Artículo de método

Visualización en tiempo real del impacto de los medios nutritivos en el desarrollo de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa utilizando un sistema microfluídico

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 de mayo de 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo evalúa la influencia de composiciones de medios nutritivos ricos (TSB) y mínimos (FAB) en el desarrollo de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y PA14 en un entorno de flujo estacionario en un microcanal.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La bacteria patógena Pseudomonas aeruginosa es una causa principal de numerosas infecciones nosocomiales, y su creciente resistencia antimicrobiana ha supuesto una amenaza significativa para la salud pública. Este artículo presenta un protocolo completo que detalla el uso de un sistema microfluídico para la visualización y cuantificación en tiempo real del desarrollo de biopelículas en dos cepas clave de P. aeruginosa , PAO1 y PA14. El método emplea placas de microcanales ópticamente transparentes y multicanal para someter los cultivos bacterianos a un flujo continuo y constante de medios, incluyendo caldo de soja tríptico (TSB) o caldo anaeróbico mínimo y meticuloso modificado (FAB) con diferentes concentraciones de carbono, imitando así las condiciones presentes en entornos clínicos. Durante un periodo de 24 horas, la imagen automatizada en tiempo real captura el crecimiento y maduración de las biopelículas en forma de cobertura superficial, grosor y rugosidad superficial de la biopelícula de manera altamente reproducible. El objetivo experimental es utilizar los resultados para demostrar que la formación de biofilm para ambas cepas se ve significativamente afectada por cambios en la composición del medio nutritivo. El objetivo de este protocolo visualizado es proporcionar un método para que los investigadores estudien la dinámica de biopelículas bajo condiciones de flujo laminar estable, y los conocimientos obtenidos podrían aprovecharse para desarrollar estrategias alternativas no antimicrobianas que erradiquen biopelículas de P . aeruginosa en fase temprana en entornos nosocomiales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este método es observar el impacto de dos medios de cultivo diferentes, es decir, el caldo de soja tríptico (TSB) y el caldo anaeróbico mínimo meticuloso modificado (FAB), en el crecimiento de biofilm de dos cepas de Pseudomonas aeruginosa , a saber, PAO1 y PA14. Aunque P. aeruginosa PAO1 y PA14 son cepas de referencia de laboratorio comunes, la cepa PA14 infecta una mayor proporción de hospedadores, desde plantas hastainvertebrados 1. El caldo nutritivo TSB es un medio de cultivo de uso general con 2,5 g/L de glucosa como fuente de carbono y puede cultivar una amplia variedad de bacterias gracias a su composición de caseína y peptonas de soja para nitrógeno orgánico y suministro natural de azúcar, así como cloruro de sodio para mantener el equilibrioosmótico 2. El medio mínimo de la FAB, en cambio, se formula con concentraciones mínimas (reducción de 50 veces) de una única fuente de carbono, a niveles de 0,05 g/L para explorar los requerimientos de crecimiento de bacterias anaeróbicas. Tanto las deformaciones PAO1 como PA14 estuvieron expuestas a un flujo laminar unidireccional, resultando en una tensión cortante de pared baja de 0,01 Pa. Este valor de esfuerzo cortante suele estar presente en zonas colonizadas por P. aeruginosa, incluyendo los bronquios de pacientes con fibrosis quística y el tracto gastrointestinal. El crecimiento del biofilm se midió durante un periodo de 24 horas evaluando en tiempo real el porcentaje de cobertura superficial del biofilm, el grosor y la media aritmética de la rugosidad superficial.

Los biofilmes de P. aeruginosa son responsables de un porcentaje significativo de infecciones nosocomiales y constituyen una de las principales causas de muerte en personas con fibrosisquística 3,4,5. Investigaciones previas sobre el impacto de los niveles de fuentes de carbono en el desarrollo de biopelículas bacterianas han descuidado el papel crítico del flujo hidrodinámico durante el desarrollo de biopelículas, han utilizado valores de esfuerzo cortante que no representan los sitios de infección por P. aeruginosa, o han realizado únicamente análisis cinéticos y morfológicos de biofilm trasel experimento 6,7. Estas limitaciones se abordan en este método mediante la imagen en tiempo real del desarrollo de biofilmes, bajo condiciones de flujo estacionario dentro de un canal microfluídico que replica estrechamente los entornos fisiológicos encontrados en pacientes con fibrosis quística.

