Este protocolo describe el método para establecer el ensayo de formación de la mamosfera para estudiar el cáncer inducido por inhibidor de la apoptosis 5 (Api5) en células epiteliales mamarias no tumorígenas. Los lisados recogidos de mamósferas de generación primaria se analizan en busca de diferentes marcadores de tallo para evaluar la inducción de propiedades similares a las de células madre.
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Artículo de método
El ensayo de mamosera revela el tallo inducido por Api5 en líneas celulares epiteliales mamarias no tumorígenas
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Resumen
Resumen
El cáncer de mama sigue siendo el más prevalente entre las mujeres a nivel mundial, con las tasas de incidencia y mortalidad estandarizadas por edad más altas. A pesar de los avances en terapias dirigidas al cáncer de mama, el 20% de las pacientes presentan recaídas de la enfermedad, lo que puede atribuirse a una población de células madre cancerosas (CSC) resistentes a la terapia. Estos CSC pueden sobrevivir a tratamientos convencionales permaneciendo en una fase de reposo o persistir debido a una resección incompleta de la masa tumoral, lo que puede provocar recurrencia en una fase posterior. Por ello, investigaciones recientes se han centrado en identificar, aislar y dirigirse a esta población resistente de células. In vitro, el ensayo de formación de la mamosfera actúa como un robusto sistema de cultivo en suspensión tridimensional para enriquecer y propagar células madre similares a las poblaciones epiteliales mamarias. Aquí presentamos un enfoque utilizando el ensayo de la mamósfera para evaluar el fenotipo similar a las células madre cancerosas que es habilitado en células epiteliales mamarias no tumorígenas por la sobreexpresión del inhibidor de la apoptosis 5 (Api5). El protocolo consiste en propagar mamoesferas a través de pasajes seriados para evaluar la eficiencia de formación de mamosíferas y su capacidad de autorrenovación. Además, se examinan lisados proteicos recogidos de mamoesferas en busca de marcadores de tallo establecidos mediante inmunoabsorción. Este ensayo permite investigar nuevos reguladores, como Api5, de propiedades similares a células madre cancerosas en poblaciones de células epiteliales mamarias. El enfoque descrito puede adaptarse para estudios comparativos de intervenciones moleculares o para el cribado de agentes terapéuticos dirigidos a CSC in vitro.
Introducción
El aumento de cánceres de mama resistentes a la quimioterapia ha llevado a un mayor énfasis en identificar y atacar la causa subyacente de la resistencia a la terapia y la recaída, una población de células cancerosas conocida como células madre cancerosas. Estas células se caracterizan por su capacidad para evadir la diferenciación y permanecer inmóviles, lo que les permite resistir diferentes modalidades de tratamiento delcáncer 1,2. Se pueden emplear varios métodos para identificar células madre del cáncer de mama, incluyendo el ensayo de formación de lamamoósfera 3,4,5, la clasificación celular basada en marcadores superficialescelulares 6,7, el aislamiento basado en propiedades de efluxo, ensayos in vivo de tumorigenicidade7 y la evaluación de moduladores nucleares de células madre como Oct48, Nanog 9, Sox210 yBMI 11. Normalmente, identificar y aislar células madre cancerosas implica una combinación de uno o más de estos enfoques.
El inhibidor de la apoptosis 5 (Api5) es una proteína antiapoptótica que se ha encontrado que está regulada al alza en varios cánceres, incluyendo el cáncer de mama 12,13,14, el cáncer de cuello uterino 15,16,17, la leucemia linfoide crónicade células B 18 y el cáncer de pulmón no de células pequeñas 19. Se ha encontrado que niveles altos de Api5 están asociados con resistencia a la quimioterapia en el cuellouterino 16 y cáncer de mama triple negativoen el 12. Cada vez hay más evidencia de que la resistencia a la terapia y la recaída suelen estar impulsadas por células madrecancerosas 20,21. Un estudio interesante de Song et al.22 reveló que la sobreexpresión de Api5 en las células cancerosas de cuello uterino provoca niveles elevados de Narag, contribuyendo a un aumento de la presencia del cáncer. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que la sobreexpresión de Api5 conduce a la transformación de células epiteliales mamarias no tumorígenas cultivadas en cultivos 3D soportados con Matrigel. Estas células transformadas presentan polaridad alterada, aumento de la proliferación, crecimiento independiente del anclaje y un fenotipo parcial similar a la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT). Los cambios fenotípicos observados tras la sobreexpresión de Api5 en cultivos 3D se mantuvieron tras disociar los esferoides en cultivos monocapa14. Dado que Api5 está aumentado en cánceres de mama triple negativos resistentes a la quimioterapia, especulamos que Api5 también podría regular las propiedades de la formación de cáncer en células epiteliales mamarias.
