Un flujo de trabajo para imágenes en vivo y análisis cuantitativo de redes de microtúbulos acentrosomales en ovocitos de Drosophila

Summary

Aquí presentamos un protocolo que combina imágenes en vivo con herramientas de análisis automatizadas para analizar la dinámica de microtúbulos en el ovocito de Drosophila . Este flujo de trabajo permite una medición eficiente y reproducible del comportamiento de los microtúbulos, incluyendo crecimiento, orientación, velocidad y organización espacial, y puede adaptarse a otros tipos celulares al optimizarse.

Abstract

El citoesqueleto de microtúbulos (MT) es esencial para muchas funciones celulares, incluyendo la forma celular, la polaridad, la migración y la división. Aunque los centrosomas funcionan como el principal centro organizador de MT (MTOC) en las células animales en divisione, muchas células diferenciadas, incluidos los ovocitos de Drosophila , dependen de vías acentrosómicas para ensamblar redes MT. En contraste con el amplio conocimiento de la organización de la MT en células proliferantes, se sabe poco sobre cómo se ensamblan las redes de MT sin centrosomas. Los ovocitos de Drosophila proporcionan un modelo potente para estudiar la organización y dinámica del MT acentrosómico. Sin embargo, su densa red de MT desafía la imagen convencional. La imagen en tiempo real permite la visualización en tiempo real del crecimiento y orientación de la MT, aunque los métodos de análisis estandarizados siguen siendo limitados. Aquí presentamos un protocolo basado en imágenes en vivo para analizar la dinámica del crecimiento de MT en ovocitos de Drosophila utilizando la Proteína de Unión Terminal 1 (EB1)-Proteína Fluorescente Verde (GFP), una proteína de seguimiento de extremo positivo que marca los sitios de polimerización activa de MT. La microscopía confocal Airyscan de alta resolución permite la detección de cometas EB1, mientras que macros personalizados de Fiji y scripts Python proporcionan una cuantificación simplificada y reproducible de la densidad, velocidad, longitud y orientación del cometa. Validamos este método comparando ovocitos de control con aquellos sometidos a una despolimerización MT inducida por frío, así como mutantes de Patronin (CAMSAP en humanos), un estabilizador conservado de extremo menos de MT y un componente central de los centros organizadores de microtúbulos no centrosomales (ncMTOC), como control positivo para la dinámica MT deteriorada. Nuestros análisis revelaron dinámicas de MT específicas de región, incluyendo el enriquecimiento anterior de cometas EB1 y sesgos de orientación característica, y confirmaron la sensibilidad del flujo de trabajo para detectar perturbaciones sutiles en el crecimiento de MT. Este enfoque proporciona un marco fiable y fácil de usar para estudiar el comportamiento de la MT en ovocitos. El protocolo paso a paso permite la investigación de los reguladores de MT en este contexto y puede adaptarse a otros tipos celulares diferenciados, como neuronas y células epiteliales, con la optimización adecuada. De forma más amplia, apoya estudios mecanicistas y cribados genéticos que examinan cómo las diversas arquitecturas MT subyacen a funciones celulares especializadas.

Introduction

El citoesqueleto del microtúbulo (MT) es un componente esencial de la célula eucariota, desempeñando papeles esenciales en el establecimiento y mantenimiento de la forma, polaridad y división celular. El comportamiento dinámico de los polímeros MT, caracterizado por el crecimiento y la contracción, es crucial para muchos procesos basados en MT ^1,2. El ensamblaje de diferentes matrices de MT depende de la acción combinada de los centros organizadores de microtúbulos (MTOCs), de los cuales se nuclean los MTs, y de la actividad de diversas proteínas reguladoras de MT que controlan la estabilidad, orientación y dinámica de MT ^1,2,3. El MTOC mejor estudiado es el centrosoma, que genera matrices radiales de MTs importantes para regular la forma y polaridad celular en la interfase y para el ensamblaje del huso mitótico en^{la mitosis 4,5}. Sin embargo, al salir o diferenciarse mitóticamente, como en neuronas y células epiteliales, la actividad centrosomal de la MTOC suele estar atenuada y, en casos extremos, como en ovocitos, puede^{eliminarse 6,7}. Esto se asocia frecuentemente con la remodelación específica del citoesqueleto MT por tipo celular, asignando la función de MTOC a otros sitios^{celulares 2,3,8}, comúnmente denominados MTOCs no centrosómicos (ncMTOCs). Aunque se ha avanzado sustancialmente en la organización de la MT en células mitóticas, se sabe relativamente poco sobre cómo se nuclean, estabilizan y disposicionan espacialmente las MT en células animales que salen de la mitosis o que están en proceso^{de diferenciación 2}. Cabe destacar que, en los organismos vivos, la mayoría de las células no se dividen; Han salido del ciclo celular y/o se han diferenciado. Por lo tanto, es fundamental entender cómo se ensambla y regula el citoesqueleto de MT en estos contextos. Este conocimiento es esencial para descubrir cómo se establecen arquitecturas de MT distintas para soportar funciones celulares especializadas.

El ovocito de Drosophila melanogaster proporciona un sistema potente para estudiar la organización y función de la MT acentrosómica. En las etapas intermedias de la oogénesis, la actividad del centrosoma se^{atenua 9}, y los MTs se generan a partir de ncMTOCs localizados en la corteza anterolateral del ovocito (Figura 1B). Esta red MT es esencial para la localización de ARNm, proteínas y orgánulos maternos, que a su vez son fundamentales para el establecimiento de los futuros ejes embrionarios y^{su desarrollo 10,11}. Trabajos previos mostraron que los ncMTOCs del ovocito están compuestos por la proteína MT de extremo negativo Patronina, que forma un complejo con la proteína espectrraplakina Shot, anclada al citoesqueleto cortical de actina. Se propuso que los MTs crezcan a partir de fragmentos cortos de MT generados por la corte de enzimas como la katanina, que pueden actuar como semillas para una posterior polimerización^{de MT 12}. Mecanismos similares se han propuesto en otras células diferenciadas, como las^{neuronas 13}, donde la actividad centrosómica se reduce. Sin embargo, los mecanismos mediante los cuales el corte genera redes MT complejas, como en el ovocito, siguen siendo poco comprendidos. Aún no está claro si los MTs en estos contextos se forman principalmente mediante reordenamientos basados en el corte o mediante una combinación de separación y nucleación de MT de novo. La complejidad de la red de MT de ovocitos la convierte en un sistema ideal para estudiar cómo se generan y organizan las MT fuera del conocido contexto centrosómico. Cabe destacar que esto también supone un reto para la imagen y el análisis: la red densa de MT dentro del ovocito dificulta la resolución de MT individuales utilizando enfoques convencionales de inmunotinción o imagen^{estática 2,14}.

