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Artículo de método

Un modelo de lesión térmica por radiofrecuencia monopolar en el nervio ciático en ratones

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DOI:

10.3791/69998

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3 de abril de 2026

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1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2National Medical Center for Neurological Diseases, 3National Clinical Research Center for Geriatric Diseases

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este estudio aplicó sistemas de radiofrecuencia a los nervios ciáticos de ratones, estableciendo un modelo de ablación por radiofrecuencia de la lesión del nervio térmico. Este enfoque resuelve cuestiones de controlabilidad en modelos de lesión térmica de nervios periféricos en ratones, proporcionando un método práctico de modelado para la investigación sobre la reparación de lesiones nerviosas y el dolor neuropático.

Resumen

La lesión nerviosa periférica suele provocar dolor neuropático y desencadena procesos de reparación nerviosa. Aunque los modelos de lesiones físicas controlables están ahora bien establecidos, los modelos existentes de lesiones térmicas siguen siendo exploratorios y muestran poca controlabilidad. En la práctica clínica, los sistemas de ablación por radiofrecuencia (RFA) se emplean frecuentemente para inducir daño térmico en tejidos y nervios. La RFA es una modalidad terapéutica que ha demostrado bloquear eficazmente la transmisión del dolor induciendo daño térmico en los nervios. La extensión de la ablación puede modificarse ajustando parámetros específicos, así como el grado de entumecimiento y disfunción motora en la zona de distribución nerviosa afectada. Este estudio utilizó un sistema de radiofrecuencia monopolar para crear un modelo estable y controlable de lesión nerviosa en el nervio ciático de ratones, aplicando 75°C durante 30 segundos. Se observó un aumento significativo en el umbral de retirada mecánica (MWT) entre los días 7 y 14 tras la cirugía, con recuperación que ocurre en el día 28. Esta investigación aborda la actual brecha en los modelos de lesión nerviosa por RFA, replica el daño nervioso observado clínicamente tras procedimientos de RFA y proporciona un marco metodológico para estudios posteriores sobre lesiones nerviosas inducidas por RFA.

Introducción

El dolor neuropático presenta desafíos continuos en el manejo clínico, ya que sus mecanismos del dolor continúan siendo investigados. Para estudiar los mecanismos moleculares y celulares del dolor neuropático, la ligadura nerviosa espinal (SNL)1, la lesión por constricción crónica (CCI)2, la ligadura parcial del nervio ciático (pSNL)3, la transección del nervio ciático (SNT)4 y la lesión nerviosa salvada (SNI)5 se han utilizado con éxito en roedores para simular lesiones nerviosas físicas periféricas. Para mejorar la controlabilidad y estabilidad del modelo, estudios previos propusieron mejoras, como manómetros y daños selectivos, que ya se han implementado.

Aunque la tecnología de radiofrecuencia ha dado resultados clínicos favorables, también está asociada a varios efectos secundarios. Por ejemplo, la ablación por radiofrecuencia (RFA), que se utiliza para la hemostasia durante la cirugía6, puede causar daños térmicos en los tejidos circundantes y suponer un riesgo de lesión térmica en los nervios periféricos debido a la alta temperatura de la punta delinstrumento 7. Además, la RFA para tratar la neuralgia deltrigémino 8, la neuralgia posherpética9 y otras afecciones neuropáticas del dolor reducen el dolor primario tras la cirugía, pero van acompañadas de entumecimiento postoperatorio prolongado en la zona inervada, hiperalgesia superficial y otras molestias10,11. En consecuencia, la investigación sobre la lesión térmica de los nervios periféricos ha ido ganando atención gradualmente. Sin embargo, los modelos animales existentes carecen de la capacidad de controlar con precisión la temperatura, duración y localización de la lesión térmica, limitando así la uniformidad en la gravedad de la lesión.

