Un ensayo FRET de molécula única permite el análisis cuantitativo del recocido mediado por Hfq entre ARNs bacterianos y ARNm, permitiendo medir la cinética y estabilidad de interacción. Los resultados representativos demuestran cómo la longitud de la semilla, los motivos de unión de Hfq y el espaciamiento de los motivos afectan a la formación dúplex del ARN.
Artículo de investigación
Efecto de la longitud de la semilla y los motivos de unión en el recocido de ARNmm mediado por Hfq analizado utilizando FRET de molécula única
En este artículo
Resumen
Resumen
Definir las reglas que rigen el recocido entre pequeños ARN bacterianos (ARNs) y sus objetivos de ARNm es complicado porque estos ARN son altamente heterogéneos en secuencia y estructura. Para desentrañar la contribución de características individuales, variamos sistemáticamente los determinantes clave, incluyendo la fuerza semilla, los motivos de unión Hfq y el espaciado entre ellos. Los efectos de estas características sobre la estabilidad dúplex ARNs-mRNA se probaron utilizando transferencia de energía de resonancia de Förster de molécula única (smFRET), que permite monitorizar moléculas individuales de ARN en la escala de milisegundos y proporciona acceso a eventos dinámicos que a menudo se ocultan en ensayos de conjunto.
Demostramos que las regiones semilla cortas (4-5 pb) forman complejos inestables y de corta vida, mientras que las semillas más largas (8-10 pb) producen dúplexes estables. Extender los motivos de unión a Hfq o introducir un espaciador entre los sitios de unión en el ARNm aumentó aún más la vida útil de interacción, destacando la importancia de la resistencia de los motivos y la disposición espacial en la eficiencia del recocido mediada por Hfq. Además, este enfoque proporciona un marco robusto y reproducible para diseccionar la dinámica de interacción ARN-ARN a resolución de molécula única y para sondear los mecanismos de chaperona de ARN.
Introducción
La expresión génica bacteriana está ampliamente regulada a nivel post-transcripcional por pequeños ARN. Estos ARN cortos (típicamente de 50-300 nt) actúan apareándose de bases con los ARNm objetivo1. En muchos casos, los ARNss se reconec a los sitios de unión al ribosoma para reprimir la traducción o desencadenar la desintegración del ARNm reclutandoRNasas 2,3. Aunque estas interacciones han sido ampliamente estudiadas mediante ensayos genéticos y bioquímicos, la mayoría de los enfoques disponibles infieren regulación indirecta a partir de efectos en estado estacionario sobre los niveles de ARN o la salida de proteínas, lo que dificulta la resolución de la dinámica subyacente de unión.
La regulación eficiente del objetivo suele requerir el chaperona de ARN Hfq, una pequeña proteína hexamérica similar ala Sm 4,5. La Hfq extiende la vida media de los ARNsS al protegerlos de lasnucleasas 6 y promueve el recocido con ARNmobjetivo 7,8. La Hfq cumple estas funciones a través de tres superficies distintas de unión al ARN con diferentes preferencias: la cara distal reconoce los motivos AAN que normalmente se encuentran en ARNm, la cara proximal se une a secuencias ricas en U típicas de los terminadores de ARNs, y el borde interactúa electrostáticamente con los esqueletes deARN 9. Sin embargo, Hfq está presente en abundancia mucho menor que el conjunto total de ARNinteractuantes 10,11. A pesar de esta aparente limitación, los ARNss recién sintetizados encuentran rápidamente sus objetivos y desencadenan la regulación en cuestión de minutos tras latranscripción 12. Esta paradoja sugiere que las interacciones ARN-Hfq son altamente dinámicas, con ARN que se asocian y disocian continuamente en lugar de permanecer unidos en complejosestables 13,14. Comprender cómo estas interacciones transitorias producen una regulación fiable requiere acceso experimental a eventos de unión individuales en lugar de promedios poblacionales.
Las interacciones entre ARNss y ARNm están mediadas por secuencias semilla imperfectamente complementarias, que deben localizar sus sitios de coincidencia dentro de ARNm que a menudo son largos y altamente estructurados. Además, la distancia entre la región semilla del ARNsn y el sitio de unión a Hfq en el ARNm puede variarconsiderablemente hasta 15, lo que complica aún más el proceso de recocido. Hfq ayuda a superar estos desafíos transfiriendo de forma flexible los ARNsS entre posibles sitios de unión en el objetivo, aumentando así la probabilidad de encontrar la región de emparejamientocorrecta 16. El emparejamiento mediado por Hfq también puede remodelar estructuras locales de ARNm, desenrollando transitoriamente regiones emparejadas de bases y exponiendo secuencias que de otro modo serían inaccesibles. Sin embargo, dicha remodelación también puede conducir a eventos de recocido no productivos o abortivos. Estas interacciones transitorias a veces pueden estabilizarse mediante fuertes motivos de unión Hfq situados cerca del sitio deemparejamiento 17. A pesar de esta flexibilidad, no todos los encuentros entre ARNsS-ARNm resultan en una formación dúplex estable, y los factores que determinan la eficiencia del recocido siguen siendo poco comprendidos. En particular, sigue sin estar claro cómo los determinantes individuales de la secuencia contribuyen cuantitativamente a la vida útil de unión y a la estabilidad compleja.