Este método ofrece ventajas significativas frente a técnicas alternativas que se utilizan para estudiar el desarrollo de biofilms. La aplicación de imágenes en tiempo real durante el periodo de crecimiento de biofilm de 24 horas garantiza que el biofilm en desarrollo no se altere, ya que no se requieren secado ni alteraciones químicas, evitando cambios en su composición y produciendo resultados más representativos que los métodos que requieren manipulaciónde muestras 8. Además, aplicando condiciones de flujo hidrodinámico constante y variando las concentraciones de fuentes de carbono a lo largo de una gran magnitud, este procedimiento replica con mayor precisión los ambientes fisiológicos encontrados en los sitios de infecciones nosocomiales por P. aeruginosa. Esto lo convierte en un método más representativo en comparación con aquellos que utilizan ensayos estáticos, como placas de microtitulación de 96 pozos o cupones, que no capturan el impacto crítico del flujo de fluidos en el desarrollode biopelículas 9,10,11.

El dispositivo microfluídico empleado fue elegido específicamente porque sus dimensiones son similares a las de partes del pulmón, como bronquiolos ybronquios 12. Además, las infecciones por P. aeruginosa son una preocupación importante para los pacientes con quemaduras graves, donde los niveles de glucosa pueden fluctuar significativamente respecto al rango normal delpaciente, 13,14.

Aunque este protocolo utiliza específicamente dos cepas de P. aeruginosa, el método también es aplicable a investigaciones sobre el desarrollo temprano de otras bacterias que causan infecciones o colonizan áreas bajo condiciones similares. Además, se podrían investigar otras composiciones de medios nutritivos así como las condiciones de flujo (por ejemplo, flujos pulsátiles y oscilantes, o valores de cizallamiento de pared más altos) utilizando la misma metodología.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Limpieza de cristalería

  1. Sumergir dos botellas de vidrio de 200 mL para usar como medios y agar, y tres botellas de vidrio de 1 L en un baño de ácido clorhídrico (HCl) al 10% durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es corrosivo. Realizar todo el manejo de ácido en una campana extractora química mientras se lleva el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes y protección ocular).
  2. Después, retira la cristalería del baño de HCl y enjuaga dos veces con agua del grifo y una vez con agua destilada (dH 2O).

2. Preparación de medios para caldo de soja tríptico

  1. Prepara la solución TSB, pesa 6 g/200 mL de polvo TSB usando un báscula limpia y una balanza de precisión.
    NOTA: La composición del polvo de TSB utilizada es la siguiente: Dextrosa (2,5 g∙L-1), fosfato de dipotasio (2,5 g∙L-1), digestión pancreática de caseína (17 g∙L-1), digestión papaica de harina de soja (3,0 g∙L-1) y cloruro de sodio (5,0 g∙L-1).
  2. Mide 200 mL dedH 2Ousando un cilindro medidor y viertelo en una de las botellas de cristal previamente limpiadas.
  3. Añade los 6 g de TSB en la botella de cristal limpia que contiene los 200 mL de dH2O, sella bien la botella y mezcla durante aproximadamente 2 minutos para disolver el polvo, creando así el medio disolución TSB.
  4. Autoclave solución de medio TSB durante 15–20 minutos a una temperatura de 121 °C y presión de 1,5 atm, para esterilizar la solución.
    NOTA: (punto de pausa) La solución de TSB puede almacenarse a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) entre usos y usarse para futuros experimentos.

3. Preparación meticulosa de medios anaerobios para caldo

  1. Prepara la solución de metales traza de medios FAB.
    1. Utiliza barcos de pesaje separados y limpios y una espátula, y una balanza de precisión para pesar masas entre 0,5 y 210 g, y una balanza analítica para pesar masas entre 0,001 y 0,5 g. Mide los siguientes componentes y sus cantidades: CaSO4,2H 2O(200 mg∙L-1), FeSO4,7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O(20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1), yH 3BO 3 (5 mg∙L-1) 7,9.
    2. Añade cada uno de los componentes en una botella de cristal limpia de 1 L que contiene 1 L de dH2Oy mezcla bien con eldH2O.
    3. Añade 1 mL de la mezcla a cada una de las dos botellas de cristal esterilizadas de 1 L restantes con 1 L de dH2Oy mezclad bien.
  2. Prepara 20 mM de FAB suplementado con citrato de sodio para cultivos nocturnos
    1. Mide los siguientes componentes y sus cantidades utilizando embarcaciones de pesaje separadas y limpias y una espátula, una balanza de precisión al pesar masas entre 0,5 y 200 g y una balanza analítica al pesar masas entre 0,001 y 0,5 g: citrato de sodio (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO 4,2H 2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) y CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Añade todos los componentes en una de las botellas de cristal esterilizadas de 1 L restantes que contengan 1 L dedH 2O con 1 mL de solución de metal traza.
    3. Mezcla bien.
  3. Prepara 0,3 mM de FAB suplementado con glucosa para el crecimiento de biofilm.
    1. Sustituye los 20 mM de citrato de sodio por 0,3 mM de glucosa. Utiliza los mismos componentes y masas que se enumeran en el paso 3.2.1.
    2. En el frasco de cristal de 1 L que queda limpio, añade los componentes de 0,3 mM de glucosa FAB a 1 mL de dH2Ocon 1 mL de solución de metal traza y mezcla bien.
  4. Autoclave durante 15-20 minutos a una temperatura de vapor de 121 °C y presión de 1,5 atm, para esterilizar el medio.
    NOTA: (punto de pausa) La solución de medio de fábrica puede almacenarse a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) entre usos y usarse para futuros experimentos.