La imagen en vivo ha mejorado enormemente la capacidad para estudiar redes de MT, ya que permite visualizar en tiempo real los eventos de polimerización de MT, ofreciendo información clave sobre la dinámica y la orientación del crecimiento de MT. Estudios previos han analizado con éxito la dinámica del crecimiento de MT en ovocitos utilizando imágenes en vivo de los marcadores de extremo^positivo 14,15,16. Sin embargo, en muchos casos, los procedimientos de análisis de imágenes utilizados para cuantificar la dinámica de la MT se describen solo brevemente, dependen de implementaciones personalizadas o específicas de laboratorio, o no se hacen públicas, limitando así la reproducibilidad y la adopción más amplia. Nuestro método se basa en estos enfoques previos al proporcionar una línea de análisis completamente documentada, abiertamente disponible y fácil de usar que permite la cuantificación estandarizada de los parámetros de crecimiento de la MT a través de conjuntos de datos y condiciones experimentales. En este protocolo, la dinámica de la MT se representa en la mitad de la oogénesis, cuando el citoesqueleto de la MT está organizado por redes MT acentrosomales. Los MTs en crecimiento se visualizan usando EB1-GFP, una proteína de seguimiento de extremos más de^{MT 17,18}, y se adquieren mediante microscopía confocal de escaneo láser con un detector de matriz en modo de alta velocidad. La novedad de nuestro enfoque radica en su análisis de imágenes: una cadena de procesos totalmente documentada, fácil de usar y paso a paso que requiere que los usuarios seleccionen únicamente regiones de interés. El procesamiento y cuantificación de imágenes se facilitan mediante macros Fiji personalizados y scripts en Python, lo que permite la detección eficiente y reproducible de cometas EB1 y la extracción de parámetros, incluyendo la orientación de crecimiento, la velocidad y la organización espacial. Este marco proporciona una herramienta estandarizada y accesible para comparar la dinámica de la MT entre condiciones experimentales.

En este manuscrito, aplicamos este método para comparar el crecimiento de MT en ovocitos de control y en ovocitos despolimerizados mediante tratamiento en frío. Esto sirve tanto para validar el protocolo como para apoyar futuros estudios destinados a diseccionar el papel de las proteínas candidatas en la regulación de la MT.

Protocol

1. Genética de las moscas

NOTA: Para visualizar los MTs en el ovocito, este protocolo utiliza un transgen disponible públicamente (Tabla de Materiales) que expresa la proteína de seguimiento plus-end MT EB1 marcada con una etiqueta GFP (Proteína Fluorescente Verde^{) 19}. EB1-GFP se une específicamente a los MTs en crecimiento más los extremos, apareciendo como "cometas" fluorescentes que se mueven en la dirección de^{polimerización 17,18}. Esto permite la visualización y cuantificación de la dinámica de crecimiento de MT, incluyendo la orientación de crecimiento, la velocidad y la distribución espacial dentro del^{ovocito 14,20}.

1. Mantener todas las cepas de mosca en medio estándar de harina de maíz y agar a 25 °C utilizando técnicas estándar de manejo de Drosophila .
2. Cruzar 8–12 moscas vírgenes portadoras de un transgen UAS-RNAi dirigido a la expresión de una proteína de interés, con 5 machos del genotipo matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   NOTA: Para simplificar los cruces genéticos, genera un stock de moscas cruzando la línea V32-Gal4 (inserción en el segundo cromosoma) con la línea EB1-GFP (inserción en el tercer cromosoma). Dado que EB1-GFP está bajo el control de un promotor de UASp, el controlador V32-Gal4 induce la expresión de EB1-GFP así como de cualquier transgen UAS-RNAi introducido en cruces posteriores si se desea.
3. Tras la eclosión de la descendencia F1, se seleccionan entre 10 y 15 moscas hembras del genotipo deseado (menos de una semana de edad).
4. Transfiere a las hembras, junto con 2–3 machos, a un vial fresco que contenga una pequeña cantidad de pasta de levadura en la superficie del alimento. La pasta de levadura estimula la oogénesis y promueve la progresión del desarrollo de la cámara de huevos. La presencia de machos asegura el apareamiento, lo que también favorece la maduración de los ovocitos y la puesta de huevos. Mantén las moscas a 25 °C durante 2 días.
   NOTA: Para investigar el papel de genes específicos en la dinámica de la MT, se puede lograr la reducción de proteínas utilizando el sistema UAS/^{GAL4 21}, con el controlador materno público matα4-Gal4-VP16 (también conocido como V32-Gal4; Tabla de materiales), que inicia la expresión de Gal4 en la línea germinal a partir de los estados 3–4 de la oogénesis. Como se ha descrito anteriormente, este impulsor induce la expresión de EB1-GFP así como de constructos de UAS-RNAi, permitiendo el agotamiento de proteínas de interés solo después de la etapa germinaria. Esta estrategia evita las funciones iniciales potenciales de las proteínas objetivo durante las divisiones mitóticas iniciales y la especificación de ovocitos. Al realizar estos experimentos, las moscas deben prepararse tal y como se ha descrito anteriormente.

2. Disección de ovarios

1. Anestesiar a las hembras F1 usando CO₂ en una almohadilla estándar y seleccionar una hembra para la disección.
2. Transfiere la hembra seleccionada directamente a un plato de fondo de cristal de 35 mm (con un grosor de vidrio de 0,13–0,15 mm) y coloque una gota de aceite de imagen sobre la mosca.
3. Coloca la bragueta mirando hacia arriba con el ventral (alas hacia abajo). Con una pinza, sujeta suavemente la parte baja del tórax con unas pinzas y, con una segunda pinza, pellizca un poco la cutícula abdominal desde la parte posterior del abdomen.
4. Extrae suavemente el tracto reproductor tirándolo con cuidado por la abertura.
5. Aísla los ovarios y luego los ovulos individuales deslizándolos suavemente por el aceite con las pinzas. Al manipular los ovarios, mantenlos siempre junto a las cámaras óvulas más antiguas (etapas 13–14) para evitar dañar las etapas medias más frágiles (etapas 6–9), que son las de interés para la imagen (Figuras 1A,B).
6. Agarra la punta anterior del ovario, donde se encuentran el germarium y las cámaras de óvulos en fase temprana (Figura 1A,B). Aplica una tensión lenta y constante para separar los ovarios individuales. Al tirar, aparecerán cámaras de huevos en distintas etapas del desarrollo. Este proceso puede repetirse varias veces por ovario para aislar ovulos^{adicionales 22} (ver vídeo para demostración).
   NOTA: Para ovocitos sometidos a tratamiento en frío para despolimerizar la MT, se realizaron disecciones como se describió anteriormente, pero utilizando tampón BRB-80 en lugar de aceite de imagen. Los ovarios diseccionados se transfirieron luego a microtubos que contenían BRB-80 e incubaron sobre hielo durante 15^{minutos y 23} minutos. Tras la incubación, los ovarios se transfirieron a una placa de fondo de cristal con aceite de imagen, y el protocolo se reanudó desde el paso 3.1.

3. Imagen en vivo

1. Coloca el plato de fondo de cristal en el escenario del microscopio usando el portaláminas adecuado.
2. Selecciona cámaras de óvulos de estadio 7 u 8 para la imagen.
   NOTA: Las cámaras de huevos en estas etapas pueden identificarse en función del tamaño del ovocito y la posición nuclear. El ovocito es claramente más grande que las células de nodriza individuales y ocupa aproximadamente un tercio (estadio 7) a la mitad (estadio 8) de la cámara del huevo. El núcleo del ovocito se sitúa en la corteza anterior del ovocito, junto a las células^{nodritas 24}.
3. Evita las cámaras de óvulos que muestren discontinuidad en la capa de células foliculares externas u otros signos de daño que puedan indicar una alteración mecánica causada por las pinzas. Para una calidad óptima de imagen, utiliza un sistema de imagen confocal rápido con una alta relación señal-ruido (SNR) y un objetivo de 63x (1,40 NA, inmersión en aceite). Asegúrate de seguir los criterios de muestreo de Nyquist-Shannon.
4. Ajusta el enfoque y determina la exposición adecuada, ya que puede variar según la estructura EB1 utilizada (por ejemplo, diferentes promotores o etiquetas fluorescentes) y el sistema de microscopio. La señal debe ser lo suficientemente brillante para seguir la dinámica de los cometas, pero no saturada ni obstruida por la fluorescencia de fondo.
5. Configura el láser de 488 nm para excitar el fluoróforo GFP (10% de potencia láser; ganancia del detector = 750 V). Seleccione una ventana de emisión adecuada de 500–550 nm o un conjunto de filtros equivalente para el fluoróforo GFP.
6. Adquiere películas en time-lapse de al menos 4 minutos de duración, utilizando un intervalo de fotogramas de 500 ms (2 fotogramas/s) para obtener datos suficientes para seguir los MT individuales más los finales. (El Vídeo Suplementario 1 ilustra una adquisición representativa en time-lapse adecuada para análisis posteriores de seguimiento de MT).
7. Procesa las imágenes adquiridas utilizando el procesamiento de detectores de matriz en el software de adquisición del microscopio con la fuerza de filtro de procesamiento predeterminada.
   NOTA: Una vez sumergidos en aceite de imagen, los ovarios diseccionados permanecen viables hasta 90 minutos. Durante este periodo, las cámaras de huevos pueden ser visualizadas sin signos significativos de degeneración. Tras este periodo, se debe diseccionar una nueva hembra y preparar las cámaras de huevos frescos para la imagen²⁰.

4. Procesamiento de imágenes

Realiza el siguiente flujo de trabajo para generar gráficos y estadísticas que cuantifiquen varios parámetros asociados con la dinámica de la MT. Ejecuta cada paso automáticamente mediante una macro/script o manualmente siguiendo el protocolo (Figura 2). Todos los macros Fiji, scripts de seguimiento y código de análisis en Python usados en este flujo de trabajo se proporcionan como Archivos de Codificación Suplementarios 1–7.

1. Preprocesamiento de imagen - PASO 1
   Los siguientes pasos preparan las imágenes en bruto en time-lapse corrigiendo el fotoblanqueo y reduciendo el ruido de fondo, asegurando la estabilidad de la señal para el seguimiento. En primer lugar, la visibilidad de EB1 se mejora mediante un filtro de Diferencia de Gaussas (DoG), que funciona como filtro pasa banda espacial. Al restar una imagen muy borrosa de una imagen ligeramente borrosa, este proceso suprime la neblina citoplasmática de baja frecuencia y el ruido de píxeles de alta frecuencia, al tiempo que aísla la señal limitada por difracción de los cometas EB1. En segundo lugar, se aplica un filtro de gradiente temporal para realzar específicamente las puntas de MT en crecimiento. La pila de imágenes se recorta para asignar la dimensión temporal al eje espacial Y. A continuación, se aplica una convolución 1D con núcleo [-1 0 1] para calcular la derivada temporal de cada píxel, destacando el borde delantero de los cometas en movimiento donde la intensidad aumenta más rápidamente. La pila se vuelve a cortar a sus dimensiones originales, se fusiona en una imagen compuesta y se exporta para su análisis.
   NOTA: Este paso puede ejecutarse en lote para todos los archivos de una carpeta arrastrando el archivo macro File1.Step1_MTs_macro.ijm (Archivo de Codificación Suplementaria 1) en Fiyi y ejecutar la macro.
   1. Instalación previa de plugins (Configuración única)
      1. Lanza Fiji. Navega a Plugins > Instalar en la barra de menús.
      2. En el explorador de archivos, selecciona el archivo File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7) proporcionado con este protocolo.
      3. Cuando te pidan guardar el plugin, asegúrate de que el destino sea la carpeta predeterminada de plugins dentro de tu directorio de instalación de Fiji y haz clic en Guardar.
      4. Reinicia Fiji para completar la instalación.
         NOTA: Esta versión compilada del plugin es idéntica a la versión integrada de Fiji, pero elimina la necesidad de una instalación separada del Java Development Kit (JDK), agilizando el proceso de configuración.
   2. Corrección de lejía y reducción de ruido:
      1. Abre Fiji y luego abre cada archivo usando el plugin de importación Bio-Formats
      2. Compensa la decaída de fluorescencia a lo largo del tiempo ejecutando el plugin de corrección de blanqueador, usando la corrección de lejía de Simple Ratio (fondo = 0).
      3. Ejecuta el Filtro de Pila de Kalman Compilado (acquisition_noise = 0,1; polarización = 0,7) para suprimir el ruido aleatorio de fotones mientras se preserva la verdadera dinámica de la señal a lo largo del tiempo
      4. Recorta la dimensión de tiempo resultante de la imagen para reducir el tiempo de procesamiento, si así lo deseas.
         NOTA: Estos pasos generan una imagen con desruido, que más tarde aparece como canal 1 al final del paso 1 (4.1.5) (Figura 3A). Se recomienda excluir los primeros 5 a 10 fotogramas (puntos de tiempo), ya que la ventana móvil del filtro de Kalman solo filtra parcialmente estos fotogramas iniciales.
   3. Diferencia en la mejora de características de las gaussianas (DoG):
      1. Duplica la imagen de 4.1.2.4 dos veces (haz clic derecho en la imagen y haz clic en Duplicar).
      2. Aplica el plugin Gaussian Blur a una copia usando un sigma bajo (σ = 1).
      3. Aplica el plugin Gaussian Blur a la otra copia usando un sigma alto (σ = 8).
      4. Abre el plugin Image Calculator y resta la imagen de alta sigma de la imagen de baja sigma (= Bajo – Alto) para aislar detalles finos.
      5. Elimina el fondo usando el Math > Subtract de Fiyi y selecciona un valor (umbral DoG = 100) para mantener solo la señal real si es necesario.
         NOTA: Estos pasos generan una imagen de diferencia de Gauss, que más tarde aparece como canal 2 al final del paso 1 (4.1.5) (Figura 3B).
   4. Mejora de señal EB1-GFP:
      1. Selecciona la imagen de la 4.1.2.4 y usa el plugin Reslice con los ajustes: arriba, Sin interpolación.
      2. Utiliza el plugin Convolve 2D con kernel [–1 0 1] para mejorar las puntas de MT.
      3. Usa de nuevo el plugin Reslice con los mismos ajustes para restaurar las dimensiones originales de la imagen.
      4. NOTA: Estos pasos generarán una imagen con una señal EB1-GFP mejorada. Esta imagen aparecerá más adelante como canal 3 al final del paso 1 (4.1.5) (Figura 3C).
      5. Fusionar canales y exportar imagen:
         1. Fusiona la imagen MT EB1-GFP (4.1.2.4) con la imagen Difference of Gaussians (4.1.3.5) y la imagen de mejora de señal EB1-GFP (4.1.4.3) usando el plugin Merge Channels. Asegúrese de que la imagen que se va a utilizar para análisis posteriores se coloque en el Canal 3 durante el proceso de fusión.
         2. Guarda el archivo resultante como un archivo .tif, usando el formato de nombre: "filename"_processed.tif. Asegúrate de que la imagen utilizada para el análisis descendente termine con _processed.tif
2. Regiones de Interés (ROI) - PASO 2
   En este paso, se definirán tres ROI a lo largo del eje anteroposterior del ovocito: anterior (ROI1), medio (ROI2) y posterior (ROI3). Realizar esta segmentación espacial para permitir el análisis de la dinámica de la MT en diferentes regiones del ovocito.
   NOTA: Este Paso 2 puede ejecutarse para cada "nombre de archivo"_processed.tif arrastrando el archivo macro File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Archivo de Codificación Suplementaria 2) a Fiji y pulsando Ejecutar. La macro pedirá al usuario que dibuje manualmente un rectángulo en el ovocito. La región más cercana al inicio del polígono (primer clic) corresponde al primer retorno de inversión. La región rectangular seleccionada se dividirá automáticamente en ROIs rectangulares iguales. Si no se ahorran retornos de inversión, los siguientes pasos se ejecutarán en la imagen completa.
   1. Definición de ROIs:
      1. Abre el archivo destino mediante Plugins → Bio-Formatos → Importador de Bio-Formatos.
      2. Utiliza la herramienta Polígono para dibujar una región de interés que abarque la región deseada.
      3. Añade la región seleccionada al Gestor de ROI (pulsa la tecla T).
      4. Repite el paso 4.2.1 para saber cuántos retornos de inversión necesitas.
   2. Medir y exportar área:
      1. Seleccione el primer retorno de inversión
      2. Ejecuta Analyze → Measure y guarda el valor Area como un archivo llamado: "filename"_processed_RoiArea.csv
         NOTA: El nombre del archivo debe coincidir con el nombre original de la imagen y terminar en: _processed_RoiArea.csv
      3. Usa el ROI Manager para ahorrar los ROIs. Usa el mismo nombre de archivo que el. Extensión del ROI para un único ROI, o la extensión .zip para múltiples ROIs.
3. Detectar y rastrear cometas EB1-GFP - PASO 3
   Utiliza el plugin^{TrackMate 25} para detectar cometas EB1-GFP y rastrear su movimiento a lo largo del tiempo.
   NOTA: STEP 3 puede aplicarse a cada "nombre de archivo"_processed.tif arrastrando el archivo macro File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Archivo de Codificación Suplementaria 3) a Fiji y pulsando EJECUTAR. Luego selecciona una carpeta para procesar. Los ROIs se cargarán automáticamente y el análisis se realizará para cada archivo, generando las correspondientes salidas spot y track. Antes del procesamiento por lotes, se recomienda analizar 2–3 imágenes representativas para verificar visualmente que los ajustes predeterminados del detector y rastreador son apropiados para el tamaño y la dinámica de los cometas. Si los ajustes son adecuados, el usuario puede ajustar los parámetros relevantes para rastrear con precisión las puntas EB1, minimizando así falsos negativos y falsos positivos.
   1. Abre el archivo de destino mediante Plugins → Bio-Formatos → Importador de Bio-Formatos
   2. Abre el plugin TrackMate. Selecciona SÍ si te piden cambiar T y Z.
   3. Selecciona Detector de Log. Ajusta el diámetro de la partícula a 0,5 μm (ajusta según sea necesario)
   4. Establece el umbral de calidad a 30 (ajusta según sea necesario). Activa tanto la localización subpíxel como el preprocesamiento con un filtro mediano.
   5. Elimina cualquier filtrado puntual adicional. Seleccione el método de seguimiento de Kalman
   6. Establece un radio de búsqueda inicial en 0,5, un radio de búsqueda de 0,7 y un espacio máximo de fotograma de 2 (ajustar según sea necesario - El radio inicial de búsqueda sienta el rastreador, el radio de búsqueda controla hasta dónde puede moverse un punto entre fotogramas, y el espacio máximo permite desapariciones cortas en la trayectoria).
   7. Salta el filtrado de pistas que aparecerá. Una vez que la pista esté completa, ve a Spots → Exportar a CSV y nombra el archivo: "filename"_ROI01_spots.csv
   8. NOTA: La denominación de los archivos debe reflejar el número de retornos de inversión analizados. Si se utilizan múltiples retornos de inversión, guarda cada archivo de salida con un identificador correspondiente, como _ROI01, _ROI02, etc.
4. Visualización de datos y análisis cuantitativo - PASO 4
   Utiliza los scripts en Python para procesar los datos de seguimiento y calcular parámetros clave, incluyendo número de cometas, velocidad, vida útil, consistencia angular y orientación. Estos scripts generan tablas resumen (archivos CSV), gráficos y análisis estadísticos para apoyar el análisis cuantitativo de la dinámica de la traducción automática (Figura 4).
   1. Configuración del entorno de software:
      1. Instala la distribución Python (3.12). Asegúrate de que las siguientes librerías externas de Python estén instaladas (a través de pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook): Pandas y NumPy (para manejo de estructuras de datos y cálculo numérico), SciPy y Statsmodels (específicamente scipy.stats, para estadística circular y pruebas de hipótesis), Matplotlib y Seaborn (para generar gráficos de rosas y gráficos de barras estadísticos), IPython (para herramientas de visualización dentro del cuaderno), Cuaderno Jupyter (para usar el cuaderno).
      2. Coloque los módulos de análisis personalizados (File_5_MTModule1.py y File_6_MTModule2.py – Archivos de Codificación Suplementaria 5 y 6) en el directorio raíz junto al cuaderno de análisis (Archivo 4_Step4_MTs_results.ipynb – Archivo de Codificación Suplementario 4).
      3. Abre el cuaderno Jupyter ejecutando el comando "jupyter notebook" en el terminal Python y carga el Archivo 4_Step4_MTs_results.ipynb – Cuaderno Archivo de Codificación Suplementaria 4.
   2. Datos de entrada y definición de parámetros:
      1. Rellena la base de datos para mapear réplicas biológicas a sus metadatos experimentales.
      2. Proporciona lo siguiente para cada experimento: Nombre base: La cadena identificadora única encontrada en los nombres de archivo, Condición: El grupo experimental (por ejemplo, "Control", "Tratado"), Ángulo de corrección: El ángulo necesario para alinear el ROI con el eje biológico (por ejemplo, Anterior = 0°).
      3. Ajusta los parámetros: exporta el formato de imagen y el dpi, grafica los colores y el tamaño predeterminado del bin para cálculos angulares
      4. Configura los parámetros de filtrado de datos para excluir pistas cortas: Longitud mínima de pista: se descartan pistas más cortas que esta duración
   3. Ejecución de la cadena de análisis:
      1. Lee y ejecuta todas las celdas de código para procesar los datos de seguimiento en bruto. El script se itera a través de la lista de la base de datos para realizar los siguientes pasos procedimentales:
         1. Identifica todos los archivos CSV específicos de ROI asociados a cada Nombre Base.
         2. Filtrar las pistas basándose en la longitud mínima (solo se mantienen trayectorias que persistan por más de 3 fotogramas), calcular velocidades instantáneas, calcular el desplazamiento total y aplicar la corrección de ángulo de referencia a todas las trayectorias.
         3. Normaliza el recuento de cometas por el área de retorno de inversión (cargada a partir de metadatos) para calcular la densidad del cometa.
      2. Agrega los datos procesados en un conjunto de datos maestro (df_all) y calcula estadísticas generales resumidas (velocidad media, duración de la pista y longitud del vector de consistencia angular) para cada ROI.
      3. Ejecuta la función make_combined_rose_panel para generar parcelas de rosas agrupadas. Esto crea una comparación de paneles lado a lado de las distribuciones angulares para todos los ROI dentro de cada condición experimental. Ejecuta create_comprehensive_analysis_plots_enhanced para crear gráficos de barras para métricas escalares.
      4. Ejecuta la función run_angle_analysis_pipeline para realizar un análisis de orientación específico:
         1. Clasificar las pistas en contenedores de orientación usando dos estrategias: Binning Cardinal (4 bins de 90° de ancho: Norte/Anterior, Este/Derecha, Sur/Posterior, Oeste/Izquierda) y Binning Anterior/Posterior (2 bins de 180° Anterior vs. Posterior).
         2. Calcula el porcentaje de huellas que se mueven en cada orientación definida por ovocito.
   4. Análisis estadístico y generación de resultados:
      1. Iterar a través de métricas escalares definidas: número medio de cometas por fotograma por área, duración media de la trayectoria del cometa y velocidad media del cometa. Para cada métrica, realiza:
         1. Realizar pruebas de Kruskal-Wallis o Mann-Whitney U para comparaciones independientes entre condiciones experimentales.
         2. Realiza pruebas de Friedman o Wilcoxon para evaluar la consistencia entre los ROIs.
         3. Realizar pruebas de rango por signos de Friedman y Wilcoxon (usando el método Pratt) para evaluar las preferencias de orientación (por ejemplo, Norte vs. Sur) dentro de cada ROI.
         4. Exporta los siguientes resultados al directorio de Resultados : CSVs resumentes (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), Informes estadísticos (por ejemplo, Cometa medio velocity_mwu.csv) y Gráficos (archivos PNG de alta resolución).
            NOTA: El paso 4 solo puede ejecutarse en Python. Abre el File_4_Step4_MTs_results.ipynb y lee y ejecuta todas las celdas. Cada celda contiene instrucciones para la ejecución y el resultado esperado respectivo.

5. Análisis estadístico:

NOTA: Debido a la distribución no gaussiana de los datos de seguimiento, se emplearon pruebas estadísticas no paramétricas para todas las comparaciones.

1. Evalúa diferencias independientes entre condiciones experimentales (por ejemplo, Control vs. Tratadas) utilizando la prueba U de Mann-Whitney (para dos grupos) o la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de comparaciones Mann-Whitney por pares post-hoc (para >2 grupos)).
2. Evalúa las preferencias orientacionales dentro del mismo ROI utilizando la prueba de Friedman (diferencia global) seguida de la prueba Wilcoxon Signed-Rank (por pares).
3. Manejar los lazos de diferencia cero usando el método de Pratt.
4. Informa las comparaciones por pares como valores p no corregidos para preservar el poder estadístico. Utiliza los scripts proporcionados para informar tanto los valores p brutos como los ajustados, con la significación fijada en 0,05. Informa todas las estadísticas resumidas como Media ± Error Estándar de la Media (SEM), salvo que se indique lo contrario).

Results

Este protocolo se utilizó con éxito para analizar la dinámica de crecimiento y la polaridad de MT en ovocitos de Drosophila melanogaster en etapas intermedias de la oogénesis, utilizando EB1-GFP, una proteína de seguimiento final positivo que marca los sitios de polimerización activa de MT^17,18. Cuando se fotografía mediante microscopía confocal de barrido láser, EB1-GFP aparece como "cometas" brillantes y punteados que se mueven en la orientación del crecimiento de MT^17,18 (Figura 3A; Vídeo suplementario 1). El seguimiento y cuantificación de estos cometas permite una evaluación precisa de la nucleación, elongación y organización de los MT dentro del ovocito. Utilizando este protocolo de flujo de trabajo, se evaluaron la dinámica de la MT en ovocitos de control y en ovocitos sometidos a perturbaciones experimentales de la red de MT. Específicamente, el comportamiento del cometa EB1 se comparó en tres condiciones: ovocitos control no tratados, ovocitos control tratados en frío y ovocitos mutantes mutantes deP-atronina tratados en^{frío 12,26}. El tratamiento en frío induce la despolimerización de la MT, permitiendo evaluar la regeneración de la MT durante la recuperación. Se incluyeron ovocitos heterocigotos mutantes dep-atronin (+/patr⁰⁵²⁵²) como control positivo para la dinámica MT deteriorada. La patronina es un estabilizador conservado de MT en extremo^{negativo 27}, y un componente central de los ncMTOCs en los ovocitos¹² y otros^{tejidos 2}. Trabajos previos demostraron que los mutantes de patronina sometidos a despolimerización por MT muestran una disminución significativa en el número de cometas EB1 tras el^{rebrote 12}. Así, incluir mutantes patroninas heterocigotas permitió validar el método frente a un fondo conocido de defectos en regeneración de MT. Los ovocitos en estadios 7-8 se visualizaron cuando los centrosomas se atenuan y los MTs se generan a través de vías acentrosómicas.

En consonancia con observaciones previas, la mayor densidad de cometas EB1 se detectó en la región anterior del ovocito, con una disminución gradual hacia la parte posterior^14,15 (Figura 5B; Tabla 1; Tablas Suplementarias 1 y 2). Para distinguir entre eventos reales de polimerización MT y señales estacionarias o fuera del plano, este protocolo discrimina entre el número total de focos EB1-GFP detectados y el subconjunto de focos que son móviles. La fracción inmóvil probablemente representa cometas estacionarios o cometas que se mueven predominantemente en el plano axial (Figuras 5A,B). Los análisis de la longitud de la trayectoria y la velocidad de crecimiento de la MT se realizaron exclusivamente en los cometas móviles EB1-GFP para evitar la inclusión de señales estacionarias o movimientos axiales que pudieran interferir con la estimación de la longitud y velocidad de la trayectoria. Los focos totales de EB1-GFP y la fracción móvil se presentan en gráficos separados para permitir la comparación directa entre la detección global y el comportamiento dinámico (Figuras 5A,B). En ovocitos control, el protocolo midió 0,189 ± 0,02 cometas móviles EB1 SEM/^{μm 2} (18,9 cometas EB1/100^{μm 2}) en la región anterior, seguido de 0,064 ± 0,02 SEM y 0,043 ± 0,01 cometas móviles EB1/μm² en las regiones media y posterior respectivamente (6,4 y 4,3 cometas EB1/100 μm²) (Figura 5B; Tabla 1; Tablas Suplementarias 1 y 2). Un estudio^{anterior 28} que midió cometas EB1 en la misma etapa de desarrollo detectó 48,54 cometas EB1 por 100μm², lo que es superior a los valores detectados aquí para cometas EB1-GFP móviles. Sin embargo, los valores medidos son consistentes si se tiene en cuenta el número total de cometas EB1-GFP detectados (Figura 5A; Tabla 1; Tablas Suplementarias 1 y 2). La sección de Materiales y Métodos de ese estudio no especifica cuántos pilas z se utilizaron para obtener imágenes de los ovocitos. Por tanto, es posible que se incluyera más de una pila z en el análisis, lo que podría haber contribuido al mayor número de cometas EB1-GFP detectados. Otro factor que puede influir en los valores reportados es la región del ovocito seleccionada para la cuantificación del cometa. Si se hubieran elegido regiones de interés más cerca del polo más anterior, donde la densidad de cometas EB1 es más alta, esto podría haber aumentado la densidad media de cometas en comparación con las mediciones presentadas aquí. No obstante, los resultados obtenidos aquí son del mismo orden de magnitud y reflejan consistentemente una disminución de la densidad de cometas EB1 hacia la región posterior, como se había reportado^{previamente en 14,15}.

Tras la regeneración de MT inducida por frío, los ovocitos de control mostraron números de cometas EB1 comparables a los controles no tratados, lo que indica una recuperación robusta de MT. En contraste, en consonancia con informes^{previos 12}, los mutantes patroninas mostraron una reducción significativa en el número de cometas EB1 móviles en la región anterior (ROI1) en comparación con ambos controles (Figura 5B; Tabla 1; Tablas Suplementarias 1 y 2). Aunque el número de cometas en las regiones media y posterior (ROI 2 y 3) también tendió a bajar, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (Figura 5B). La reducción observada aquí fue menos pronunciada que la reportada en los ensayos basados en^{nocodazol 12}. Esto probablemente refleja el uso de mutantes patroninas heterocigotos en los que solo un alelo está mutado. Además, el protocolo de despolimerización inducida por frío puede no despolimerizar completamente todas las MT, y el intervalo de 5–15 minutos entre la extracción del hielo y la obtención de imágenes probablemente permite cierta nucleación y regeneración de MT antes de la adquisición de datos. En cambio, los ensayos basados en nocodazol se realizan inmediatamente tras la inactivación del colcemid utilizando un microscopio láser^{UV 12}. No obstante, estos resultados demuestran que este protocolo puede detectar alteraciones biológicamente relevantes y específicas de región en la organización de la MT. También se alinean con el enriquecimiento de ncMTOCs y de Patronina, un componente central de ncMTOC, en la parte anterior del ovocito. La reducción más débil del número de cometas en las regiones media y posterior también puede reflejar la exclusión desarrollativa de los ncMTOCs y Patronin de la corteza posterior en estas etapas¹².

El análisis de la longitud de la pista EB1 en los ovocitos de control reveló trayectorias de cometas más largas en la región anterior del ovocito (0,613 μm ± 0,04 SEM) y cometas más cortos en las regiones media y posterior (0,463 μm ± 0,04 SEM y 0,488 μm ± 0,05 SEM, respectivamente) (Figura 5C; Tabla 1; Tablas Suplementarias 1 y 2). Este hallazgo es coherente con datos previos que muestran que las MTs persisten durante menos tiempos en el polo posterior que en el polo anterior, lo que sugiere que las MT en el polo posterior son^{más cortas 14}. En ovocitos mutantes patronina heterocigotos tratados en frío, la longitud del cometa EB1 se redujo significativamente en comparación con los controles tratados en frío en las regiones anterior y posterior. Se observó una tendencia similar no estadísticamente significativa en la región media (Figura 5C; Tabla 1; Tablas suplementarias 1 y 2), sugiriendo una reducción parcial en la estabilidad de la MT. En conjunto, estos resultados apoyan el papel conocido de la Patronina como estabilizador de MT de extremo negativo y son consistentes con observaciones previas en células cultivadas por Drosophila, donde la pérdida de Patronin resulta en husos de MT más^{cortos 12,27}. Estos hallazgos también ponen de manifiesto la sensibilidad de este protocolo para detectar perturbaciones sutiles pero biológicamente significativas en la dinámica de la MT.

Al medir la velocidad del cometa EB1 en ovocitos de control, el análisis detectó velocidades medias de 0,208 ± 0,01 μm/seg, 0,207 ± 0,01 μm/seg y 0,202 ± 0,01 μm/seg en las regiones anterior, media y posterior respectivamente (Figura 5D; Tabla 1; Tablas suplementarias 1 y 2), que es coherente con trabajos anteriores^14,15. Los ovocitos de control mostraron una ligera disminución en la velocidad de crecimiento de la MT desde la región anterior hasta la posterior. Esto puede reflejar el enriquecimiento de ncMTOCs, junto con otras proteínas asociadas a microtúbulos (MAPs) no identificadas, en las regiones anterolaterales, que facilitan el crecimiento y la extensión de MT, contribuyendo así a la disminución posterior observada. En ovocitos tratados en frío, los mutantes heterocigotos de patronina mostraron una tendencia no estadísticamente significativa hacia una ligera reducción en la velocidad de crecimiento de la MT en comparación con los controles, aunque esta diferencia no alcanzó significación estadística (Figura 5D; Tabla 1; Tablas Suplementarias 1 y 2). Este hallazgo es coherente con observaciones previas en células madre neurales de Drosophila que expresan mutantes de^{patronina 29}.

La localización de los NCMTOCs en la región anterolateral del ovocito, junto con su exclusión de la parte posterior, hace que la mayoría de los MT crezcan con sus extremos negativos anclados en la corteza anterolateral. En consecuencia, se establece un gradiente antero-posterior de MTs dentro del ovocito, con un sesgo de orientación moderado: el 60% de los MTs crecen hacia la parte posterior y el 40% hacia los¹⁴ anteriores. Nuestro protocolo detectó con éxito este sesgo en ovocitos de control en todas las regiones del ovocito (Figura 5E). El sesgo en la orientación de la MT fue más pronunciado en la región posterior, como se había reportado^{previamente en 14}. Cabe destacar que este enriquecimiento posterior en el sesgo de orientación se perdió tras el tratamiento en frío en ovocitos mutantes patronina controlados y heterocigotos (Figura 5E,F). En ovocitos control tratados en frío, la orientación de la MT se desplazó hacia un crecimiento dirigido hacia la parte anterior en todas las regiones. Este desplazamiento apareció como una tendencia en las regiones anterior y media y se volvió estadísticamente significativo en la región posterior (Figura 5F). Una posible explicación para esta pérdida de sesgo hacia la parte posterior es que, en condiciones tratadas en frío, los MTs recién polimerizados pueden necesitar tiempo para asociarse con MAPs, como proteínas motoras, que promueven la estabilización y/o el entrecruzamiento de MT. El retraso en el reclutamiento de estos factores podría afectar el refuerzo de las MTs orientadas hacia atrás. En resumen, este protocolo permite un análisis sensible y cuantitativo del crecimiento, longitud, velocidad y orientación del MT dentro de los ovocitos. Detecta de forma fiable cambios específicos de región y biológicamente significativos en la dinámica de la MT, en línea con estudios previos, y demuestra sensibilidad para resolver diferencias sutiles en el comportamiento de la MT, como ilustran las observaciones realizadas en mutantes heterocigotos de lap-atronina.

Figura 1: Oogénesis de Drosophila melanogaster (A) Visión general de la oogénesis en el ovario de Drosophila . Cada ovario contiene entre 12 y 16 ovarios, que funcionan como una línea de producción de óvulos. La oogénesis comienza en el germario, donde 2–3 células madre germinales se dividen asimétricamente, produciendo una célula madre y una célula hija que comienza a diferenciarse. Estas células sufren 4 divisiones mitóticas para formar un quiste de 16 células conectado por canales anulares. A partir de estas células, una se convierte en ovocito, mientras que las demás actúan como células enfermeras, apoyando el crecimiento y desarrollo del ovocito hasta un ovocito de estadio 14 en el extremo posterior. (B) Esquema de la cámara de huevos de Drosophila en etapa 9. Los MTs se generan a partir de ncMTOCs localizados en la corteza anterolateral, que se excluyen del lado posterior del^{ovocito 12}. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Diagrama de flujo de trabajo del protocolo. Visión general de los pasos principales desde la disección de ovarios y la imagen en vivo hasta el seguimiento de cometas y el análisis cuantitativo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas generadas por el procesamiento de ovocitos en las etapas 7–8. (A-E) Imágenes representativas que ilustran el flujo de trabajo de procesamiento de imágenes en el paso 1 aplicadas a ovocitos de las etapas 7–8 de oocitos tratados en frío con patronina ⁰⁵²⁵² de control, control tratados en frío y heterocigotos. Los canales son una imagen representativa de una proyección máxima de 2 fotogramas de una película en time-lapse de 150 fotogramas adquirida a 0,5 s por fotograma. (A) Canal 1, que corresponde a la generación de una imagen desnoidada a partir del ovocito correspondiente con imágenes de la imagen. (B) Canal 2, que corresponde a la generación de una diferencia de imagen gaussiana. (C) Canal 3, que corresponde a la generación de una imagen donde la señal de los cometas EB1-GFP se mejoró para mostrar las puntas de los cometas. (D) Fusión de los canales 2 y 3, que ayuda a visualizar las puntas de cometa resultantes del procesamiento del canal 2. (E) Trayectorias de cometas EB1-GFP generadas a partir del time-lapse C en FIJI usando el plugin Temporal Color Code para ilustrar la dinámica de MT. El código de color indica la proyección temporal para 20 fotogramas (0,50 s entre fotogramas). Barra de escala = 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Captura de pantalla de una sección en el PASO 4 de Jupyter Notebook. El cuaderno está estructurado con celdas Markdown que proporcionan instrucciones autoexplicativas, seguidas de celdas de código que generan resultados y registros en tiempo real. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5: Análisis de la dinámica de cometas EB1-GFP en ovocitos de control y tratados en frío en las etapas 7-8. Los datos representan la media ± SEM por ROI (ROI1–ROI3) para ovocitos tratados en frío y ^{patronina 05252} tratados en frío. Se obtuvieron mediciones de cometas EB1-GFP a partir de imágenes en lapso de tiempo procesadas en FIJI; salvo que se indique lo contrario, se realizaron análisis sobre imágenes procesadas en el Canal 3. El número total de cometas EB1-GFP se analizó a partir de imágenes del Canal 2 (Imagen DoG). La significación estadística se evaluó utilizando la prueba de Kruskal–Wallis seguida de comparaciones post-hoc de Mann–Whitney, o la prueba de Friedman seguida de las pruebas de pareadas emparejadas de Wilcoxon, según corresponda (p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001). (A) Gráfico de puntos de dispersión que muestra el número medio de números totales de cometas EB1-GFP. (B) Gráfico de puntos dispersos que muestra el número medio de cometas EB1-GFP móviles. (C) Gráfico de puntos de dispersión que muestra la longitud media de la trayectoria del cometa EB1-GFP. (D) Gráfico de puntos de dispersión que muestra la velocidad media del cometa EB1-GFP. (E) Gráficos de Rose que muestran la orientación de las pistas EB1-GFP dentro de ROI1–ROI3 en control (n = 14), en control tratado en frío (n = 12) y ^{patronina 05252} en oocitos tratados en frío (n = 11). El porcentaje medio de cada vía por ovocito, orientado hacia la anterior (A) o posterior (P), se indica para cada condición y ROI. (F) Gráfico de barras que muestra el porcentaje medio de ángulos de seguimiento de cometas EB1-GFP orientados hacia los lados anterior y posterior del ovocito. Se calcularon porcentajes por ovocito y representan la distribución relativa de la orientación del cometa dentro de cada ROI. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Métrica	ROI	Control (n=14)	Control del tratamiento en frío (n=12)	Patronin05252 Tratado en frío (n=11)
Número total de cometas EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (anterior)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (centro)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (posterior)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Número de cometa EB1-GFP móvil (#/μm2)	ROI 1 (anterior)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (centro)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (posterior)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
Longitud de la pista del cometa EB1-GFP (μm)	ROI 1 (anterior)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (centro)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (posterior)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
Velocidad del cometa EB1-GFP (μm/seg)	ROI 1 (anterior)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (centro)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (posterior)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Tabla 1. Resumen de mediciones de cometas EB1-GFP en regiones anteroposteriores-posteriores en ovocitos analizados. Las mediciones se obtuvieron de ovocitos tratados en frío con patronina 05252 de control, control y patronina⁰⁵²⁵² heterocigotos. Las regiones de interés se definieron como ROI1 (anterior), ROI2 (medio) y ROI3 (posterior).

Tabla suplementaria 1. Análisis estadístico de mediciones de cometas EB1-GFP entre condiciones experimentales. Los valores p indican diferencias entre ocitos de control, de control tratados en frío y de patronina⁰⁵²⁵² tratados en frío heterocigotos para cada ROI (ROI1-ROI3). Se realizaron comparaciones globales entre las tres condiciones utilizando la prueba de Kruskal–Wallis, seguidas de comparaciones post hoc de Mann–Whitney por pares.  Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Tabla suplementaria 2. Comparación estadística de mediciones de cometas EB1-GFP entre ROIs dentro de cada condición experimental. Los valores p indican diferencias entre ROI1 (anterior), ROI2 (medio) y ROI3 (posterior) dentro de los ovocitos tratados en frío con patronina ⁰⁵²⁵² de control, control tratados en frío y heterocigotos tratados en frío. Las diferencias generales entre los ROI dentro de cada condición se evaluaron mediante la prueba de Friedman. Posteriormente, se realizaron comparaciones por pares entre los ROI utilizando pruebas de rango por signos de pareados de Wilcoxon. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Vídeo suplementario 1. Imágenes en lapso de tiempo de la proteína de seguimiento al extremo positivo EB1-GFP en un ovocito de la etapa de control 7–8, demostrando una adquisición representativa adecuada para un análisis posterior de seguimiento de MT (relacionado con la Figura 3). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo de codificación suplementario 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Un macro Fiji/ImageJ para preprocesamiento de imágenes. Automatiza la corrección por fotoblanqueamiento, el filtrado de Kalman y la resta de fondos utilizando un filtro de Diferencia de Gaussas (DoG). También aplica un aumento de gradiente temporal (recorte y convolución 1D) para afilar los bordes delanteros de las puntas de MT y así mejorar la fidelidad del seguimiento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo suplementario de codificación 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Una macro Fiji/ImageJ para la definición semi-automatizada de Región de Interés (ROI). Solicita al usuario que defina el límite del ovocito y segmenta automáticamente la selección en zonas equidistantes (en nuestro ejemplo 3 zonas: Anterior, Central y Posterior) para permitir la estratificación regional del análisis. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo de codificación suplementaria 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Un script en Python (ejecutado dentro de Fiji/ImageJ) que realiza el seguimiento automatizado de cometas EB1 usando Trackmate. Procesa por lotes imágenes preprocesadas, detecta cometas usando parámetros de calidad definidos, los enlaza en trayectorias y exporta los datos de coordenadas en bruto como archivos CSV. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo de codificación suplementaria 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Un Cuaderno Jupyter que sirve como interfaz principal para el análisis cuantitativo. Carga los datos de seguimiento en bruto, ejecuta la cadena de análisis y genera todos los resultados finales, incluyendo gráficos de rosas, tablas estadísticas resumen y gráficos comparativos para la densidad, velocidad y vida útil del cometa. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo de codificación suplementario 5: File_5_MTModule1.py. Un módulo personalizado en Python que contiene funciones de utilidad fundamentales utilizadas para la extracción de datos y cálculos geométricos básicos. Incluye funciones para encontrar archivos de retorno de inversión, calcular velocidades instantáneas y calcular desplazamientos angulares básicos. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo de codificación suplementaria 6: File_6_MTModule2.py. Un módulo personalizado de Python que contiene funciones avanzadas de análisis y visualización. Alberga los algoritmos para la canalización de análisis de orientación (binning cardinal vs. axial), pruebas estadísticas robustas (método Friedman/Wilcoxon con Pratt) y la generación de gráficos polares (rosa) de calidad de publicación. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Archivo suplementario de codificación 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Se requiere un plugin compilado de Java Kalman Filter para Fiji/ImageJ para los pasos de reducción de ruido en la macro de preprocesamiento. Esta versión independiente elimina la necesidad de un Java Development Kit (JDK) independiente, simplificando la configuración del software del usuario. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo

Discussion

La imagen en vivo de la dinámica de la MT en ovocitos presenta desafíos únicos, ya que se requieren conjuntos de datos de alta calidad y análisis cuantitativos para extraer información significativa. Aunque estudios previos han reportado enfoques de imagen en^{vivo 14, 15 y 16}, los pasos de análisis de imagen suelen estar muy personalizados y los protocolos no proporcionan suficiente detalle para la reproducibilidad. En consecuencia, los investigadores sin una amplia experiencia en imagen o computación pueden enfrentarse a barreras para reproducir estos análisis. Para abordar estos desafíos, se desarrolló un flujo de trabajo simplificado, combinando imágenes en directo de alta resolución Airyscan con macros y scripts automatizados y fáciles de usar. Esta cadena permite la detección y seguimiento eficientes de cometas EB1, seguido de un análisis cuantitativo de la orientación, velocidad y organización espacial de la MT. Al minimizar la intervención manual y proporcionar instrucciones claras paso a paso, el flujo de trabajo promueve la accesibilidad y reproducibilidad del análisis de la dinámica de la MT en ovocitos.

La disección de ovarios y la preparación de la muestra son pasos fundamentales iniciales. Los ovocitos deben diseccionarse cuidadosamente para evitar daños mecánicos, y la duración de la imagen debe limitarse a 90 minutos para mantener la^{viabilidad 20}. La selección de la etapa es importante: tras la mitad de la oogénesis, el ovocito aumenta de tamaño y acumula yema en el citoplasma, lo que dificulta cada vez más la visualización de la señal EB1 más allá de la etapa 9. Por lo tanto, no se recomienda realizar pruebas de imagen más allá del estadio^{9 20}. Además, para cuantificaciones reproducibles, cuando es posible, se prefieren ovocitos de tamaño comparable, ya que esto garantiza que las regiones definidas de interés correspondan a posiciones equivalentes anteroposteriores entre muestras.

El control de temperatura es esencial para la reproducibilidad. Las poblaciones de moscas deben mantenerse en condiciones estándar de cultivo (25 °C) para apoyar un desarrollo normal y una expresión consistente de EB1-GFP, especialmente al utilizar el sistema GAL4/UAS, que es sensible a las fluctuaciones de temperatura. La estabilidad de temperatura durante la imagen es igualmente importante, ya que las variaciones pueden afectar la dinámica de la MT. Aunque no se requiere una cámara con control de temperatura, se recomienda evitar fluctuaciones de temperatura durante la adquisición.

Para la adquisición de imágenes, se seleccionó la imagen confocal con detector de matriz por su alta sensibilidad y mejora de la SNR, minimizando así la necesidad de reducir el ruido tras la adquisición. Se deben utilizar objetivos de apertura numérica alta (tan altos como sea posible) en combinación con la adecuada adaptación del índice de refracción para maximizar la resolución lateral y axial, que es fundamental para resolver cometas individuales en redes densas. Además, los criterios de muestreo^{Nyquist-Shannon 30} deben seguirse en XYZ y tiempo para evitar la pérdida de precisión en el seguimiento del cometa. Igualmente importante es la selección cuidadosa del plano de imagen a lo largo del eje z. Obtener imágenes demasiado profundas provoca pérdida de fluorescencia debido a la dispersión de la luz, mientras que restringir la adquisición a la superficie cortical no logra captar toda la dinámica de los cometas EB1. Los datos más informativos se obtienen en una posición intermedia z. Se deben evitar los ovocitos en los que el núcleo se encuentra dentro del plano seleccionado, ya que el compartimento nuclear desplaza una gran parte del citoplasma y carece de pistas EB1, reduciendo así el número de cometas detectables.

Aunque está optimizado para la imagen confocal basada en detectores de matriz, esta cadena de análisis es independiente del hardware y compatible con otras modalidades, como la microscopía confocal de disco giratorio. Sin embargo, los usuarios deben tener en cuenta que los sistemas con menor NA o SNR pueden requerir ajustes en los parámetros de preprocesamiento del macro (por ejemplo, tolerancia al ruido/sigmas DoG) y pueden resultar en una menor densidad de detección de cometas en comparación con los valores presentados en este estudio. No obstante, aunque los valores absolutos pueden variar entre sistemas, las tendencias relativas observadas entre condiciones experimentales y ROIs esperadas se mantendrán robustas.

Dada la gran estructura 3D del ovocito, la imagen 2D captura solo una sección óptica de la red MT. En consecuencia, los cometas que se mueven abruptamente a lo largo del eje z pueden salir del plano focal, lo que potencialmente lleva a una subestimación de los tiempos de vida de la trayectoria y de la velocidad absoluta (ya que solo se mide la componente xy del vector velocidad). Sin embargo, la imagen volumétrica 3D de alta velocidad de todo el ovocito requeriría campos de visión (FOV) más pequeños, tiempos de exposición más cortos y tiempos de respuesta del detector más rápidos, reduciendo así la SNR y distribuyendo el tiempo de adquisición entre múltiples z-slices, lo que compromete la resolución temporal necesaria para rastrear cometas EB1 rápidos. Para mitigar cometas inmóviles y artefactos desenfocados, se aplicaron filtros convolucionales y de duración mínima de pista (excluyendo pistas < 3 fotogramas) para eliminar puntos transitorios que atraviesan el plano focal. Además, dado que esta limitación geométrica se aplica uniformemente en condiciones experimentales, las diferencias relativas observadas en densidad, velocidad y orientación del cometa siguen siendo robustas. Aunque técnicas emergentes como la microscopía de campo óptico idealmente capturarían simultáneamente la estructura 3D completa, aún no están ampliamente disponibles. No obstante, los valores medidos para todos los parámetros de la dinámica de la MT son consistentes con informes previos, lo que indica que este protocolo es adecuado para investigar la dinámica de la MT en diferentes configuraciones experimentales.

Antes de utilizar los macros de este protocolo, se recomienda procesar manualmente las primeras imágenes para asegurarse de que los parámetros del software están correctamente optimizados. Factores como la resolución de imagen, la ampliación, la relación señal-ruido, la tasa de fotogramas y si los datos son de plano único o de pila z pueden influir en la precisión del seguimiento. Ajustando iterativamente los parámetros mientras inspeccionan visualmente las pistas resultantes para minimizar falsos positivos y falsos negativos. Una vez optimizados, aplica los parámetros de forma consistente entre conjuntos de datos para asegurar la reproducibilidad.

Por último, deben señalarse algunas limitaciones en cuanto a la interpretación biológica. EB1-GFP etiqueta selectivamente los extremos de MT en crecimiento y, por tanto, informa sobre los sitios de polimerización activa de MT en lugar de toda la población de MT. Los MTs estables y no polimerizantes presentes durante el periodo de imagen no son detectados por este método. Aunque esta limitación es menos restrictiva en ovocitos de media oogénesis, donde la mayoría de los MTs son altamente dinámicos, debe considerarse al aplicar el protocolo a otros tipos celulares con poblaciones estables sustanciales de MT, como las neuronas³¹.

En conclusión, este flujo de trabajo permite un análisis cuantitativo y de alta resolución de la dinámica de la MT en ovocitos de Drosophila . Al integrar disección optimizada, imágenes confocales confocales con sensores en matriz y herramientas de análisis automatizadas, proporciona un método riguroso pero accesible para investigar reguladores de MT en un contexto acentrosómico. Aunque se valida principalmente en ovocitos, los principios de este enfoque son adaptables, al optimizarse, a otros tipos celulares, incluyendo células no divididas como neuronas y epitelios, ofreciendo una plataforma escalable para cribados genéticos y estudios mecanicistas de la organización de la MT.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinzas Dumont #5	Herramientas Científicas Fines	11252-20
EB1::GFP	Del Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, Francia		Genotipo: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Placas de Petri con fondo de cristal	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	Centro de Stock Drosophila de Bloomington	7062	Genotipo: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Aceite 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Mutante Patronin	Centro de Stock Drosophila de Bloomington	16647	Genotipo: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	Centro de Stock Drosophila de Bloomington	3605
Zeiss LSM 980 con Airyscan 2	Zeiss