Aquí, establecimos un sistema mínimo de molécula única reconstituida que permite la manipulación escalonada de determinantes de secuencia y la medición directa de la cinética de recocido usando smFRET. En este sistema, diseñamos pares de ARN con recocido inicialmente ineficiente y modificamos sistemáticamente características clave como la resistencia de la semilla, la resistencia de los motivos de unión a Hfq y el espaciamiento entre estos sitios, para analizar cómo los parámetros individuales influyen en la estabilidad dúplex. Al aislar características de secuencia definidas en un sistema in vitro controlado, este enfoque permite la disección mecanicista de las reglas de direccionamiento de ARNs, que son difíciles de desenredar in vivo debido a la complejidad de la red y los efectos regulatorios indirectos.
Protocolo
Este protocolo describe el ensayo FRET de molécula única para monitorizar el recocido de ARNss-mRNA. Incluye procedimientos para el diseño, síntesis, pasivación y funcionalización de portaobjetos de modelos, imagen de moléculas individuales y análisis cuantitativo de datos.
Preparación de ARN
Diseña las secuencias de ARNsS y ARNm in silico. Cada ARNsn debe terminar con un terminador de transcripción y contener un motivo de unión Hfq rico en U, así como una secuencia semilla complementaria al ARNm objetivo. El ARNm correspondiente debe incluir repeticiones AAN que sirven como motivo de unión a Hfq y una secuencia complementaria a la región semilla de ARNs. Las secuencias fuera de la unión Hfq se aleatorizan evitando motivos AAN y tractos ricos en U para evitar interacciones Hfq no intencionadas. Añadir una secuencia complementaria de cable al extremo 3' del ARNm para permitir la inmovilización en la superficie durante la imagen. Predecir estructuras secundarias de ARN excluyendo la secuencia complementaria de cuerda utilizando estructura de ARN a través del servidor web olocalmente 18. Para análisis web, sube las secuencias FASTA al Servidor Web RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) y selecciona Predecir una Estructura Secundaria. Utiliza parámetros por defecto (temperatura 37 °C, sin restricciones de plegado). Tras el cálculo, se inspecciona el diagrama de estructura y la probabilidad de plegamiento. Las regiones se clasificaron como ocluidas si los nucleótidos dentro del motivo semilla o de unión a Hfq tenían probabilidades predichas de emparejamiento de bases >60%. Las secuencias que superaban este umbral fueron rediseñadas.
Prepara plantillas de ADN para la transcripción in vitro extendiendo oligonucleótidos superpuestos usando ADN polimerasa, siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración del cebador era de 3 μM cada uno. El programa termociclador se utilizó según lo recomendado por el fabricante, salvo que el número de ciclos de amplificación se redujo a 8, lo que fue suficiente para extender los cebadores.
Transcribe ARN a 37 °C durante 3 horas hasta toda la noche usando ARN polimerasa T7 en tampón de transcripción 1× (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM de espermidina, 10 mM de NaCl), suplementado con 1 mM cada NTP, 40 mM de DTT y 30 mM deMgCl 2. Detiene la reacción añadiendo EDTA a una concentración final de 30 mM. Para la precipitación de ARN, añadir 1/10 de volumen de 3 M NaOAc (pH 5,4), seguido de 2,5-3 volúmenes de ≥99% de etanol. Mezcla bien y incuba a -80 °C durante 1 hora. ARN en pellet por centrifugación a ≥20.000 × g durante 35 minutos a 4 °C. Retira el sobrenadante, lava el pellet con etanol al 70% y seca al aire brevemente. Disuelva el pellet de ARN en 20 μL de urea de 8 M y calienta a 90 °C durante 2 minutos. Purifica el ARN en geles de poliacrilamida al 8% que contienen 8 M urea. Elimina las bandas de interés y eluye el ARN durante la noche en el tampón de elución (0,3 M acetato sódico, pH 5,4, 1 mM EDTA). Recuperar el ARN mediante precipitación de etanol (seguir las instrucciones para la precipitación de ADN) y disuelva el pellet en agua libre de nucleasa.