4. Preparación de agar TSB

  1. Mide 8 g/200 mL de agar TS usando la balanza de precisión y las barcas de pesaje lavadas y la espátula.
  2. Mide 1 g/200 mL de agar de grado bacteriológico a lo largo de un lagar bacteriológico, en un barco de pesaje separado, usando la misma balanza de precisión.
  3. Usando un cilindro medidor, mide 200 mL de dH2O y viertelos en la botella final de cristal previamente limpiada.
  4. Vierte ambos componentes de agar en los 200 mL dedH 2Oy mezcla bien.
  5. Autoclave durante 15–20 minutos a una temperatura de 121 °C y presión de 1,5 atm, para esterilizar el medio.
    NOTA: (PUNTO DE PAUSA) El ágar de TSB puede almacenarse a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) entre usos y requiere recalentamiento antes de su uso en futuros experimentos.

5. Cultivo de placa de Petri por Pseudomonas Aeruginosa

  1. Fundir el agar en el microondas durante aproximadamente 5 minutos, o hasta que la solución esté líquida.
  2. Abre y desinfecta una superficie de armario de seguridad de clase II con solución de etanol al 70%, lista para su uso. Realiza todos los pasos siguientes en esta sección dentro de este gabinete de seguridad clase II.
  3. Mide 25 mL de solución de agar en un vial de 50 mL y viertelo en una placa de Petri de 90 mm, y espera a que el agar se solidifique.
  4. Recuperar los congelados de P. aeruginosa , PAO1 y PA14 del congelador a -80 °C. Coloca las reservas en la incubadora a 37 °C durante aproximadamente 5 minutos, o hasta que el contenido esté completamente descongelado.
  5. Sumerge el lazo de inoculación dentro de cualquiera de las poblaciones descongeladas de P. aeruginosa y extiende la muestra por el agar.
  6. Repite el paso 5.5 para la otra cepa de P. aeruginosa , creando dos cultivos separados de placas de Petri de P. aeruginosa , uno con la cepa PAO1 y otro con la cepa PA14.
  7. Etiqueta cada placa de Petri con la cepa de P. aeruginosa , la fecha de reactivación y las iniciales, y luego colócala en incubadora durante 16–18 horas a 37 °C.
    NOTA: (punto de pausa) Las placas de Petri de P. aeruginosa PAO1 y PA14 pueden almacenarse a 4 °C durante un periodo de almacenamiento de hasta 4 semanas y usarse para futuros experimentos.

6. Stocks de glicerol de Pseudomonas aeruginosa PAO1 y PA14

  1. Abre y desinfecta un armario de seguridad de clase II para su uso, selecciona ocho viales de 50 mL para contener los cultivos nocturnos.
  2. Utilizando el TSB previamente fabricado y el medio FAB citrato de sodio (sección 3), vierte 5 mL de medio TSB en cuatro de los ocho viales y el medio FAB mínimo de citrato de sodio en los cuatro restantes.
  3. Utilizando las placas de Petri previamente incubadas y un lazo de inoculación, toca cinco colonias separadas en la placa de Petri PAO1 de P. aeruginosa y transfiere a uno de los viales del TSB. Repite esto para el medio FAB de citrato de sodio y para la placa de Petri de la cepa P. aeruginosa PA14.
  4. Sumergir un lazo de inoculación limpio directamente en los cuatro frascos restantes de TSB y citrato de sodio para FAB, formando controles de control.
  5. Incubar los ocho viales en una incubadora agitada durante 16–18 horas a 200 RPM y 37 °C y marcar claramente.
  6. Recupera los viales de cultivo, asegúrate de que los inoculados con P. aeruginosa estén turbios y los usados como controles permanezcan limpios.
  7. Centrifugar los cuatro viales inoculados con P. aeruginosa a 4000 × g durante 5 minutos a 20 °C para separar P. aeruginosa del medio de cultivo. Asegúrate de que la centrífuga esté equilibrada.
  8. Ignorar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de P. aeruginosa tras centrifugación con 1 mL de solución que contiene 15% de glicerol, con 150 μL de glicerol y 850 μL de TSB fresco o FAB de citrato de sodio.
  9. Transfiere los cultivos resuspendidos a viales de 1 mL y colócallos en el congelador a -80 °C.
    NOTA: (punto de pausa) Las reservas de glicerol pueden almacenarse a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo y usarse en futuros experimentos.