En este contexto, describimos el ensayo de formación de la mamosfera para identificar células madre cancerosas a partir de células epiteliales mamarias disociadas no tumorígenas en 3D transformadas por la sobreexpresión de Api5, seguido de un blot occidental para marcar las células madre y así confirmar la identidad de estas células. El ensayo de mamosfera consiste en cultivar células epiteliales mamarias bajo condiciones no adherentes y no diferenciadas, lo que permite el enriquecimiento de células progenitoras o de forma tallo/progenitora en estructuras tridimensionales conocidas como mamósferas. Las células epiteliales mamarias que no poseen propiedades similares a las de los tallos suelen sufrir anoikis; sin embargo, las células con características similares a las de tallo dan lugar amamosferas 4,5. Este método fue desarrollado originalmente por Dontu etal 3 y se inspira en el ensayo de neurosfera, que se utiliza para estudiar e identificar células madre neuronales y progenitores23. El ensayo de la mamósfera descrito aquí permite evaluar la actividad de las células madre y la capacidad de autorrenovación en medios mínimos suplementados con B27 sin vitamina A y factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF). Las células disociadas 3D que sobreexpresan Api5 se siembran de forma escasa en placas recubiertas de poli(2-hidroxietilmetacrilato) (pHEMA). Esto permite que las células crezcan en condiciones no adherentes, de modo que cada mamosfera posterior sea de origen clonal. Las mamósferas se dejan crecer hasta el séptimo día, tras lo cual se calcula la eficiencia de la formación de la mamosfera. Para distinguir las verdaderas células madre de las no células madre que pierden su capacidad proliferativa con el tiempo, se realizan generaciones posteriores de formación de mamosfera. El paso serial de mamosferas implica disociar las esferas recogidas de la generación primaria y replantar las células individuales para formar mamósferas de generación secundaria (y posterior). Esto determina si las células pueden iniciar la formación de esferas repetidamente y se cuantifica como la capacidad de autorrenovación de lasceldas 5.
Este método puede utilizarse para identificar células madre del cáncer de mama en células epiteliales tumorígenas o transformadas. El método también puede adaptarse para aislar células madre del cáncer de mama a partir de muestras de pacientes. El sistema puede ayudar a identificar nuevos objetivos contra las células madre del cáncer de mama que podrían estar asociadas con la resistencia a la quimioterapia.
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Protocolo
1. Recubrimiento de placas de cultivo de tejidos con poli(2-hidroxietilmetacrilato), pHEMA
- Disolver 1,2 g de pHEMA (peso molecular ̴ 300.000) en 100 mL de etanol al 95% removiendo constantemente a 65 °C para preparar una solución de pHEMA al 1,2% (véase Tabla de Materiales).
- Recubre las placas estándar de cultivo de tejidos con pHEMA aplicando 1 mL por pozo de una placa de 6 pozos. El volumen de la solución de pHEMA puede ajustarse en función del tamaño del vaso de cultivo tisular.
- Deja que los platos se sequen en un horno a 40 °C en condiciones estériles.
- Expone las placas a la luz ultravioleta durante 15 minutos, seguidas de tres lavados con la solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, antes de usarlas para preparar el ensayo de formación de la mamosfera.
2. Siembra de mamósferas de generación primaria
- Cultivo de células MCF10A disociadas en 3D (control y sobreexpresión de Api5) obtenido disociando cultivos 3D del día 16 en el mediode crecimiento 14.
NOTA: Composición del medio de crecimiento: DMEM de glucosa alta sin piruvato de sodio suplementado con suero de caballo al 5%, 10 μg/mL de insulina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/mL de toxina cólera y 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (véase Tabla de Materiales). - Retira el medio gastado, lava las células con 1 mL de DPBS, luego añade 500 μL de tripsina-EDTA al 0,05% e incuba a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 12-15 minutos hasta que todas las células estén tripsinizadas.
- Después de que todas las células se hayan desplazado, añade 2 mL de medio de resuspensión para neutralizar la actividad de la tripsina y centrifuga la suspensión celular a 112 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
NOTA: Composición del medio de resuspensión: DMEM de alta glucosa sin piruvato de sodio suplementado con suero de caballo al 20% y 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina. - Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en 1 mL de medio mamosférico. Pasa la suspensión de la celda por una aguja de 25 G para obtener una suspensión de una sola celda.
NOTA: Composición del medio mamósfero: DMEM/F12 suplementado con 20 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 1 suplemento × B27 sin vitamina A y 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (véase Tabla de Materiales). - Utilizando un hemocitometro, cuenta el número de células y calcula el volumen de suspensión celular necesario para sembrar 0,2 × 104 células por pozo.
NOTA: Mantener una baja densidad de siembra para determinar con precisión la eficiencia de formación de la mamósfera, minimizando así el impacto de la agregación celular. Al recoger lisados proteicos para la inmunoabsorbción, la densidad celular puede aumentar hasta 2,5 × 105 células por pozo. - Diluir el volumen de suspensión celular requerido en 2 mL de medio mamosférico y sembrar en cada pozo de una placa de 6 pozos. Las células semilla en triplicado para cada condición.
- Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 7 días.
- Tras siete días de cultivo, se cuenta manualmente el número de mamosferas con un diámetro superior a 50 μm en cada pozo, ya sea utilizando un microscopio equipado con un grátículo o una cuadrícula de cuadrantes bajo un microscopio óptico.