Para preparar ARN para marcaje fluorescente, realizar transcripción in vitro según lo descrito, complementando la reacción con 32 mM de GMP para generar transcritos que contengan un monofosfato de 5'. Trata el ARN con 1-etil-3-[3-dimetilaminopropilo] carbodiimida, cloruro19 (EDC) e imidazol para introducir un grupo amina en el extremo 5'. Incuba el ARNsn en un tampón carbonato-bicarbonato (pH 8,5) con Alexa Fluor 555 o éster Cy3 NHS, siguiendo las instrucciones del fabricante. Purificar el ARN modificado usando columnas de espín de cromatografía, precipitar con etanol y disuelver el pellet en agua libre de nucleasa. Determinar la eficiencia del marcado espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 260 nm y en el máximo de absorción específico del colorante usando un nanodrop o espectrofotómetro equivalente. Calcula las concentraciones de ARN y colorantes utilizando la ley de Beer-Lambert y los coeficientes de extinción correspondientes proporcionados por el fabricante del fluoróforo. La eficiencia del marcaje se define como la proporción molar del contraste respecto al ARN y rutinariamente se acercaba al 100%. Los ARN marcados pueden almacenarse a -20 °C.
Ordena oligonucleótidos de ADN que llevan una mitad de biotina 3′ y un enlace C6 de 5′-amino. Precipita ADN usando etanol y acetato de sodio como se ha descrito anteriormente. Etiqueta el grupo amina con éster Cy5 NHS en un tampón carbonato-bicarbonato (pH 8,5) según las instrucciones del fabricante. Determinar la concentración de ADN marcado espectrofotométricamente como se describió anteriormente. Los ADN marcados pueden almacenarse a -20 °C.
Purificación de Hfq
Cultivar células Escherichia coli BL21 (DE3 ) Δhfq::cat-sacB que portan el plásmido de expresión Hfq pET21b-EcHfq, en el que el gen hfq de E. coli se expresa desde un promotor inducible por IPTG. Hfq se expresa sin etiqueta de afinidad; la proteína nativa contiene suficientes residuos de histidina expuestos en la superficie para permitir la purificación mediante cromatografía de afinidad Ni2+ . Cultivar células en 1 L de medio LB-Miller suplementado con 100 μg/mL de ampicilina a 37 °C hasta un diámetro exteriorde 600 de 0,6. Induce la expresión de Hfq añadiendo IPTG a una concentración final de 1 mM e incuba durante 4 horas a 37 °C. Extrae las células por centrifugación a 5.000 × g durante 10 minutos, luego vuelve a suspender el pellet en 50 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 250 mMMgCl 2, 1 mM 2-mercaptoetanol, Precaución: el 2-mercaptoetanol es tóxico, manejar en una campana extractora). Lisa las células mediante sonicación sobre hielo usando un ajuste de pulso del 50% del ciclo de trabajo. Aplica tres pulsos de 40-s con intervalos de enfriamiento de 1 minuto sobre hielo entre pulsos. Centrifuga el lisado a 27.000 × g durante 20 minutos a 4 °C. Calienta el sobrenadante a 85 °C durante 45 minutos y luego centrifuga de nuevo bajo las mismas condiciones. Tratar el sobrenadante resultante con RNasa A (30 μg/mL) y DNasa I (5 U/mL) durante 1 hora a temperatura ambiente con suaves agitaciones, seguidas de una filtración a través de un filtro de 0,45 μm. Aplicar el lisato clarificado a una columna de cromatografía de afinidad precargada con NiSO4. Lava la columna con tampón (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 0,5 mM 2-mercaptoetanol). Eluir la proteína usando el mismo tampón con una concentración de gradiente lineal de imidazol de 10 mM a 1 M. Agrupar las fracciones que contienen Hfq y cargarlas en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño HiLoad 16/600 Superdex 200 equilibrada con tampón HB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% glicerol). Acciona la columna según las instrucciones del fabricante. Un análisis representativo SDS-PAGE de la purificación de Hfq se muestra en la Figura Suplementaria 1. Concentrar la proteína purificada, si es necesario, utilizando filtros centrífugos (MWCO de 3 kDa). Las alicuotas purificadas de Hfq pueden almacenarse a -80 °C.
Experimentos con moléculas individuales
Pasivación de portaobjetos de cuarzo20
Prepara láminas de cuarzo con cinco agujeros paralelos (0,8 mm de diámetro) perforados cerca de cada borde largo. Coloca las lamas y las cubiertas de cuarzo en un tarro de tinción Hellendahl (portaportalágeros) y sonica en acetona durante 20 minutos (Precaución: la acetona es inflamable y volátil; actúas en una campana extractora). Repite el paso de limpieza usando metanol (Precaución: el metanol es tóxico e inflamable; mango en una campana extractora). Enjuaga bien las láminas con agua y sonica en 1 M KOH durante 1 h (Precaución: KOH es cáustico, lleva guantes y protección ocular). Enjuaga las láminas con agua y luego sonica secuencialmente con acetona y metanol durante 20 minutos cada una. Repite la limpieza de KOH usando 5 M KOH durante 1 hora, seguida de un enjuague con agua a fondo (Precaución: Manipula el KOH concentrado con el equipo de protección adecuado). Seca al aire los toboganes. Prepara un juego limpio de tarros de tinción Hellendahl y enjuágalos con hexano (Precaución: el hexano es altamente inflamable; manéchalos en una campana extractora), y luego déjalos secar al aire. Coloca las láminas en el portaobjetos y enjuaga las láminas dos veces con hexano. Añade 75 mL de hexano al portaobjetos e inyecta cuidadosamente 50 μL de diclorodimetilsilano (DMDCS) bajo la superficie del hexano (NOTA: evita exponer el DMDCS al aire). Incuba los tobogáns con un suave balanceo durante 1,5 horas. Enjuaga y sonica las láminas en hexano durante 1 minuto y repite este paso tres veces para eliminar el DMDC residual. Seque al aire las láminas y sellalas al vacío en tubos de 50 mL (por ejemplo, Falcon o tubos cónicos). Las láminas preparadas pueden almacenarse a −20 °C hasta su uso posterior.
Montaje y funcionalización de canales de flujo
Se puede montar un canal de flujo sencillo usando una lámina de cuarzo, llazo de vidrio, cinta adhesiva de doble cara, puntas de pipeta y resina epoxi. Aplica tiras finas de cinta adhesiva de doble cara entre los orificios del deslizador de cuarzo y coloca la cubierta encima. Sella los bordes más largos con epoxi. Corta aproximadamente segmentos de 5 mm de la punta de una pipeta (tanto la punta estrecha como la de collar más ancho) e inserta uno en un agujero para servir de salida y el otro en un orificio paralelo para formar un depósito de entrada. Asegura ambos con epoxi. El depósito de entrada debe retener líquido sin fugas antes de la inyección. Para extraer soluciones a través del canal, conecta el tubo de una jeringuilla de 1 mL a la salida.
Pretrata los canales secuencialmente con los siguientes reactivos para funcionalizar la superficie: BSA biotinilada (0,2 mg/mL) durante 5 minutos, Tween-20 (0,2%) durante 10 minutos y NeutrAvidina (0,1 mg/mL) durante 1 minuto. Aproximadamente 100 μL de cada solución son suficientes por canal. Evita extraer más líquido del que hay en el depósito de entrada, ya que esto introducirá aire en el canal y generará burbujas. Deja un pequeño volumen de solución en el depósito entre pasos para evitar que el canal se seque. Enjuaga a fondo con 1× tampón TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) entre cada paso. Este tratamiento establece una superficie de biotina-NeutrAvidina para la inmovilización de ARN.
Preparar dúplexes de ARNm-conexión inmediatamente antes de la inmovilización mezclando ARNm de 40 nM con un ADN marcado con Cy5 biotinilado de 20 nM. Desnaturalizar la mezcla a 75 °C durante 5 minutos en un tampón de 1× TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), luego rehacer a 37 °C durante 15 minutos y equilibrarla a 20 °C.
Diluir la muestra 50 veces en un tampón de imagen (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico, octetilenoglicol monododecil éter al 0,01%, 0,8% glucosa, inhibidor de RNasa de 2 U/mL) e inyectarlo en el canal de flujo para inmovilizar los ARNm. Incubar durante 1 minuto, luego lavar con tampón de imagen complementado con un sistema de absorción de oxígeno (165 U/mL glucosa oxidasa y 2170 U/mL catalasa) para reducir el fotoblanqueamiento.
Preparar complejos ARNs-Hfq mezclando los componentes en una proporción 1:1 hasta una concentración final de 250 nM en un tampón TNK 1× e incubar durante 5-15 minutos a temperatura ambiente. Diluir los complejos 50 veces en el buffer de imagen que contiene el sistema de absorción de oxígeno e inyectarlos en el canal de flujo inmediatamente antes de la imagen.
Adquisición de datos de molécula única
Instala el microscopio de fluorescencia interna total de reflexión (TIRF) basado en prismas encendiendo la cámara EMCCD y los láseres. Monta el portaobjetos preparado con canales de flujo ensamblados en el escenario del microscopio y coloca el prisma encima. Utiliza un solo software (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) para adquirir datos. En el software, determina el nivel de fondo seleccionando AutoEscala y copia el valor obtenido en el campo de Segundo plano. Ajusta la tasa de frames de adquisición a 100 ms. Excite Alexa Fluor 555 o Cy3 usando un láser de 532 nm y Cy5 usando un láser de 633 nm. Recoger emisiones de ambos canales simultáneamente mediante un objetivo de inmersión en agua del 60×. Para cada película, comienza con diez fotogramas de excitación de 633 nm para localizar los ARNm marcados con Cy5 en el campo de visión. Sigue grabando durante 5 minutos con excitación de 532 nm. Termina la adquisición con 1 s de excitación de 633 nm para verificar el fotoblanqueo Cy5. Esto generará el archivo de película .pma, que puede usarse para análisis.