7. Medición de la densidad óptica de cultivos nocturnos

  1. Repite los pasos 6.1–6.5, solo para dos viales de medios TSB, uno como control y otro con la cepa PAO1 P. aeruginosa .
  2. Pipetear 1 mL de medio TSB en un vial de espectrofotómetro de 1 mL, dentro de un armario de seguridad de clase II, y transferir 0,9 mL de medio TSB al segundo vial, complementando con 0,1 mL del cultivo nocturno.
  3. Ajusta el espectrofotómetro a una longitud de onda de luz de 600 nm y, utilizando el frasco del espectrofotómetro TSB de 1 mL para calibrar la máquina, mide la densidad óptica del vial de suspensión15 de 0,1 mL.
    1. Si la absorbancia medida no marca 0,1, recalcular el volumen de suspensión necesario.
      NOTA: El volumen de suspensión necesario para alcanzar una lectura de absorbancia de 0,1 (V1) puede calcularse utilizando la lectura inicial de absorbancia del vial de suspensión de 0,1 mL, C1, la absorbancia deseada a la que se ajusta la suspensión, C2, y el volumen de suspensión concentrada durante la noche deseado, V2:
      C1V1 = C2V2
      En el ejemplo anterior, si C1 = 3,59, C2 = 0,1 y V2 = 10 mL, el volumen de suspensión nocturna deseado sería 0,279 mL en una solución de 10 mL.
  4. Medir 10 mL de medio TSB en un vial de 50 mL y retirar el mismo volumen de medio TSB que el volumen de suspensión necesario para crear una suspensión de 10 mL 0,1 OD 600 nm. Usando el cultivo nocturno, añade el volumen de suspensión calculado y vórtice durante aproximadamente 5 s para mezclar.
  5. Transfiere 1 mL de la suspensión ajustada de 10 mL a un vial de espectrofotómetro y vuelve a medir la absorbancia para asegurarse de que es 0,1.
  6. Repita el anterior 7,1–7,5 para el medio PA14 y TSB, y para ambas cepas de P. aeruginosa y para el medio FAB de citrato de sodio.

8. Recuento celular viable

  1. TransfieredH 2Oa una placa de Petri cuadrada dentro de un armario de seguridad de clase II y utilice una pipeta multicanal para transferir 180 μL a las columnas 2–9 de una placa de poliestireno transparente de 96pozos 16.
  2. Transfiere la suspensión de 10 mL 0,1 OD 600 a una placa de Petri cuadrada separada y, usando la pipeta multicanal, transfiera 200 μL de la suspensión a la columna 1 de la placa de poliestireno de 96 pozos.
  3. Transfiere más de 20 μL de suspensión usando la pipeta multicanal desde la columna 1 de la placa de poliestireno de 96 pozos al canal 2, seguido de transferir 20 μL de suspensión diluida en el canal 2 al canal 3, repitiendo al canal nueve, creando diluciones de suspensión de 10-1 a 10-8.
  4. Transfiere 50 mL de agar TS (sección 4 y paso 5.1), en un armario de seguridad clase II usando un vial, a una placa de Petri cuadrada y déjalo hasta que el agar se vuelva turbio.
  5. Transfiere 10 μL de cada uno de los pozos a lo largo de las columnas 2–9 hasta la placa de Petri de agar TS en formación de columnas, utilizando una pipeta multicanal, asegurando que las columnas no estén en contacto entre sí.
  6. Incubar el agar TS durante 24 horas a 37 °C, tras esperar a que las diluciones transferidas se hayan estabilizado.
  7. Calcula las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (mL) determinando si la placa de Petri es numerable (entre 30 y 300 colonias).
  8. Determinar el factor de dilución de la suspensión de 10 mL utilizada; en este caso, la suspensión se diluyó a 1/10 (0,1 OD 600).
  9. Calcula los factores de dilución individuales de cada columna rechapada. Esta es la cantidad de suspensión diluida añadida a cada columna dividida por el volumen total de la columna después de añadir la suspensión. En el caso de la columna 2 de la placa de 96 pozos (columna 1 de la placa de Petri), 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Calcula el factor de dilución total de la serie multiplicando los factores de dilución individuales de cada columna.
    NOTA: En este caso, dado que se transfirieron 20 μL de cada columna a la siguiente, haciendo que el volumen total de cada pozo de columna fuera de 200 μL, cada dilución individual de la serie era 1/10. Haciendo que la dilución total de la serie sea 1 × 10-8.
  11. Determina el factor de dilución del chapado a medida que la dilución se transfiere de la placa de 96 pozos a la placa de Petri. Para determinar la UFC/mL, divide el volumen de cada columna enchapada (10 μL) por 1 mL. En este caso: figure-protocol-1.
  12. Determina el factor de dilución final multiplicando el factor de dilución de la suspensión original (0,1) por el factor de dilución total en serie (1 × 10-8) y el factor de dilución de la placa (figure-protocol-2).
  13. Calcula la CFU∙mL-1 en la muestra original, multiplica la UFC en la placa por el inverso del factor de dilución final.
    NOTA: En este caso, si se contaran 200 CFU, esto significaría realizar 200 × 1/1 × 10-8, lo que resultaría en que la CFU/mL fuera 2 × 1010 CFU∙mL-17.