Estudios previos han utilizado varillas conductoras de calor conectadas a un baño de aguade temperatura constante 12 o una bomba de agua caliente para inyectar agua caliente en un tubo de goma en contacto directo con elnervio 13, con el objetivo de simular los efectos térmicos de la RFA en la lesión nerviosa. Sin embargo, modelos anteriores de lesión térmica solo habían inducido daño térmico, eliminando así la influencia de la corriente de radiofrecuencia y sus parámetros sobre los nervios. Queda por explorar si el daño causado por la RFA se debe únicamente a efectos térmicos, o si factores como los cambios en los parámetros de radiofrecuencia también ejercen efectos distintos sobre los nervios. La actual falta de modelos animales que empleen directamente sistemas de coagulación térmica por radiofrecuencia para lesiones nerviosas dificulta el avance de la investigación sobre el daño nervioso asociado a la RFA. Este estudio utilizó directamente un sistema de RFA monopolar para simular la lesión nerviosa asociada a procedimientos de RFA en entornos clínicos, induciendo una lesión por RFA en los nervios ciáticos de ratones. Proporciona una referencia metodológica para la investigación básica sobre la lesión por RFA en los nervios periféricos.

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Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Experimental de Animales, Hospital Xuanwu, Universidad Médica de la Capital, y se realizaron de acuerdo con la Guía NIH para el Cuidado y Uso de Animales deLaboratorio 14. Los ratones adultos machos C57BL/6 (8–10 semanas, 20–25 g) fueron alojados en grupo (4–5 por jaula) bajo condiciones ambientales controladas (22 ± 2 °C, 50%–60% de humedad, ciclo claro/oscuro de 12 horas con luces encendidas a las 07:00) con acceso improvisado a comida y agua estándar para roedores. Todas las evaluaciones de comportamiento se realizaron durante la fase de luz, entre las 08:00 y las 12:00. Los detalles de los reactivos, software y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Anestesia y preparación de ratones

  1. Anestesiar ratones mediante inyección intraperitoneal de una solución de tribromoetanol de 20 mg/mL a una dosis de 0,2 mL por cada 10 g de peso corporal.
  2. Cubre ambos ojos con un ungüento oftálmico usando un aplicador de algodón.
  3. Coloca a los ratones en la posición lateral izquierda. Elimina el vello del lado derecho del cuerpo (zona de 1 cm × 1 cm) con una maquinilla eléctrica (Figura 1).
    NOTA: Este paso aumenta el área de contacto entre el torso y la placa negativa del circuito para facilitar la reducción de la resistencia del circuito.
  4. Coloca parte del torso del ratón en contacto con la placa metálica del electrodo negativo en orientación lateral derecha. Aplicar varias gotas de líquido iónico (0,9% de NaCl o solución de Ringer modificada; véase la Tabla de materiales para la composición) en la zona de contacto entre el torso y la placa para mejorar la conductividad eléctrica.
    NOTA: Asegúrese de que la cabeza y la cara permanezcan fuera de la placa negativa para evitar una exposición no intencionada a los ojos u otros órganos.
  5. Asegura la extremidad trasera izquierda en posición hacia arriba con la rodilla flexionada usando cinta adhesiva sobre la placa del electrodo negativo. Retira el vello de la zona izquierda del muslo y desinfecta el lugar quirúrgico tres veces con etanol al 75%.
  6. Confirma la profundidad adecuada de anestesia antes de proceder, verificando la ausencia de respuesta de retirada a un estímulo de pellizco aplicado en la extremidad posterior o la cola.
    NOTA: Evite administrar anestésicos locales (por ejemplo, lidocaína) o antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, paracetamol) durante el periodo perioperatorio, ya que estos agentes pueden influir en las evaluaciones neuroconductuales postoperatorias.