- Fotografía las mamosferas usando una cámara digital instalada en un microscopio óptico a una ampliación de 20x.
- Calcular la eficiencia de formación de la mamosfera (MFE) usando la siguiente fórmula5
3. Siembra de mamósferas de generación secundaria
- Recoge las mamosferas formadas en la primera generación en un tubo de 15 mL y centrifuga a 300 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Aspira el sobrenadante, dejando atrás la pelota de mamosífera.
- Lava el pellet con DPBS.
- Añadir 200 μL de tripsina-EDTA al 0,05% al pellet de la mamosfera e incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 2-3 minutos. Pasar las mamosferas en la solución de tripsina a través de una aguja de 25 G tres veces para obtener una suspensión de célula única.
- Añade 0,5 mL de medio de resuspensión para neutralizar la actividad de la tripsina y centrifuga la suspensión celular a 112 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Aspira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en 0,5 mL de medio mamosférico.
- Utilizando un hemocitómetro, cuenta el número de células y calcula el volumen de suspensión celular necesario para sembrar 0,2 × 104 células por pozo.
NOTA: Mantener una baja densidad celular para evaluar la capacidad de autorrenovación, minimizando así el efecto de la agregación celular. - Diluir el volumen de suspensión celular requerido en 2 mL de medio mamosférico y sembrar en cada pozo de una placa de 6 pozos. Las células semilla en triplicado para cada condición.
- Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 durante 7 días.
- Tras 7 días en cultivo, cuenta el número de mamosferas con un diámetro superior a 50 μm en cada placa utilizando un microscopio equipado con un graticule o una cuadrícula de cuadrantes.
- Fotografía las mamosferas usando una cámara digital instalada en un microscopio óptico a una ampliación de 20x.
- Calcula la capacidad de autorrenovación usando la siguiente fórmula5
4. Western blot para detectar los cambios en los marcadores de pluripotencia tras la sobreexpresión de Api5
- Recoge las mamosferas formadas en la primera generación en un tubo de 15 mL y centrifuga a 300 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Aspira el sobrenadante, dejando atrás la pelota de mamosífera.
- Lava el pellet con DPBS.
- Recoger el pellet en un tampón RIPA helado para obtener el lisato proteico y realizar inmuno-absorbente según el protocoloestándar 24.
NOTA: Composición del tampón RIPA: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 0,5% desoxicolato sódico, 0,1% dodecilo sulfato sódico (SDS), 1 mM de ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), 1 mM de fluoruro fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 mM de fluoruro de sodio, 1 mM de ortovanato sódico. - Prueba los marcadores de tallo - Oct3/4, Nanog, Sox2 y Bmi1, y el control de carga GAPDH (véase la Tabla de materiales para diluciones de anticuerpos).
- Cuantifiquen los niveles de proteínas usando análisis densitométrico en ImageJ. Selecciona la región de interés en las imágenes de Western blot y genera un perfil de densidad para cada carril.
- Normalizar las densidades relativas de la proteína de interés respecto a las de GAPDH para cada carril. Calcula el cambio de pliegue para cada proteína.
- Grafica el cambio de pliegue en los niveles de proteínas usando cualquier software de trazado.
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Resultados
Para evaluar la eficiencia de formación de la mamosfera en condiciones no adherentes, se sembraron células MCF10A disociadas en 3D de control y sobreexpresión de Api5 en placas recubiertas de poliHEMA según el protocolo. Las células Api5 que sobreexpresan demostraron un aumento de 1,58 veces en la eficiencia media de formación de la mamosfera que los controles (Figuras 1B,C). Este aumento demuestra que una mayor expresión de Api5 incrementa la proporción de progenitores simi...
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Discusión
Mientras que los cultivos monocapa de líneas celulares cancerosas establecidas o células derivadas de tumores proporcionan información sobre las distintas vías moleculares que regulan los fenotipos del cáncer, la investigación centrada en células madre cancerosas no puede realizarse en cultivos bidimensionales. Dado que se cree que las células madre cancerosas son un factor importante que contribuye a la recaída tras las estrategias de tratamiento actuales, es necesario establecer ensayo...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay ningún posible conflicto de intereses.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por una subvención de la SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) y en parte por la financiación del IISER, Pune Core. S.B. fue financiado por una beca UGC-SRF. Queremos agradecer al Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, EE. UU.) por proporcionar generosamente las células MCF10A y al Dr. Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) por sus valiosas aportaciones al manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidified incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Rabbit pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature |
| Anti-Nanog Rabbit mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Oct3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Sox2 Antibody (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethanol absolute 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | SRL | 43272 | |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965126 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Qualigens | Q29145 | Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0) |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in ethanol |
| ImageJ | Image processing software | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid |
| Nikon Eclipse TS-100 microscope | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A cells | Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1.2% pHEMA in 95% ethanol |
| Sodium chloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodium deoxycholate | Amresco | 0613-100G | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodium fluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
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