9. Montaje del sistema microfluídico y ejecución experimental

  1. Inocular 5 mL de caldo de medio de cultivo con cada cepa de P. aeruginosa para formar un cultivo nocturno e incubar durante 16–18 horas a 37 °C.
  2. Configura el sistema microfluídico y el software asociado.
    1. Activa los componentes del sistema microfluídico en el siguiente orden: fuente de alimentación, controlador del sistema microfluídico, cámara CMOS, calentadores de carcasa, microscopio, ordenador y monitores asociados.
    2. Activa el software microfluídico e inicia la interfaz del módulo de control correspondiente introduciendo el código de barras multicanal asociado a la placa multicanal de 48 pozos 0–2 Pa cuando se le solicite, que se encuentra en el lateral de la placa multicanal.
  3. Establecer el procedimiento de inoculación multicanal de P. aeruginosa en pozo de placas.
    1. Ajusta la densidad óptica del cultivo nocturno a 0,1 OD600.
    2. Transfiere 50 μL de suspensión 0,1 OD 600 al pozo de salida de cada uno de los seis canales en paralelo dentro de un armario de seguridad de clase II.
      NOTA: Se ejecutaron seis canales en paralelo a la vez para maximizar la probabilidad de identificación anómala del resultado.
    3. Sustituye la tapa de placa multicanal de 48 pozos y transfierela a la plataforma móvil situada dentro del incubador del sistema y fijétala.
  4. Preparar el procedimiento de inoculación multicanal con P. Aeruginosa en canales de placas.
    1. Siembla los canales microfluídicos usando el módulo de control del sistema microfluídico seleccionando: Manual > Columnas 1–4 > Fluido: TSB a 37 °C > Cizalladura máxima (Pa): 0,1 (1 dina∙cm-2 = 0,1 Pa) y selecciona un pozo de salida del diagrama de placas multicanal 0–2 Pa de 48 pozos.
    2. Selecciona el botón de abortar para detener el flujo tras 2–4 s y deja la placa durante 30 minutos, para asegurarte de que las celdas se fijan al sustrato del canal antes de iniciar el flujo continuo.
      NOTA: Una duración de 30 minutos permite que la fuerza gravitatoria ayude a adherir la bacteria planctónica P. aeruginosa a la pared inferior del canal. Este tiempo varía según la bacteria y el tipo de medio nutritivo.
    3. Retirar la placa multicanal de la etapa de incubadora móvil y transferir 1 mL de TSB fresco al pozo de entrada de cada uno de los seis canales de un armario de seguridad de clase II.
    4. Transfiere la placa multicanal al escenario móvil dentro de la incubadora y fijala en su lugar.
  5. Configura AutoRun.
    1. Asegúrese de que el flujo utilizado durante los experimentos de 24 horas sea relevante para dónde se encuentra P. aeruginosa en la naturaleza, navegando a la tensión cortante manual de >: 0,01 Pa, y registrando el caudal volumétrico (μL⋅h-1) mostrado. Asegúrese de que este valor, para la placa de microcanal de 48 pozos, sea de 8,2 μL⋅h-1.
    2. Convierta el caudal volumétrico a m3∙s-1, calcule el área de la sección transversal del canal (m2) y determine la velocidad del flujo cuando se encuentra a una tensión de corte hidrodinámica de 0,01 Pa.
      NOTA: Utilizando y reorganizando la ecuación del caudal volumétrico del fluido, se puede calcular la velocidad del fluido a través del canal:
      figure-protocol-3
      Donde U es la velocidad del fluido (m∙s-1) y A es el área de la sección transversal del microcanal (m2) de los canales en la placa multicanal.
    3. Calcular el número de Reynolds del flujo utilizando la densidad, ρ, y la viscosidad dinámica, μ, del medio TSB, y asegúrate de que se encuentren biopelículas de P . aeruginosa dentro de un rango de flujo de fluido. Para un esfuerzo cortante hidrodinámico de 0,01 Pa, asegúrese de que el número de Reynolds sea 0,0117 y 0,0165 para medios TSB y FAB, respectivamente. Si está fuera de este rango, comprueba que las condiciones del fluido estén configuradas en TSB.
      figure-protocol-4
      Donde Dh es el diámetro hidráulico del microcanal utilizado, obtenido utilizando:
      figure-protocol-5
      Donde, w, y h, representan el ancho (m) y la altura (m) del microcanal utilizado.
    4. Calcula la longitud de desarrollo del fluido para asegurar que el flujo dentro de la región de adquisición de imagen esté completamente revelado.
      NOTA: La longitud de revelación para un fluido laminar a través de un canal puede calcularse usando el número de Reynolds, Re, y el diámetro hidráulico de los canales, Dh:
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Configurar el autoactivado: Editar AutoRun > Protocolo Configuración > duración del tiempo: 24 h, con una repetición de 1 y un esfuerzo cortante de 0,01 Pa. Guardar el protocolo.
    6. Crea una nueva secuencia en la pestaña de Configuración de Secuencias aplicando el protocolo recién creado con una repetición, a los canales 1–6 y selecciona fluido: TSB a 37 °C. Guarda esta secuencia.
  6. Configura la adquisición de imágenes usando la ventana de Adquisición Multidimensional .
    1. Selecciona Adquisición Multidimensional usando el software del sistema, luego el botón en vivo (abajo a la izquierda de la ventana de Adquisición Multidimensional ). Navega por la etapa del microscopio para ver los canales 1–6 usando el botón de vista en vivo y aumentos de cámara del 5× al 40× en la pantalla táctil del microscopio, mostrando un canal en el campo de visión de la cámara a la vez.
    2. Prepara la cámara para la adquisición de imágenes: Adquisición multidimensional > Guardado: selecciona un directorio para guardar las imágenes en > Timelapse: Duración: 24 h, la misma duración que el flujo hidrodinámico > Intervalo de tiempo: Tiempo entre cada imagen adquirida, fijado a 10 min.
    3. Introduce la configuración de la cámara seleccionando Longitud de onda > Iluminación: campo luminoso 50% cámara 50%: blanco y negro > exposición automática: cada adquisición > adquisición: cada momento > enfoque automático: nunca.
    4. Determina las posiciones de la cámara para capturar las imágenes de biofilm ajustando la ampliación a 20×, produciendo un campo de visión con dimensiones 665,6 μm × 665,6 μm y navega hasta el centro de la región de visualización del canal, donde el número del canal quedará grabado en el centro.
    5. Añade la posición del escenario para que la cámara la capture, navega a Escenario , etiqueta la posición y selecciona el botón de añadir para añadirlo al directorio.
      1. Repita esto para los puntos aguas arriba a 0,9984 mm y los puntos aguas abajo a 3,00¹⁹ mm de la entrada de la región de visión del canal, donde la posición representa el punto medio del campo de visión de la cámara.
        NOTA: Estas posiciones de imagen fueron seleccionadas para proporcionar representaciones del crecimiento de biofilm a lo largo de la región de observación, asegurando al mismo tiempo que el flujo interno esté completamente desarrollado. Esto da como resultado que se adquieran tres imágenes por cada microcanal, en este caso, lo que resulta en 18 imágenes tomadas cada 10 minutos.
  7. Realizar la prueba experimental
    1. En la ventana del módulo de control del sistema selecciona AutoRun > Run Setup > Sequence: selecciona la secuencia 0.01 Pa creada y luego selecciona iniciar.
    2. Inmediatamente después, navega a la ventana de Adquisición Multidimensional > Adquirir. Esto inicia la adquisición de las 18 imágenes cada 10 minutos del procedimiento experimental de 24 horas, produciendo 2610 imágenes cuando el experimento termina.
      NOTA: La sección anterior se reprodujo en seis microcanales adicionales aproximadamente 48 horas después del experimento inicial con condiciones idénticas.

10. Acumulación de pila Z

  1. Al final de cada prueba experimental, selecciona tres canales y obtén pilas z de tres secciones a lo largo de ellos con aumento de 40×, abriendo la Adquisición Multidimensional > Principal: desmarca todas las opciones excepto 'Serie Z'.
  2. Navega a la serie Z después de que se haya seleccionado una sección a lo largo de un canal dentro de Adquisición Multidimensional y modifica > Configuración interactiva: Incremento: 0,5 y desmarca ambas casillas.
  3. Utiliza el botón de enfoque del microscopio y gíralo hasta que la biopelícula se desenfoque, e introduce la distancia z seleccionando Ajustar Arriba a Corriente. Repite este procedimiento, pero girando el mando de enfoque en dirección opuesta y seleccionando Establecer Fondo a Corriente. Esto le da al microscopio el alcance para capturar la pila z.
  4. Selecciona una carpeta dentro de la ventana de Guardado para guardar la pila z y selecciona Adquirir en la parte inferior derecha de la ventana para comenzar la adquisición.

11. Análisis de imágenes y datos tras el experimento

  1. Obtén datos de porcentaje de cobertura de superficie de biofilm.
    1. Carga las imágenes adquiridas en el software del sistema eligiendo: Herramientas de análisis > Revisa datos multidimensionales > Selecciona archivo base > Selecciona Directorio: navega y selecciona la carpeta con las imágenes guardadas > Ver > Longitud de onda 1, y en la sección central cuadrada que muestra horizontalmente el número de imágenes adquiridas, haz clic derecho en el pequeño cuadro gris en la parte superior, esquina izquierda.
    2. Carga las imágenes de cada sección de canal, una a una, elige Posición del escenario: selecciona la posición para ver > Carga imagen(es). Guarda la serie de imágenes como un archivo TIFF.
    3. Umbraliza la imagen seleccionando Imagen Umbral > Umbral Automático para Objetos Oscuros que resaltan la biopelícula, y luego bordea la imagen usando la herramienta Región Rectangular .
      NOTA: El deslizador en el lado izquierdo de la imagen con umbral puede moverse hacia arriba o hacia abajo para alterar la intensidad del umbral y así diferenciar mejor entre biofilm y fondo. Si la imagen tiene sombras, bordea la sección sin ellas, ya que las sombras pueden haber sido resaltadas por defecto, alterando los valores de medición.
    4. Obtén datos sobre el porcentaje de cobertura superficial del biofilm en la imagen durante el experimento de 24 horas seleccionando las Mediciones de Región >> Medida Estándar MM en la ventana del software del sistema para generar una tabla de datos sobre el biofilm resaltado dentro del borde rectangular, incluyendo el Área Umbral %. Selecciona Abrir registro para abrir y guardar un archivo de registro y F9: Datos de registro para introducir los datos en el archivo de registro.
    5. Abre una hoja de cálculo y, usando los datos de biofilm de 24 horas para cada sección de canal, crea un gráfico que muestre el porcentaje de cobertura de superficie de biofilm durante 24 horas.
  2. Obtén el grosor del biofilm y la rugosidad media aritmética de la superficie.
    1. Guardé la pila z en Fiji (ImageJ) arrastrando el archivo guardado a la barra de control de Fiji y convirtiéndolo a una imagen de 8 bits: Tipo > imagen > 8 bits.
    2. Aumenta el contraste entre la biopelícula y la superficie del canal para eliminar cualquier ruido no deseado: Imagen > Ajustar > brillo/contraste.
    3. Umbral de la imagen, ajustando el valor del píxel de biofilm en 255 (blanco) y el valor del píxel de fondo en 0 (negro): Imagen > Ajustar > umbral.
    4. Ajusta la escala de la imagen, analiza > Ajusta la escala > distancia en píxeles: 2048 > Distancia conocida: 332,8 > Relación de aspecto del píxel: 1,0 > Unidad de longitud: μm.
      NOTA: La distancia conocida es de 332,8 μm, ya que la cámara Hamamatsu utilizada tiene un campo de visión de 2048 × 2048 píxeles, con cada píxel de 6,5 μm y las imágenes tomadas con una ampliación de 40 ×.
    5. Analizar la pila Z usando una macropersonalizada 18 (Archivo Suplementario 1) que calcula y suma el área superficial de la biopelícula en cada corte de la pila z y utiliza los valores de la escala de entrada para calcular el grosor de la serie, permitiendo encontrar el volumen. Alternativamente, se puede encontrar el grosor de la biopelícula dividiendo el volumen calculado por la superficie de la superficie.
    6. Obtén los valores medios aritméticos de rugosidad superficial de la biopelícula de cada serie z descargando el plugin SurfCharJ de ImageJ (no Fiji) y guárdalo en la carpeta de plugins .
    7. Sube la pila z a ImageJ arrastrando la pila guardada a la barra de control y convirtiéndola a una imagen de 32 bits: Tipo de > de imagen: 32 bits.
    8. Crea un gráfico de superficie, mostrando la variación en los valores de gris a lo largo de la superficie de la pila: Analiza > perfil de gráfico > más: Gráfico de alta resolución. Convierte el gráfico de alta resolución a 32 bits.
    9. Obtén el valor medio aritmético de rugosidad superficial iniciando el plugin SurfCharJ: Plugins > SurfCharJ > Cálculo de rugosidad: Longitud media de muestreo (): 10.
      NOTA: El plugin SurfCharJ utiliza los distintos valores grises a lo largo de la superficie de la pila z para calcular la rugosidad media aritmética de la superficie. Se producirá una tabla que contiene parámetros de rugosidad superficial; el único parámetro de interés es la aritmética media de rugosidad superficial, Ra. Los valores de la tabla tendrán que convertirse a micrómetros desde los píxeles.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta sección describe los resultados representativos al aplicar el procedimiento del protocolo anterior. Todos los experimentos se realizaron con al menos tres réplicas biológicas independientes, cada una compuesta por seis canales paralelos, y los datos se presentan como media ± desviación estándar. Las barras de error en todos los grafos representan la desviación estándar, tal como se define en las leyendas de las figuras.

El crecimiento de las deformaciones...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los varios pasos críticos que en conjunto conforman este protocolo permiten un análisis más completo y preciso de la formación de biopelículas que los métodos alternativos y más tradicionales. Un componente clave es el uso de una placa de microcanales de 48 pozos, con canales a microescala de dimensiones 350 μm × 70 μm × 4 mm (Ancho × H × L). Estas dimensiones replican específicamente las condiciones de flujo y los microambientes que se encuentran en entornos hospitalarios, como catétere...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean agradecer a la Escuela de Ingeniería Mecánica, Aeroespacial y Civil (MAC) de la Universidad de Sheffield por la financiación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Para medium FAB modificado
Placa microcanal 0-2 de 48 polos - cubierta de vidrioMicrosistemas celulares910-0047-5PackMicrocanales para el flujo de medios y el crecimiento de biofilm
con imágenes en tiempo real
-80 ºC; C FreezerThermo Fisher Scientific1.16057E+15Para almacenar stocks de glicerol hasta su uso adicional
Agar, grado bacteriológicoAcros Organics443570010Para placas de agar - cultivo de bacterias
Balance analíticoVWRVWRI611-2297Para medir componentes de los medios utilizados
AutoclavePriorclave4304Esterilizar cristalería
BioFlux 1000HTI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsistemas/dispositivo/bioflux-1000ht-
sistema de flujo de cizallamiento/ 		Para experimentos de flujo en microcanales y crecimiento de biofilm
Módulo de Control BioFluxI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
microsistemas/dispositivo/bioflux-1000ht- sistema de flujo de cizallamiento/ 		Establecer y monitorizar el flujo de medios y el crecimiento de biopelículas dentro de los microcanales
Software de montaje BioFluxI& L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Establecer y monitorizar el flujo de medios y el crecimiento de biopelículas dentro de los microcanales
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Para medium FAB modificado
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Para 1 L de solución de metal mínimo
Placa de poliestireno transparente de 96 pozosCorning, coprotagonistaCLS7007Para el recuento celular viable
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Para 1 L de solución de metal mínimo
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GPara 1 L de solución de metal mínimo
Válvulas Eppendorf 3810XEppendorf30125150Para las existencias de glicerol de P. aeruginosa
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EPara 1 L de solución de metal mínimo
Fiyi (ImagenJ)Institutos Nacionales de Saludhttps://imagej.net/software/fiji/downloa
ds		Procesamiento de imágenes Z-stack
GlucosaSigma-Aldrich50-99-7Para el FAB Medium modificado con glucosa
GlicerolSigma-Aldrich56-81-5Para las existencias de glicerol de P. aeruginosa
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Para 1 L de solución de metal mínimo
Cámara Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Modelo C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UPara el experimento de flujo de microcanales y crecimiento de biofilmes
KH2PO4Biorreactivos de Fisher7778-77-04Para medium FAB modificado
Espíritu metiladoSigma-Aldrich2857Para limpiar el armario de microbiología antes y después < br/> uso
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GPara medium FAB modificado
Gabinete de Microbiología Clase IIThermo Fisher Scientific42111226Llevar a cabo los pasos del protocolo sin
bacterias contaminantes, caldo o agar
Mini incubadoraLabnet InternationalSN03171014Para descongelar PAO1 y PA14 después de -80 ºC; Congelador C y
para el crecimiento inicial de placas de agar bacteriano a las 24 horas
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-5Para 1 L de solución de metal mínimo
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Para medium FAB modificado
NaClSigma-AldrichS5886-500GPara medium FAB modificado
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-6Para 1 L de solución de metal mínimo
Equilibrio de precisiónVWRVWRI611-2299Para medir componentes de los medios utilizados
Centrífuga refrigeradaHeraeus40289841Separación del cultivo de P. aeruginosa de
sobrenadante para stocks de glicerol
Cuvetas semi-microLaboratorios AlphaX72053Para mediciones de densidad óptica
Incubadora de AgitaciónINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- agitadores/multitron-estándarPara las culturas nocturnas
Citrato de sodioSigma-Aldrich71498-250GPara el medio FAB modificado con citrato de sodio
Anillos de inoculación plástica estérilesMicroespecificación15782105Para P. aeruginosa, la inoculación de PAO1 y PA14 en placas de agar y tubos de halcón
Agar de soja tríptico, vegitoneMillipore14432-500G-FPara placas de agar - cultivo de bacterias
Caldo de soja trípticoSigma-AldrichT8907Medios de cultivo deshidratados - 6 g/200 mL
Dispensador de agua Tipo 1Thermo Fisher ScientificSN42103311Para agua distiled
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Para 1 L de solución de metal mínimo

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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