2. Cirugía de ablación por radiofrecuencia

  1. Usa el fémur como referencia. Utiliza microtijeras para cortar una incisión cutánea de 1 cm en dirección al eje largo del fémur, con una traslación lateral de 0,5 cm hacia el lado caudal (Figura 2).
  2. Disecciona de forma directa el músculo bíceps femoral (BFM) a lo largo de la incisión cutánea y busca el tronco principal del nervio ciático usando micropinzas. El nervio ciático se bifurca cerca de la articulación de la rodilla (Figura 3).
  3. Utiliza micropinzas para diseccionar el tronco del nervio ciático desde el tejido circundante aproximadamente 2 mm por encima de la bifurcación del nervio ciático, hasta una longitud de aproximadamente 5 mm. Evita lesiones en los vasos sanguíneos durante la separación roma.
    NOTA: En caso de lesión vascular accidental, utilice un hisopo de algodón estéril para absorber la sangre y aplicar la presión adecuada para detener la hemorragia. Continúa la operación después de que no haya filtraciones de sangre posteriores.
  4. Conecta la aguja de coagulación RFA al dispositivo de tratamiento por radiofrecuencia. Coloca la punta de la aguja plana sobre el tejido muscular para comprobar la resistencia. Si la resistencia es superior a 1 kΩ, se añade líquido iónico entre el cuerpo del ratón y la placa negativa usando un cuentagotas hasta que la resistencia baje de 1 kΩ.
  5. Levanta suavemente el nervio ciático separado con una aguja de cristal para los minutos. Colocar la aguja RFA debajo del nervio ciático, con la punta metálica expuesta situada a 3 mm de la bifurcación del nervio ciático (Figura 4).
  6. Establece los parámetros del instrumento terapéutico de radiofrecuencia de la siguiente manera: modo de coagulación térmica, 75 °C, 30 s, frecuencia de 2 Hz y ancho de pulso de 1 ms. Activa la entrega de energía RFA.
  7. Retira la aguja RFA con cuidado. Reposiciona el nervio ciático con pinzas para levantar el tejido muscular. Cierra el músculo con sutura de ácido poliglicólico absorbible 6-0 (PGA). Cierra la incisión cutánea con sutura PGA absorbible 4-0.
  8. Después de la cirugía, coloca a los ratones sobre una manta de agua tibia circulante (38 °C) o una almohadilla térmica controlada por termostática (37–38 °C) cubierta con papel higiénico o una toalla para que el pelo se seque y evitar daños directos causados por el calor.
  9. Devuelven los ratones a la jaula y esperan a que se recuperen de la anestesia. Revisa y revisa diariamente la integridad de las incisiones, y controla la ingesta de alimentos, el consumo de agua y el estado general del cuerpo.

3. Grupo experimental

  1. Grupo RFA: Realizar el protocolo completo de cirugía RFA tal como se describe en los pasos 2.1–2.9.
  2. Grupo simulado: Realizar procedimientos idénticos a los del grupo RFA (pasos 2.1–2.5 y 2.7–2.9), pero no activar la entrega del sistema RFA en el paso 2.6. Mantén la aguja RFA en posición debajo del nervio ciático durante 30 segundos sin activación actual, y luego procede al paso 2.7.
    NOTA: El grupo Sham controla el traumatismo quirúrgico, la anestesia, la manipulación nerviosa y la colocación de agujas de forma independiente a la lesión térmica.

4. Evaluación de Von Frey para MWT

  1. Antes de cada prueba, coloca los ratones aleatoriamente en la plataforma de prueba von Frey. Permite la aclimatación durante 15 minutos hasta que cese el comportamiento exploratorio.
    NOTA: La plataforma consta de una malla metálica con orificios de 0,6 cm × 0,6 cm en la parte inferior y varios recipientes transparentes rojos para los ratones, que se colocan en diferentes recipientes sin interferir entre sí.
  2. Realiza la evaluación de von Frey usando el método arriba-abajo15. Aplica el alambre de fibra von Frey para estimular la parte media de la suela de la pata trasera izquierda con suficiente fuerza para provocar una ligera flexión. Espera durante 3 segundos o hasta que se produzca una respuesta deretirada 16.
    NOTA: Comienza a probar con el filamento de 0,4 g. Aplica el siguiente filamento más alto tras una respuesta negativa, o el siguiente filamento inferior tras una respuesta positiva. Continúa con cuatro solicitudes adicionales tras el primer cambio de dirección. En la práctica, el filamento de 2 g se estableció como el límite superior en este estudio porque a esta fuerza, la fibra de von Frey levantaba la pata delantera del suelo sin mostrar respuestas de escape o retirada.
  3. Registrar respuestas y calcular el 50% MWT usando la calculadora del método arriba-abajo (método Arriba-abajo para experimentos de von Frey, https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/).
  4. Realizar pruebas de von Frey en la línea inicial (preoperatoria) y en los días 7, 14, 21, 28 y 35 postoperatorios.

5. Recogida de tejido con DRG y tinción por inmunofluorescencia

  1. En el día 7 postoperatorio, recoger DRG L4–L6 de los grupos RFA y Sham.
  2. Fijar los tejidos con 10% de sacarosa-paraformaldehído a 4 °C durante 6–12 horas.
  3. Crioprotege los tejidos en un 30% de sacarosa-PBS a 4 °C durante la noche.
  4. Incrusta los tejidos en el compuesto de temperatura de corteóptima 17.
  5. Cortar criosecciones de 13 μm y permeabilizar las secciones con un tensioactivo no iónico.
  6. Bloquear con un reactivo bloqueador e incubar durante la noche con el anticuerpo policlonal a 4 °C.
  7. Después del lavado, incubar con el anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente.
  8. Monta con medio antifade.

6. Análisis estadístico

  1. Presentar datos continuos distribuidos normalmente como media ± error estándar de la media (SEM).
  2. Realiza comparaciones entre grupos utilizando la prueba t de muestras independientes.
  3. Analizar comparaciones dentro del grupo a través de diferentes puntos temporales utilizando el análisis de varianza con medidas repetidas (ANOVA).
  4. Aplica la corrección de Bonferroni para comparaciones por pares a posteriori.
  5. Procesa todos los datos usando un software estadístico y establece la significación estadística en P < 0,05.

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Resultados

El establecimiento exitoso del modelo fue confirmado tanto por indicadores intraoperatorios como postoperatorios. Al finalizar la RFA (75 °C, 30 s), se observó una leve adherencia entre la punta de la aguja de la RFA y el nervio ciático al retirarse. Esta adhesión resulta de una desnaturalización localizada de proteínas y coagulación en el lugar de contacto y sugiere una entrega adecuada de energía térmica junto con un contacto directo con los nervios. La ausencia de adherencia puede ind...

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Discusión

Con el rápido desarrollo de la cirugía mínimamente invasiva, la tecnología de radiofrecuencia se ha extendidocada vez más 6,7,18. A medida que la tecnología de radiofrecuencia ha avanzado en la práctica clínica, la investigación relacionada ha facilitado su adopción más amplia. Sin embargo, los efectos de la corriente de radiofrecuencia en el tejido requieren una investigación adicional, especia...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo del Programa de Convergencia de Talento (HZ2025PYDTR009) del Hospital Xuanwu y los Fondos de Capital para la Mejora y la Investigación en Salud (2-CFH2024-2011).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sutura 4-0Jinhuan MedicalC412Cierra la piel
Sutura 6-0Jinhuan MedicalKCR631Cierra la capa muscular
Anticuerpo secundario Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008Anticuerpo secundario
Anticuerpo policlonal de conejo ATF3Novus BiologicalsNBP1-85816Anticuerpo policlonal
Pinzas finas curvasBeyotime BiotecnologíaFS031Corte muscular y fascia
Medio de montaje antifade DAPIBeyotime BiotecnologíaP0131Medio antifade
Manecilla de los minutos de cristalYuyan InstrumentsBLFZ10Levanta el nervio
GraphPad PrismGraphpad Software, LLCVersión 9.0Imágenes de datos de salida
Micro TijerasBeyotime BiotecnologíaFS217Incisión cutánea cortada
Solución de Ringer modificado sAuto-preparadoN/ALactato sódico 3,10 g/L; NaCl 6,00 g/L; KCl 0,30 g/L; CaCl2 y middot; 2H2O 0,20 g/L
PortaagujasYuyan InstrumentsY32010Sujeta agujas
Solución de bloqueo QuickBlockBeyotime BiotecnologíaP0260Reactivo bloqueante para inmunofluorescencia
Dispositivo terapéutico de radiofrecuenciaCosman MedicalRFG-1ASistema de radiofrecuencia
Trocar electrodo termocoagulante de radiofrecuenciaCosman MedicalTCD-10Aguja RF aislante
Inyección de Ringer de lactato sódicoSichuan  Kelun  Pharmaceutical Co.,   Ltd86902180001566Líquido iónico para reducir la resistencia
Estadísticas de SPSSIBM CorpVersión 27.0Software de análisis estadístico
Pinzas finas rectasBeyotime BiotecnologíaFS027Corte muscular y fascia
Cable de fibra de Von FreyDanmic GlobalAesthesio Semmes-WeinsteinPrueba de comportamiento

Referencias

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