Análisis de datos de molécula única
Analizar archivos .pma en bruto utilizando scripts IDL personalizados para realizar mapeo de canales donante-aceptor y extraer trayectorias de intensidad de fluorescencia. Primero, graba una película de calibración usando perlas fluorescentes multicolores detectables tanto en el canal donante como en el receptor al excitarse con el láser de 532 nm o 633 nm. Utiliza esta película de calibración para generar un archivo de mapeo que alinee los canales donante y aceptador. Aplicar el archivo de mapeo resultante a todos los registros experimentales para identificar pares donante-aceptor correspondientes, detectar puntos fluorescentes y exportar trazas de tiempo de intensidad para análisis posterior de FRET. Se proporcionan instrucciones detalladas paso a paso junto con el script (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).
Trazas de intensidad de proceso en MATLAB usando el script s_tr_E.m. Inicia el script e introduce el directorio que contiene los archivos .traces y .pks, seguido del índice del archivo y la resolución temporal. Selecciona la ventana de marco que se usa para identificar el punto cuando se le pida. El guion muestra entonces las intensidades del donante y del aceptor por cada punto. Navega entre moléculas usando comandos de teclado (b para retroceder, g para saltar a una molécula especificada). Define las líneas base del donante y aceptor (k) y corrige la fuga (l) haciendo clic en los gráficos cuando sea necesario. Guarda las trazas aceptadas individualmente como archivos .dat que contienen la intensidad de tiempo, donante y aceptor pulsando s. Utiliza los archivos exportados para análisis cuantitativo aguas abajo.
Utiliza el programa de localizador de picos para analizar trazas individuales de smFRET y extraer eventos de unión para cuantificación, incluyendo análisis de tiempo de permanencia y distribuciones de estados FRET. Inicia el programa y abre la carpeta que contiene los archivos de traza .dat exportados usando el menú Archivo. Establece los valores de referencia y los valores de fuga de donante a aceptor determinados previamente usando el script MATLAB. A continuación, establece los umbrales de intensidad para guiar la detección automática de picos de modo que todos los eventos de enlace verificados visualmente estén por encima de los valores seleccionados. Si el ruido hace que un solo evento se divida en varios picos, combínalos manualmente usando la función de fusión incorporada. Haz clic en Guardar picos para exportar los eventos detectados como archivos .csv que contienen la hora de inicio, la hora de finalización y la eficiencia media del FRET para cada evento. Los archivos de salida se guardan en el directorio peaks, mientras que los valores de FRET resueltos por trama para cada evento se escriben en el directorio peak-fret. La eficiencia del FRET se calcula dividiendo la intensidad de fluorescencia del aceptor por la suma de las intensidades donante y aceptor, utilizando valores corregidos para la fuga de fondo y donante hacia el canal aceptor. Inspeccionar manualmente las trazas para detectar fotoblanqueo Cy5, identificado por una disminución abrupta de la eficiencia del FRET acompañada de un aumento de la intensidad Cy3. Cuando ocurre el fotoblanqueo, se supone que la unión persiste mientras la fluorescencia de Cy3 siga siendo detectable, y corrige las duraciones de pico editando los archivos de .csv correspondientes.
Importar valores de eficiencia FRET resueltos por trama desde los archivos de pis-trastes a GraphPad Prism. Genera histogramas de FRET usando la función de distribución de frecuencia y ajusta las distribuciones con modelos gaussianos para identificar la población dominante de FRET.
Determina los tiempos de permanencia de los eventos individuales de vinculación restando asociación de los puntos de tiempo de disociación usando una hoja de cálculo. Calcula la fracción de eventos transitorios (<10 s) para cada repetición experimental. Se realizaron análisis estadísticos en GraphPad Prism. Las comparaciones entre dos condiciones se evaluaron usando pruebas t no emparejadas, y las comparaciones entre tres o más condiciones se analizaron usando ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey.
Resultados
La longitud semilla establece el régimen dinámico del emparejamiento ARNs-ARNm
Establecimos un ensayo mínimo de molécula única para probar cómo las características de secuencia gobiernan el recocido mediado por Hfq. Los ARN modelo se diseñaron siguiendo las arquitecturas previamente descritas de pares de ARNs-mRNA dependientes deHfq 16,17 y llevaban un motivo de unión a Hfq rico en adenosina en el ARNm y un sitio de unión en borde rico en uridina en el ARNsn (Figura 1A). El ARNss fue marcado con Alexa Fluor 555 (donante) en el extremo 5ʹ y el cable ARNm-ADN con Cy5 (aceptor), permitiendo la detección de proximidad inducida por emparejamiento de bases mediante FRET.
