del enfoque durante toda la secuencia de adquisición.

Results

Evaluación y optimización de la calidad de las secciones
Tras la estabilización y seccionamiento con resina UV a 8 μm de grosor, recoge secciones en portaobjetos adhesivos y evalúa el control de calidad. Las secciones de alta calidad demuestran morfología intacta sin grietas significativas ni artefactos de fracturación, con arquitectura tisular continua y una interfaz implante-tejido preservada (Figura 2A). Las secciones que presentan dañ...

Discussion

Este método de estabilización con resina curable por UV ofrece un enfoque alternativo para crioseccionar muestras de tejido incrustadas en OCT que contienen materiales sintéticos que de otro modo serían difíciles de procesar utilizando técnicas estándar de sección congelada. Aunque existen diversas opciones de adhesivos, como portaobjetos cargados, cintas de adhesivo y otros soportes adhesivos, para ayudar a evitar que secciones de tejido o muestras frágiles se desprendan durante el mani...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5W Luz Ultravioleta de Cuello de Ganso 395&n; 405 nm para curado con resina	Amazon	UPC & lrm; 603335835561
Anticuerpo - Anti-F4/80 (Monoclonal)	Abcam	ab300421	1:500
Anticuerpo - Colágeno IV (Policlonal)	Abcam	AB6586	1:100
Anticuerpo - Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
Anticuerpo - Anti-Conejo IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
Anticuerpo - Laminina (policlonal)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Material biocompatible #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	Material biocompatible #2
Formalina al 10% amortiguada	Cardinal Health	C4320-101
BZ-X Filter Cy5	Keyence	OP-87766	Conjunto de filtros
Filtro BZ-X DAPI	Keyence	OP-87762	Conjunto de filtros
Filtro BZ-X GFP	Keyence	OP-87763	Conjunto de filtros
Filtro BZ-X TRITC	Keyence	OP-87764	Conjunto de filtros
Software analizador BZ-X800	Keyence	BZ-X800	Software integrado
Fisherbrand Premium Coverglass & nbsp; 50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Impresora 3D Form4B	FormLabs	F4B-Impresora
Tanque de resina Form4	Formlabs	RT-F4-01
Suero de cabra	Gibco	16210064
Criostato HM525 NX	Epredia	956641EC
Microondas doméstico	Panasonic	NN-S766BA	Salida de 1000 vatios
Cubiertas de plástico IHC-Tek 24 mm x 60 mm	IHC Mundo	IW-2601	Cubierta temporal
JDiction Resina UV de baja viscosidad	Amazon	6974143904430	Alta autofluorescencia
Keyence BZ-X800	Keyence	BZ-X800
Let's Resin UV Resin Clear Hard Type	Amazon	ALR00038	Alta autofluorescencia
Let's Resin Resina UV transparente de alta viscosidad	Amazon	ALR00048
Diapositivas de vidrio para diapositivas micro Matsunami MAS	Suministro de Nuevos Jugadores	SUMAS1190	Corredera adhesiva
Implante quirúrgico Medpor	Stryker	8662	Material biocompatible #3
Mr. Resina UV Resina Cristalina	Amazon	B08FRF9QTB	Alta autofluorescencia
Hoja Ultra Microtome MX35	Epredia	3053835
Película de laboratorio Parafilm M	Parafilm	P7543-1EA
Pepsin	Sigma	R2283-15ML
Solución salina tamponada con fosfato pH 7,4	Sigma	P3813
Plan Apo & lambda; 40X	Keyence	BZ-PA40	Lente objetivo
Plan Apo & lambda; 4X	Keyence	BZ-PA04	Lente objetivo
Rodillo de costura de poliuretano	Amazon	682698799567
Montaje antifade de vidrio ProLong con tinte NucBlue	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Contratinte
Saponina	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Láminas de silicona estéril	Bentec	PR72034-51N
Solución de recuperación de objetivos, citrato pH6	Agilent	S236984-2
Compuesto Tissue-Tek O.C.T	Sakura	4583
Aglutinina de Germen de Trigo AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL