Experimentos de inmunotinción y penetración de colorantes para definir proteínas de unión septata plisadas en el núcleo en epitelios embrionarios de Drosophila

Resumen

Estos protocolos describen cómo caracterizar la organización y la función de oclusión de las uniones septadas plisadas en epitelios embrionarios de Drosophila de control y mutantes.

Resumen

El propósito de estos protocolos es evaluar la organización y función barrera de las uniones septadas plisadas (pSJs) en los tejidos epiteliales derivados de ectodérmica de los embriones de Drosophila. La pSJ forma una barrera ocluiente en la membrana lateral de los tejidos ectodérmicos, incluyendo la epidermis, las glándulas salivales, la tráquea y el intestino posterior, que es funcionalmente similar a la unión estrecha en los tejidos vertebrados. En Drosophila se han identificado 30 proteínas necesarias para la formación de pSJ. Las proteínas pSJ centrales se localizan inicialmente a lo largo de la membrana lateral, pero se enriquecen fuertemente en la región apical lateral de la unión, justo basal a la unión adherente, en la etapa 16 de la embriogénesis. En la etapa final 15 de la embriogénesis, estos tejidos poseen una unión ocluidora completamente funcional. Este artículo describirá protocolos de inmunotinción y permeabilidad a los colorantes que pueden utilizarse para analizar la organización y función de los pSJ en embriones de control y mutantes. El uso exitoso de estos protocolos puede usarse para demostrar la función ocluidora de los pSJ y para comprobar si un gen desconocido codifica un componente central de la unión.

Introducción

Una función crítica de los tejidos epiteliales es compartimentar regiones distintas dentro de un organismo. La creación de estos entornos distintos es esencial para la función de los órganos y para proteger al organismo de amenazas externas. La unión ocluidora formada entre las células de un epitelio es responsable de establecer y mantener estos ambientes al impedir el flujo paracelular de solutos entre los lados apical y basal de ese^{epitelio 1,2}. En los organismos vertebrados, la unión ocluida se denomina unión estrecha, mientras que en invertebrados como Drosophila melanogaster ^1,3 se denomina unión septática (SJ). Existen dos tipos de SJ en los artrópodos que se distinguen por su distribución tisular y^{ultraestructura 4}. Las uniones septadas plisadas (pSJ) se encuentran en tejidos derivados de ectodérmica como la epidermis, las glándulas salivales, la tráquea y el intestino posterior. Se caracterizan de forma ultraestructural por una matriz en forma de escalera de material denso en electrones en el espacio extracelular entre las células, que se encuentra justo en la base de la unión^{adhesiva 3,5}. En cambio, las uniones septaticas lisas (sSJ) se encuentran en tejidos derivados endodérmicamente como los túbulos del intestino medio y de Malpighi, y no presentan septos densos en electrones entre las^{células 6}.

Los estudios genéticos en Drosophila han identificado 30 proteínas necesarias para la estructura y función del pSJ y han identificado proteínas adicionales que residen en la unión pero que no parecen tener ninguna función en su establecimiento o mantenimiento (revisado en^{el artículo 7}). A partir de estos análisis, los científicos han categorizado las proteínas SJ en tres clases. Las proteínas SJ centrales residen en la unión y son necesarias para el establecimiento y mantenimiento de la unión. Se han identificado diecisiete proteínas como proteínas principales de la pSJ, incluyendo Coracle (Cora), Neurexin IV, complemento relacionado con macroglobulinas (Mcr), Kune-kune y ATPasa alfa 8,9,10,11,12. Se han identificado nueve proteínas como proteínas pSJ accesorias que son necesarias para el establecimiento y/o mantenimiento de la unión, pero que no necesariamente residen en la unión. Esta clase incluye proteínas como Rab5, Rab11 y Coiled^13,14. Finalmente, las proteínas residentes de pSJ se localizan en la pSJ pero son prescindibles para el establecimiento y mantenimiento de la unión. Ejemplos de los cuatro miembros de este grupo incluyen Discs Large y Fasciclin^{III 15,16}.

El establecimiento de una pSJ funcionalmente intacta es un proceso de varios pasos que comienza a mitad de la embriogénesis, cuando todas las proteínas principales de la pSJ están completamente expresadas. Algunos genes centrales de la pSJ se expresan por vía materna, pero todos muestran una fuerte expresión cigota en las etapas^12-17. En la etapa 12, las proteínas centrales de la pSJ se localizan a lo largo de toda la membrana lateral. Durante las etapas 13-16, las proteínas centrales pSJ se endocitan y luego se reciclan de nuevo a la membrana lateral en la región de la pSJ. Este proceso requiere proteínas accesorias pSJ, incluyendo Rab5 y^Rab11-14. En la etapa 16, las proteínas centrales de la pSJ están estrechamente localizadas en la región de la pSJ a lo largo de la membrana lateral. En consonancia con estas observaciones, la función de oclusión completa de la unión ocurre en la fase final 15 de la^{embriogénesis 12}. Esto se demuestra mejor mediante un ensayo de permeabilidad al colorante. Antes de la formación de la unión, una perla de dextrán de 10 kDa marcada con un marcador fluorescente como la rodamina puede pasar por el espacio paracelular entre las células. Si el dextrano marcado se inyecta en el hemocelo, se acumulará rápidamente en el lumen de los epitelios tubulares como la tráquea, la glándula salival y el intestino posterior. Después de que la pSJ esté fisiológicamente tensa al final de la etapa 15, el dextrano inyectado queda restringido al lado basal del epitelio y no puede acumularse en el lumen (dominio apical) de estos órganos.

Las proteínas pSJ centrales comparten una característica en la que cada proteína pSJ central requiere la presencia de todas las demás proteínas pSJ centrales para una localización subcelular^{correcta 18,19}. Esta interdependencia en la formación de pSJ es una característica definitoria de las proteínas pSJ centrales y subyace a los protocolos presentados en este artículo. Las mutaciones en genes pSJ núcleo o accesorios conducen a letalidad embrionaria y se caracterizan por la deslocalización de otras proteínas pSJ centrales a lo largo de la membrana lateral en embriones de estadio 16, en lugar de estar estrechamente localizadas en su región apical lateral normal. En cambio, las mutaciones en genes residentes en pSJ no conducen a la deslocalización de las proteínas centrales de^{pSJ 15}. La alteración funcional del pSJ en mutaciones del gen central y accesorio del gen pSJ se revela por la acumulación de dextrán marcado de 10 kDa en el lumen de la tráquea, glándulas salivales o intestinos posteriores en embriones mutantes de estadio 16 o 17. Finalmente, la característica distintiva entre una proteína pSJ central y una accesoria es su localización subcelular. Las proteínas pSJ principales están estrechamente asociadas con la pSJ una vez que se forman, mientras que las proteínas pSJ accesorias son críticas para el ensamblaje de la unión pero no necesariamente residen en ella. Los mejores ejemplos de proteínas pSJ accesorias son Rab5 y Rab11. Ambas son proteínas citoplasmáticas que ayudan a trasladar la carga desde la membrana plasmática a la primera y a reciclar endosomas y luego de vuelta a la membrana^{plasmática 14}. Para distinguir si una nueva proteína potencial de pSJ es un componente central o una proteína accesoria, generalmente es útil crear un anticuerpo específico o expresar una proteína recombinante marcada con fluorescencia para determinar dónde se localizan estas proteínas en distintos puntos del proceso de maduración de pSJ.

El propósito de estos protocolos es distinguir de forma inequívoca las proteínas pSJ potenciales de núcleo y accesorios de las proteínas residentes en pSJ. Varios estudios han revelado roles adicionales y no oclusores de las proteínas pSJ durante el desarrollo, incluyendo roles en la morfogénesis y la polaridad^apical-basal 17,20,21,22^. A medida que aumenta el interés por la biología de la pSJ y se identifican más proteínas potenciales de la pSJ, los protocolos simples y fácilmente interpretables presentados aquí ayudarán a los investigadores a caracterizar correctamente la organización y las funciones de oclusión de la pSJ de estas proteínas. En la literatura, se han descrito muchos enfoques experimentales adicionales para caracterizar proteínas pSJ, incluyendo la Recuperación de Fluorescencia Después del Fotoblanqueamiento (FRAP) y la microscopía electrónica^{de transmisión 6,23}. Aunque estos enfoques suelen ser muy útiles, el ensayo de inmunotinción presentado aquí proporciona una visualización rápida de la localización de la proteína pSJ sin métodos ultraestructurales costosos y que consumen mucho tiempo, mientras que el ensayo de permeabilidad al colorante ofrece una lectura funcional de la integridad de pSJ que no se puede lograr solo con imágenes. Además, estos ensayos pueden realizarse utilizando equipos estándar de laboratorio, como un microscopio de fluorescencia de buena calidad y un sistema rudimentario de microinyección. Cabe señalar que estos ensayos están optimizados para el análisis de embriones de Drosophila en estadio 16 y no son apropiados para evaluar la organización o función de los SJ.

Protocolo

1. Estadificación de embriones

1. Cruza moscas macho y hembra sanas de los genotipos apropiados (véase la Tabla de Materiales para ejemplos) y colócalas en jaulas de recogida de embriones con platos de zumo de manzana fresco untados con pasta de levadura. Deja que las moscas se aclimaten a las jaulas de recogida de huevos durante uno o dos días antes de comenzar la recogida de embriones.
2. Recoge embriones en platos de zumo de manzana y deja que se desarrollen hasta la etapa 16 (~13 h después de la puesta de huevos (AEL) hasta 16 h AEL a 25 °C). Permite que los adultos pongan huevos fertilizados durante 1-2 horas en platos de zumo de manzana, retira el plato de la jaula de recogida y luego envejezca hasta 13-16 AEL a 25 °C. Alternativamente, se recogen embriones durante la noche a 25 °C y luego se seleccionan los embriones en estadio 16 antes de la fijación o durante la imagen, tras la fijación y la inmunotinción.
   NOTA: La estadificación embrionaria puede evaluarse mediante la morfología intestinal, que se visualiza más fácilmente mediante la autofluorescencia en el espectro UV (es decir, canal DAPI). En embriones en estadio 16, el intestino aparece como tres óvalos paralelos y largos perpendiculares al eje largo del cuerpo (Figura 1H).

2. Fijación e inmunotinción de embriones

1. Monta una cesta de recolección de embriones con malla de nylon (malla de 120 mm). Cubre la abertura y las roscas de la cesta con malla de nailon, luego atornilla la tapa.
2. Desaloja suavemente los embriones del plato de zumo de manzana con un pincel y una solución para el lavado de embriones. Vierte la mezcla de embriones en la cesta de recogida de embriones y enjuaga los embriones con agua destilada.
   NOTA: Ten cuidado de dirigir el agua por el interior de la cesta de recogida de embriones y evita que los embriones salpiquen los laterales de la cesta, lo que puede provocar la pérdida de embriones debido a la adhesión.
3. Descoriionar los embriones sumergiendo la cesta de recogida y los embriones en una bandeja que contiene un 50% de lejía comercial (concentración final del 3,75% de hipoclorito sódico). Remueve los embriones en la lejía y mantenlos sumergidos durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. Retira la cesta de la lejía y enjuaga los embriones con agua destilada, dirigiendo de nuevo el flujo de agua por el interior de la cesta.
4. Prepara un vial de fijación añadiendo volúmenes iguales de solución fresca de paraformaldehído al 4% y heptano a un vial de centelleo de 20 mL. Elabora la solución de paraformaldehído disolviendo la cantidad adecuada de paraformaldehído en una solución salina caliente (~90 °C) amortiguada con fosfato (PBS) en una campana extractora química. Para acelerar el proceso de disolución, añade 10 μL de hidróxido de sodio de 14 N (por cada 10 mL de PBS) al fijador hasta que el formaldehído entre en solución, y luego añade 10 μL de ácido clorhídrico de 14 N para ajustar el pH de nuevo a neutro.
   PRECAUCIÓN: Siempre lleva bata de laboratorio, gafas y guantes al manipular paraformaldehído y heptano, y úsalo solo bajo una campana extractora química. El paraformaldehído es un carcinógeno y corrosivo, mientras que el heptano es altamente inflamable y irritante tanto para la piel como para los ojos.
5. Desmonta la cesta de recogida de embriones y sumerge la malla de nailon con embriones descoriionados en el heptano. Los embriones se desprenden del nailon y se asientan en la interfaz entre el heptano (capa superior) y el fijo (capa inferior). Fija los embriones agitando el vial de fijación en un agitador plataforma a 240 revoluciones por minuto (RPM) durante 20 minutos.
6. Retira el fixador del frasco de fijación con una pipeta Pasteur en una campana extractora química. Desecha la solución en un contenedor aprobado para residuos químicos peligrosos. Añade un volumen igual de metanol, cierra la cámara de fijación y agita vigorosamente la cámara durante 5-10 segundos. Los embriones fijos se desprenden del envoltorio vitelino y se hunden en el fondo del metanol (capa inferior). Las envolturas de vitelina y cualquier embrión que no haya logrado desprenderse de la envoltura permanecerá en la interfaz y será retirado en el paso 2.7.
   PRECAUCIÓN: Siempre lleva bata de laboratorio, gafas y guantes al manipular metanol, ya que es tóxico e inflamable.
7. Retira el heptano con una pipeta Pasteur y deséchalo en un recipiente aprobado para residuos químicos peligrosos. Luego, se elimina la mayor parte del metanol, dejando los embriones en un pequeño tanque de metanol, y se desecha el metanol en residuos químicos peligrosos. Añade 5 mL de metanol, remueve los embriones y déjalos asentarse. Retira la mayor parte del metanol otra vez y repite este proceso dos veces más.
8. Transfiere los embriones en metanol a un tubo de cultivo de vidrio de 0,8 mL. Retira el metanol y añade 750 mL de solución bloqueada (PBS más 1% suero de burro normal y 0,1% Triton X-100). Lava los embriones 3 veces en PBS y luego incubalos en solución en bloque durante 30 minutos a temperatura ambiente, mezclando suavemente en un balancín plataforma.
9. Enjuaga los embriones una vez más con PBS y luego añade bloque más anticuerpos primarios. Utiliza anticuerpos contra una proteína central pSJ (por ejemplo, Coracle) y una proteína de unión adherente (por ejemplo, E. cadherina). Incubar los embriones en anticuerpo primario durante la noche a 4 °C o durante 3-4 horas a temperatura ambiente, mezclando suavemente en un balancín plataforma.
10. Retira el bloque con anticuerpos primarios y enjuaga los embriones tres veces con PBS. Añade Block y lava los embriones durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un balancín plataforma.
11. Enjuaga los embriones una vez más en PBS, luego añade la solución bloqueante y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia específicos para los anticuerpos primarios usados en el paso 2.9. Incubar embriones a temperatura ambiente durante 3-4 horas o durante la noche a 4 °C.
12. Retira el bloque con anticuerpos secundarios y enjuaga los embriones tres veces con PBS. Añade Block y lava los embriones durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un balancín plataforma.
13. Enjuaga los embriones una vez más en PBS y luego transfiere a una lámina de microscopio usando una pipeta Pasteur. Elimina el exceso de PBS usando pequeñas tiras de papel Whatman, cuidando de no tocar los embriones. Cubrir los embriones con un medio de montaje (disponible comercialmente o hecho con 90% glicerol, 10% 1 M Tris, pH 8,0, con 0,5 % de n-propilo galato como agente antidesvanecimiento). Cubre con un vaso de tapa número 1,5 del tamaño adecuado y sella los bordes con esmalte de uñas.

3. Imagen y análisis de datos de embriones inmunotintidos

1. Para obtener los mejores resultados, fotografía de embriones con un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite de 40x. Utiliza embriones de control para ajustar la intensidad y ganancia del láser en el confocal y así lograr una señal fluorescente fuerte sin saturar ningún píxel. Identificar embriones de elección en estadio 16 (es decir, aquellos que no expresan GFP codificada por balanceador para identificar embriones mutantes) usando la morfología del intestino medio. Enfoca la exploración en la glándula salival o el intestino posterior, ya que estos órganos están polarizados y tienen membranas laterales largas ideales para distinguir la unión adherente, la pSJ y la superficie lateral restante. Imagen en posición z que incluirá el mayor diámetro posible del lumen de la glándula salival o del intestino posterior para observar la membrana lateral completa de la célula epitelial.
   NOTA: El ejemplo mostrado en la Figura 1C fue tomado con un microscopio confocal con una lente de inmersión en aceite HC PL APO 40x/1.3 CS2 con una intensidad láser de 1,59 y una ganancia de 3,3 para el láser de 561 nm, una intensidad láser de 2,0 y una ganancia de 21,7 para el láser de 638 nm (véase Tabla de Materiales).
2. Imagina un tejido polarizado en al menos 20 embriones de control y mutantes en estadio 16. Solo se registran datos de embriones en los que el marcador de unión adherente esté estrechamente localizado en la región apical lateral de la membrana para asegurar que el embrión estuviera fijado y teñido adecuadamente. A continuación, registra la distribución del marcador pSJ a lo largo de la membrana lateral. En embriones de tipo salvaje en estadio 16, busca un fuerte enriquecimiento de proteínas pSJ a lo largo del ~10-15% de la membrana lateral, justo basal a la unión del adherente.
   NOTA: La deslocalización incluso del 10-20% de la proteína pSJ a lo largo de la membrana lateral es diagnóstica para un defecto de organización de la pSJ. Los defectos de organización pSJ son muy penetrantes en todos los embriones mutantes de pSJ de núcleo y accesorios, por lo que se debe esperar ver entre el 75 y el 100% de los embriones mutantes mostrando una proteína pSJ claramente mal localizada.

4. Preparación para la inyección de tinte

1. Haz una solución de colorante fresca disolviendo 10 kDa de Dextrano marcado con rodamina a 1 mg/mL en 0,5 M de fosfato de sodio, pH 7,5 y 5 mM de cloruro de potasio.
2. Tira de un tubo capilar (1,0 mm de diámetro exterior x 0,5 mm de diámetro interior con fibra) en una aguja de vidrio usando un extractor de agujas.
   NOTA: Los extractores de agujas son idiosincráticos y los ajustes para agujas ideales suelen variar de un día a otro. Las agujas buenas tienen un estrechamiento gradual hacia un punto afilado y deben caer entre las formas mostradas en la Figura 2A. La aguja de la izquierda es más larga y puede doblarse al introducirse en el embrión. Eso se puede corregir rompiendo la aguja más lejos del punto. La aguja de la derecha es buena, pero tendrá un diámetro mayor cuando se rompa al principio y puede empujar demasiado líquido al embrión. Si eso ocurre, cambia a una aguja nueva con punta más fina. Es mejor extraer varias agujas a la vez cuando las condiciones del extractor de agujas crean agujas con la forma adecuada. El exceso de agujas puede almacenarse en un recipiente cerrado con un trozo de espuma o cinta para asegurar las agujas de forma independiente.
3. Carga la aguja en el soporte de un micromanipulador. Coloca el micromanipulador junto a un microscopio invertido (Figura 2F). Orienta la aguja lo más paralela posible al portaobjetos del microscopio y bájala para que quede en el mismo plano z que el lateral del portaobjetos.
4. Rompe la punta de la aguja golpeando el lateral del portaobjetos del microscopio. Eleva la aguja por encima del nivel de la lámina y sácala para cargarla.
5. Llena el tubo capilar con tinte usando la punta de pipeta más pequeña disponible (punta P2 o P10) o por acción capilar colocando la parte trasera de la aguja en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL junto con el tinte.
6. Recarga la aguja llena en el portaagujas y prueba el flujo del dextrán inyectando un bit en una gota de aceite de halocarbono sobre la superficie de una lámina de microscopio.
   NOTA: Una aguja bien rota no goteará sin añadir presión, y la velocidad de flujo puede ajustarse según la presión que se aplique al émbolo de la jeringuilla.

5. Montar embriones e inyección de tintes

1. Selecciona embriones en estadio 16 o 17 (control y mutante) usando la morfología del intestino medio como marcador de etapa.
2. Crea una línea hundida en un plato de zumo de manzana usando un engobe de 22 x 22 # # 2 de grosor. Alinear aproximadamente 25 embriones en etapas en la placa de zumo de manzana con sus extremos posteriores tocando la línea y la superficie ventral hacia arriba.
3. Aplica un trozo de cinta adhesiva de doble cara sobre una cubierta #2 de 22 x 22. Toca la cinta con la línea del embrión y frota suavemente la cubierta para mover los embriones desde la placa hasta la cinta de doble cara en la cubierta (Figura 2B).
4. Sujeta el portaobjetos a una lámina de microscopio añadiendo una gota de aceite de halocarbono a la lámina y usando acción capilar para crear un enlace. Orienta la cubierta más cerca del lado del tobogán opuesto a cualquier parte esmerilada. Deseca los embriones durante 3-5 minutos en un recipiente con desecante o en el aire sobre una mesa de laboratorio durante 10-15 minutos (Figura 2C-E). Cubre completamente los embriones con aceite de halocarbono.
   NOTA: Los embriones estarán ligeramente menos turgídos tras la desecación, pero no estarán fuertemente flácidos. Los embriones mostrados en la Figura 2E se dejaron secar al aire durante 15 minutos en una habitación con un 42% de humedad relativa a 21,2 °C.
5. Monta la lámina con los embriones sobre el microscopio invertido con los embriones orientados hacia arriba (alejados del objetivo). Alinea el micromanipulador de modo que la aguja esté orientada hacia el extremo posterior de los embriones en un ángulo lo más paralelo posible a los embriones (Figura 2G). Ajusta el eje z del micromanipulador de modo que la punta de la aguja quede alineada con el punto medio del embrión (a lo largo del eje dorsal-ventral).
6. Inyecta los embriones moviendo rápidamente la etapa hacia la aguja para que la punta de la aguja entre en el hemocel del embrión. Inyecta una pequeña cantidad de tinte (~0,2-0,5 nL) usando una jeringuilla de 10, 25 o 50 mL. Retira rápidamente la aguja, mueve la etapa al siguiente embrión y repite el proceso. Inyecta tantos embriones como puedas en 10 minutos.
   NOTA: Es importante que la aguja se inserte aproximadamente al 25% del camino dentro del embrión para que el tinte no se inyecte directamente en el espacio perivitelino, que es continuo con la luz del intestino anterior y posterior. El tinte inyectado debe parecer "inflar" el embrión, haciéndolo parecer más turgido. La sobreinyección provocará una burbuja de colorante y hemolinfa saliendo del lugar de la inyección y debe evitarse.
7. Añade más aceite de halocarbono y cubre los embriones con una capa de 22 x 22 #2. El aceite adicional de halocarbonos forma una capa más uniforme entre las dos cubiertas, evitando que los embriones sean triturados.

6. Imagen y análisis de datos

1. Realiza imágenes con un microscopio compuesto fluorescente o con un microscopio confocal (10x o 20x objetivos de aire son suficientes para obtener resultados inequívocos). En la imagen confocal en pila z a través de aproximadamente una cuarta parte de la profundidad (a lo largo del eje ventral dorsal) del embrión revelará si el dextrano marcado ha entrado en el lumen de la tráquea y el intestino posterior (es necesario reorientar los embriones con la superficie ventral en la parte superior para ver las glándulas salivales).
   NOTA: Los ejemplos mostrados en la Figura 3 fueron tomados con un microscopio confocal con una lente seca HC PL APO 10x/0.4 CS2 con una intensidad láser de 2.0 y una ganancia de 13.6 para el láser de 561 nm. Se obtuvieron cortes de 24 z con un tamaño de paso z de 2,4 nm (véase la Tabla de Materiales).
2. Deja que el embrión inyectado envejezca durante 10 minutos y luego examina el lumen de la tráquea, la glándula salival o el intestino posterior para detectar la acumulación del dextrano marcado. Registrar el genotipo y la etapa de cada embrión y si hay acumulación de dextrano marcado en algún órgano tubular. Observa cualquier embrión en el que el espacio perivitelino también esté fuertemente teñido con tinte, ya que estos pueden representar embriones que fueron inyectados inadvertidamente en ese espacio.

Resultados

Los protocolos presentados aquí se utilizan para investigar la organización y función de los pSJ en tejidos ectodérmicos en embriones de Drosophila en estadio 16. Estos protocolos solo son aplicables a los pSJ y no pueden usarse para interrogar a los sSJ. Una mutación en un gen que resulta en el fallo de localizar otras proteínas pSJ en la región pSJ en embriones de la etapa 16 y de crear una unión ocluidora en la etapa 16 está en un gen pSJ central o en un gen pSJ accesorio. La principa...

Discusión

Aquí presentamos un protocolo para identificar proteínas pSJ principales y accesorias utilizando dos ensayos relativamente sencillos que pueden realizarse en laboratorios modestamente equipados con capacidades de microscopía de fluorescencia. El primer ensayo examina la organización molecular de la pSJ en epitelios polarizados maduros utilizando imágenes confocales de embriones mutantes fijos. El segundo ensayo prueba la integridad de la función ocluidora del pSJ inyectando moléculas de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo capilar para agujas (Boro 1 x 0,5/fibra)	FHC	30-30-1
Microscopio confocal	Leica	Stellaris 5
Cubre el vidrio de 22 x 22 2 de grosor para inyecciones	Fisher Scientific	12-540-B
Tapa de vidrio 22 x 30 de grosor 1,5 para imagen	Corning	2980-233
Tubo de cultivo para inmunotinción (6 x 50 mm) y nbsp;	Fisher Scientific	14-958-A
Jaula de recogida de embriones	Genesee Scientific	59-100
Estereomicroscopio de fluorescencia	Leica	MZ10 F
Aceite de halocarbono (700)	Genesee Scientific	59-131
Heptano	Fisher Scientific	H350-4
Microscopio de fluorescencia invertida	Leica	DMi8
Cestas de malla para embriones en descoriación	Genesee Scientific	46-101
Metanol	Fisher Scientific	A412-4
Micromanipulador	Narishige	MN151
Portaobjetos de microscopio	Fisher Scientific	12-544-2
Extractor de agujas	Instrumentos David Kopf	Modelo 720
Suero normal de burro	Jackson ImmunoRecherch	017-000-121
Malla de nylon (120 um)	Genesee Scientific	57-102
Objetivo HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1	Leica	11506537
Objetivo HC PL APO 10x/0.40 CS2	Leica	15506407
Objetivo HC PL APO 40x/1.30 CS2	Leica	15506358
Placas de Petri 60 x 15 mm	Corning	351007
Balancín de plataforma	Globe Scientific	GTR-FS
Anticuerpo primario (Coracle)	DSHB	C566.9
Anticuerpo primario (Coracle)	DSHB	C615.16
Anticuerpo primario (E. cadherina)	DSHB	DCAD2
Anticuerpos primarios (Mcr)	Laboratorio de sala, CWRU	Policlonal de conejillos de indias
Rodamina marcada como dextrano de 10 kDa	Sondas moleculares	D1824
Anticuerpo secundario (anti-conejillo de indias Cy3)	Jackson ImmunoRecherch	706-165-148
Anticuerpo secundario (Cy2 anti-ratón de burro)	Jackson ImmunoRecherch	715-225-151
Anticuerpo secundario (anti-rata Cy5 de burro)	Jackson ImmunoRecherch	712-175-150
Agitador de mesa	Científica de Nuevo Brunswick	Agitador de plataforma C2
Tegosept (metil 4-hidroxibenzoato)	TCI	H0216
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151500
Viales para fijación (20 ml de frascos de centelleo líquido WHEATON)	Fisher Scientific	03-341-73C
Whatman 3MM  Artículo sobre cromatografía	Fisher Scientific	05-716-6H
Acciones de mosca	Genotipo completo	fuerte	Fuente
cor4	w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
Solución	Receta
10 veces PBS	Mezcla 90 g de NaCl, 20 g de Na2HPO4 y 8,3 g de NaH2PO4.H2O y dH20 a 1L. Esteriliza con el filtro. Diluye a 1X con dH2O para los pasos de lavado en la inmunotinción.
Solución 10% Triton X-100	Mezcla 1 ml de Triton X-100 a 9 ml de dH2O en un balancín plataforma hasta que se disuelva. Guárdalo a temperatura ambiente.
50% lejía	Mezclar 10 ml de lejía comercial (7,5% hipoclorito sódico) con 10 ml de agua antes de descorionizar los embriones.
Platos de zumo de manzana	Hervir 15 g de agar Drosophila en 725 ml de dH2O. Añade 25 g de azúcar y 250 ml de zumo de manzana y mezcla hasta que esté batido. Deja que la solución se enfríe a 55 °C y luego añade 1,3 g de tegosepto y mezcla suavemente. Vierte en placas de Petri de 60 x 15 y deja que se enfríen. Guárdalo a 4 °C.
Solución de bloqueo	Mezcla 9,8 ml de 1X PBS con 100 ul de Triton X-100 al 10% y 100 ul de Suero Normal Donkey en un tubo cónico de 15.
Solución de lavado de embriones	Haz 10 x de solución de lavado de embriones mezclando 70 g de NaCl y 2 ml de Triton X-100 a 1L de dH2O. Diluye a 1X con dH2O para la solución funcional.
Arreglar	Precalienta 10 ml de 1X PBS en el microondas. Añadir 0,4 g  de paraformaldehído y pipeta para mezclar. Añade 10 uls de NaOH 14N para disolver la velocidad. Coloca sobre un bloque térmico de 90 °C hasta que se disuelva. Cuando no quede paraformaldehído sólido, añade 10 ul de 14N HCL para ajustar el pH a neutro. Siempre lleva bata de laboratorio, guantes y gafas cuando uses paraformaldehído.
Medios de montaje	Mezcla 9 ml de glicerol y 1 ml de 1M Tris base pH 8,0. Añade 0,05 g de n-propil-galato,   Mezcla y calienta para disolver. Alícuota 0,5 ml en tubos de Eppendorf.
Solución de dextráns de rodamina	Prepara una solución de colorante fresca disolviendo Dextrán marcado con Rodamina de 10 kDa a 1 mg/ml en fosfato de sodio 0,5M, pH 7,5 y 5 mM de cloruro de potasio.
Pasta de levadura	Mezcla 50 g de levadura comercial (Red Star) con una pizca de sacarosa y suficiente agua para obtener una pasta espesa. Guárdalo a 4 °C.