Variar la complementariedad de la semilla de 4, 5, 8 a 10 pb produjo comportamientos dinámicos distintos. Con una semilla de 4 puntos bases, las interacciones fueron predominantemente transitorias y mostraron eficiencias heterogéneas en los FRET, lo que sugiere un pareamiento de bases incompleto (Figura 1B-D). En cambio, las semillas de 8 y 10 pb produjeron dúplex estables que a menudo persistían durante la ventana de observación (Figura 1C). Las interacciones produjeron el esperado estado de alto FRET (FRET E ≈ 0,79-0,80, Figura 1D), consistente con el apareamiento completo de bases entre ARN. Una semilla de 5 pb produjo eventos de unión de corta duración pero bien definidos (FRET E ≈ 0,66), proporcionando un rango dinámico viable para modificaciones posteriores en la secuencia de ARN (Figura 1B-D). Por ello, utilizamos complementariedad de 5 puntos básicos para todas las pruebas posteriores.
Motivos de unión a Hfq más fuertes aumentan la estabilidad del complejo ARNs-mRNA
A continuación preguntamos cómo la resistencia de la unión a Hfq modula las vidas útiles de la unión a una complementariedad fija de 5 puntos bases. Extender el motivo del ARNm de AAN4 a AAN6 aumentó significativamente la probabilidad de formar complejos estables (p < 0,001). Las vidas medias aumentaron de 7,5 s a 18 s, y la proporción de eventos inestables < 10 s disminuyó de 80 ± 2% a 68,3 ± 2,9% (Figura 2A-C).
Luego probamos el efecto del motivo de unión a Hfq sobre el ARNs. Acortar el sitio de unión al borde de UUAUUUUUUU a CUUC (sRNA-SR, "borde corto") produjo interacciones altamente inestables (vida media de 1,9 s con AAN4), y fortalecer el motivo del ARNm en ese contexto tuvo solo un efecto modesto (media 3,0 s con AAN6, no significativa, Figura 2B,C). Así, ambos socios contribuyen a la estabilidad del complejo producido, pero los contactos débiles ARNs-Hfq limitan las ganancias de un motivo de ARNm más fuerte.
Un espaciador entre los sitios Hfq y semilla en el ARNm favorece complejos de mayor duración
Hfq puede permanecer unido a la región AAN mientras utiliza su superficie de borde para facilitar la búsqueda del sitio óptimo de emparejamiento deARNsS 16. Esta propiedad sugería que un espaciamiento adicional entre las dos regiones de unión del ARNm podría influir en la estabilidad de la interacción.
Para probar esto, introdujimos un espaciador monocatenario de 15 nts entre los sitios de unión a Hfq y ARNss (N15). Esta modificación aumentó significativamente la vida útil de los eventos de recocido estable de 7,5 s (AAN4) a 47 s (AAN4-N15) (p < 0,01) (Figura 3A,B). El porcentaje de eventos de unión que duraron menos de 10 s también disminuyó del 80 ± 2% a 44 ± 6% (Figura 3C). Estos datos indican que una mayor flexibilidad entre módulos de unión puede estabilizar intermediarios de recocido y promover dúplex de mayor duración.
DISPONIBILIDAD DE DATOS:
Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio, incluyendo trayectorias FRET de molécula única, conjuntos de datos procesados y scripts de análisis, están disponibles públicamente en el repositorio de datos Mendeley en: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Figura 1: Efecto de la complementariedad ARNs-ARNm en la eficiencia de unión. (A) ensayo smFRET para el recocido de ARNs-mRNA. El emparejamiento de bases entre el ARNsn marcado con Alexa Fluor 555 y el complejo de ancla mRNA-Cy5-ADN inmovilizado produce una señal de fretación alta. Los ARNm modelo contienen un sitio de unión a Hfq (AAC)4 (azul) y un sitio de unión a ARNss (S5, rojo), seguidos de cinco nucleótidos y la región híbrida ARN-ADN. Los ARNss incluyen un sitio de unión al borde (naranja). Los paneles en (B-D) se agrupan según la condición experimental (longitud de la semilla). (B) Evento representativo de unión al ARNsM en una sola molécula de ARNm. Se muestran trazas de intensidad de fluorescencia de ARNssN marcado con Alexa Fluor 555 (donador, verde) y del cable de ADN Cy5 (aceptor, rojo). Cy5 se emocionó directamente durante el primer y último diez fotogramas de la grabación. (C) Rastergramas que representan 50 moléculas representativas de ARNm unidas por ARNs-Hfq. Cada barra horizontal representa una única interacción ARNs-ARNm. (D) Histogramas de eficiencias FRET para interacciones entre ARNm y ARNss que contienen regiones complementarias de 4 pb (N = 416 ARNm), 5 pbs (N = 513 ARNm), 8 pbs (N = 191 ARNm) o 10 pbs (N = 105 ARNm). Las eficiencias FRET se calcularon a partir de las intensidades de donante y aceptador corregidas por la línea base y fugas para eventos individuales de unión en intervalos de 0,1 s. Los ajustes gaussianos (azul) indican la población dominante de FRET y no se utilizaron para calcular valores de E_FRET. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 2: Efecto de la longitud del motivo de unión a Hfq en las interacciones ARNs-mRNA. La región de emparejamiento de bases en todas las variantes tiene una longitud de 5 puntos base. (A) Rastergramas que muestran 50 ARNm representativos unidos por complejos ARNs-Hfq. Cada barra horizontal representa una única interacción. Los diagramas de caricaturas anteriores ilustran los diseños de ARN correspondientes con cambios en el número de repeticiones (AAC) en el ARNm y la longitud de la región de unión al borde en el ARNsn (SR = "borde corto"). Coloreando como en la Figura 1A. (B) Diagramas de dispersión de la vida útil de unión a ARNs-mRNA. Cada punto representa un único evento de vinculación. Vidas medias (línea horizontal roja): 7,5 s para ARNm-AAN4 + ARNs-st (N = 188 ARNm), 18 s para ARNm-AAN6 + ARNss-st (N = 142 ARNm), 1,9 s para ARNm-AAN4 + ARNss-SR (N = 85 ARNm), y 3 s para ARNm-AAN6 + ARNs-sr (N = 149 ARNm). (C) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de eventos de unión menores a 10 s. Las barras de error representan la desviación estándar respecto a dos conjuntos de datos independientes. Análisis estadístico mediante ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey para comparaciones múltiples. p < 0,001, ****p < 0,0001; Ns, no es significativo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: Efecto de la longitud del espaciador entre los sitios de unión a Hfq y ARNss sobre las interacciones ARNs-ARNm. La región de emparejamiento de bases en todas las variantes tiene una longitud de 5 puntos base. (A) Rastergramas que muestran 50 ARNm representativos unidos por el complejo ARNs-Hfq. Cada barra horizontal representa un único evento de encuadernación. Los diagramas de dibujos animados anteriores ilustran el diseño correspondiente de ARN. N15 = 15 nt espaciador de secuencia aleatoria. Coloreando como en la Figura 1A. (B) Diagramas de dispersión de la vida útil de unión a ARNs-mRNA. Cada punto representa un único evento de vinculación. Vidas medias (línea horizontal roja): 7,5 s para ARNm-AAN4 + ARNs-s-(ARNs-m) y 47 s para ARNm-AAN4-N15 + ARNs-sRNA (N = 289 ARNm). (C) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de eventos de unión menores a 10 s. Las barras de error representan la desviación estándar respecto a dos conjuntos de datos independientes. Análisis estadístico mediante la prueba t no emparejada. **p < 0,01. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura suplementaria 1: Purificación de E. coli Hfq. Análisis SDS-PAGE de la expresión y purificación de Hfq. (Arriba) Muestras recogidas durante la purificación en una columna de afinidad Ni2+ (HiTrap), incluyendo antes de la inducción, después de la inducción, pellet, lisado, carga, flujo directo, fracciones de lavado y fracciones pico eluidas. (Abajo) SDS-PAGE de fracciones pico tras cromatografía de exclusión por tamaño en una columna HiLoad 16/600 Superdex 200. Se indican formas monoméricas (~11 kDa) y hexaméricas (~66 kDa) de Hfq. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
Este estudio establece un ensayo mínimo de molécula única para diseccionar cómo características específicas de secuencias de ARN determinan la eficiencia del recocido mediado por Hfq ARNm. Variando la longitud semilla, la resistencia de los motivos de unión a Hfq y el espaciamiento entre módulos de unión, cuantificamos directamente cómo cada parámetro contribuye a la estabilidad dúplex a resolución de molécula única. A diferencia de las mediciones de conjunto, que informan de efectos promediados por población, este enfoque resuelve directamente los eventos de unión y disociación individuales, permitiendo medir la heterogeneidad cinética y las interacciones transitorias. Nuestros resultados muestran que incluso las regiones cortas de semillas pueden activarse de forma transitoria, mientras que las semillas más largas producen dúplex estables con vidas prolongadas. Estos hallazgos son consistentes con datos previos in vivo y de conjunto que demuestran que las regiones naturales de semilla en ARNs bacterianos suelen abarcar entre 6 y 12 nucleótidos y rara vez forman dúplexes completamentecomplementarios 21,22,23.
También descubrimos que tanto los motivos de unión Hfq del ARNm como del ARNs-sM influyen fuertemente en la estabilidad dúplex. Extender el motivo AAN en el ARNm aumentaba la vida útil de la unión, mientras que acortar el sitio de unión en el borde del ARNsn los desestabilizaba notablemente. Esto apoya un modelo cooperativo en el que la cara distal de Hfq ancla los motivos de ARNm ricos en adenosina, y el borde recluta ARNs ricos en uridina para promover una alineación eficiente de regionescomplementarias 9,17. A diferencia de los ensayos genéticos o basados en reporteros, que normalmente solo detectan resultados regulatorios productivos, este sistema separa cuantitativamente la estabilidad de unión de los efectos posteriores, permitiendo la comparación directa de cómo las características individuales de la secuencia modulan la vida útil de la interacción física. Un motivo fuerte de unión en el borde es especialmente importante cuando se requieren reordenamientos estructurales para el emparejamiento ARNs-m, ya que mejora la retención de ARN en Hfq17. También se cree que el borde favorece el escaneo lateral de ARNm por los complejos ARNs-Hfq16, una propiedad que puede ser especialmente importante cuando los sitios objetivo están alejados de la región de unión a Hfq. Nuestros resultados con un espaciador de 15 nts entre los sitios de unión apoyan esta visión, mostrando que una flexibilidad adicional entre el motivo semilla y Hfq mejora la estabilidad de emparejamiento, posiblemente reduciendo las restricciones estéricas durante el intercambio de hebras.
Más allá de los sistemas naturales, los resultados son relevantes para el diseño de ARNs sintéticos o modificados. La mayoría de las estrategias de diseño existentes se centran en optimizar una región semilla o un andamiajegeneral 23,24,25, pero nuestros datos destacan determinantes adicionales como el espaciado entre el motivo de unión Hfq y la región objetivo. Dado que las características de secuencia se introducen de manera controlada y modular, el ensayo proporciona un marco experimental sistemático para probar las reglas de diseño. Este principio podría guiar la futura construcción de ARNs artificiales con una mayor eficiencia regulatoria.
Aunque el enfoque permite el análisis cuantitativo y reproducible de las interacciones ARN-ARN, también presenta limitaciones. El ensayo investiga regiones totalmente complementarias, mientras que la mayoría de las interacciones fisiológicas ARNs-mRN contienen desajustes y protuberancias que pueden afectar el reconocimiento y la regulación. El método mide la vida útil de unión al ARNm, pero no aborda directamente los resultados regulatorios posteriores, como la inhibición de la traducción o la desintegración del ARNm. Las adaptaciones futuras de este ensayo podrían incorporar regiones de semillas desajustadas, contenido variado de GC, o ribosomas y degradosomas para investigar sistemáticamente cómo estos factores moldean la cinética de unión.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés.
Agradecimientos
Agradecemos a la profesora Sarah Woodson por facilitar el acceso a la instrumentación de molécula única. Este estudio fue financiado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia (2022/46/E/NZ1/00462 a EMM) y una subvención para instalación de EMBO (IG 5730-2024 a EMM).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 & mu; Filtro m | Millipore | HABG04700 | |
| columna Hi-Trap de 5 mL | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Acetona | Merck | 270725 | Grado HPLC |
| Solución de acrilamida:bis-acrilamida | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 éster succinimidil del NHS | Thermo Fischer | A20009 | |
| Filtros centrífugos Amicon Ultra (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Cloruro de amonio | Merck | 1330-500G | |
| Ampicilina | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| Beta-mercaptoetanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Columnas de biospin con bio-gel P-30 | Bio Rad | 7326231 | Para purificar ARN marcado |
| Catalase | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Éster de HNS Cy3 | Cytiva | PA13105 | |
| Éster succinimidil del NHS Cy5 | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| Diclorodimetilsilano | Merck | 440272 | |
| Oligómeros de ADN (vínculo) un enlace amino 5&prime C6 | Termociencia | N/D | |
| Dnase I | Termo Científica | 18047019 | |
| EDC | Termociencia | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| Cámara EMCCD | Andor | ||
| Etanol | Merck | 1085430250 | |
| Glucosa | Merck | D9434-1KG | |
| Glucosa oxidasa | Merck | G2133-50KU | |
| Glicerol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| Hcl | Merck | 1.00318 | |
| Hexano | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| Columna de exclusión de tamaño HiLoad 16/60 Superdex 200 | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Cloruro de magensio | Merck | M8266-1KG | |
| Metanol | Merck | 34885-M | Grado HPLC |
| Neutravidina | Thermo Fischer | 31000 | |
| Sulfato de níquel | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Q5 Polimerasa | NEB | M0491S | Utilizado para la producción de plantilla de transcripción in vitro |
| RNasa A | Termociencia | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Acetato de sodio | Merck | S7545-100G | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Espermidina | Merck Life Science | S2626 | |
| Tris Base | Termo Científica | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| Urea | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
Referencias
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).