Perfilado de mutaciones del ADN del receptor del factor de crecimiento epidérmico en células raras circulantes utilizando un sistema de aislamiento celular y PCR digital de gotas

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para ilustrar el aislamiento de células cancerosas raras a partir de una muestra artificial que contiene sangre entera y con células de cáncer de pulmón con picos. El protocolo utiliza una plataforma de aislamiento celular semiautomatizada y sin etiquetas. Las células enriquecidas son posteriormente analizadas en busca de mutaciones en los receptores del factor de crecimiento epidérmico mediante PCR digital de gotas.

Resumen

Las mutaciones encontradas en el gen del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) son fundamentales para determinar los tratamientos más efectivos para pacientes con cáncer de pulmón. Las pruebas rutinarias para mutaciones en EGFR pueden adoptar biopsias tumorales o análisis de ADN computarquial de plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Aunque la analítica de muestras de sangre de pacientes con cáncer de pulmón se realiza habitualmente para obtener información sobre la presencia o recurrencia del cáncer de pulmón, mediante detección de ctDNA o CTC, normalmente no implica el análisis molecular posterior de las células capturadas. La detección de mutaciones individuales dentro del gen EGFR presentes en células tumorales circulantes raras (CTC) puede ofrecer información adicional sobre la posible eficacia de terapias dirigidas y, más allá de eso, sobre el pronóstico del paciente, especialmente en cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC). Desafortunadamente, la rareza de tales células tumorales circulantes y la falta de procedimientos optimizados para analizar su información genómica suponen un desafío significativo para la detección.

El objetivo de este protocolo es ilustrar el potencial realista de capturar CTCs de sangre total y evaluar su contenido molecular mediante ddPCR. Se utilizó una plataforma de aislamiento celular semi-automatizada basada en el tamaño para capturar células tumorales circulantes, que posteriormente se recuperaron para análisis moleculares posteriores. Para determinar la presencia de mutaciones específicas de EGFR en el ADN genómico de las células capturadas, se realizó ddPCR utilizando ensayos para EGFR pT790M y EGFR pL858R.

Dos líneas celulares separadas de cáncer de pulmón (A549 y H1975) se enriquecieron activamente con sangre total y se realizó una cuantificación precisa de las mutaciones presentes en las líneas celulares H1975 mediante ddPCR.

Introducción

Con la continua investigación traslacional sobre el valor de las biopsias líquidas y publicaciones recientes que ilustran específicamente el valor clínico del monitoreo de ctDNA en la selección^{terapéutica 1} , las biopsias líquidas están llegando a la madurez. Las biopsias líquidas ofrecen un método alternativo y menos invasivo para el seguimiento y el pronóstico del cáncer en comparación con los métodos convencionales de biopsia tisular. Una extensa investigación se ha centrado en el ADN fragmentado encontrado en la sangre (ADN libre de células, cfDNA), y específicamente en el subcompartimento derivado de tumores, conocido como ADN tumoral circulante (ctDNA). El ctDNA ha sido estudiado extensamente durante las dos últimas décadas y se ha demostrado que contiene mutaciones genéticas específicas de tumores, como SNVs y variantes estructurales, así como marcadores de metilación y un patrón de fragmentos distinto en comparación con el cfDNA no tumoral. Estas características específicas de ctDNA se utilizan ahora para monitorizar el estado molecular de los pacientes con cáncer a través de la detección temprana, la respuesta terapéutica, la enfermedad residual mínima (MRD) y la resistencia al estado terapéutico. De manera similar, las células tumorales circulantes (CTC), separadas del sitio tumoral primario hacia vasos sanguíneos, han evolucionado recientemente como biomarcadores prometedores cuya existencia y cantidad en sangre han mostrado una estrecha correlación con la progresión de la enfermedad y el potencial de recurrencia. Aunque los primeros estudios sobre CTC se basaron principalmente en la expresión y enumeración de sus marcadores^{proteicos 2}, se han registrado avances significativos en el estudio de las CTC a nivel molecular, incluyendo la detección de mutaciones genómicas en el receptor de estrógeno 1 (ESR1) para el cáncer de mama, y el gen del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) para diversos tipos de cáncer.

Las mutaciones en EGFR son fundamentales tanto para determinar la patogénesis y el pronóstico, como para decidir los tratamientos más eficaces para pacientes con cáncer de^{pulmón 3}. Las pruebas rutinarias para mutaciones en EGFR pueden adoptar biopsias tumorales sólidas en el diagnóstico o progresión o, más recientemente, muestreo de ctDNA de plasma de pacientes con cáncer de pulmón recaído/^{refractario 4}. Sin embargo, a diferencia de los enfoques basados en ctDNA, el análisis de material genómico derivado de CTC permite la evaluación directa de células tumorales intactas y sus perfiles mutacionales. Junto con los estudios de ADNCT MRD, la detección de mutaciones dentro del gen EGFR de CTCs raros puede aportar una comprensión adicional sobre la posible eficacia de los regímenes de tratamiento y, más allá, sobre el pronóstico del paciente, especialmente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). La rareza de los CTC y la falta de protocolos simplificados que utilicen instrumentos fáciles de usar para las clínicas constituyen un serio obstáculo para una adopción más amplia. Esta limitación pone de manifiesto la necesidad de un flujo de trabajo estandarizado y accesible que permita tanto el aislamiento eficiente de CTC como el análisis molecular posterior. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es presentar un flujo de trabajo reproducible para el enriquecimiento de células tumorales circulantes y la posterior detección de mutaciones en EGFR utilizando un enfoque combinado de aislamiento celular y PCR digital.

El Sistema de Aislamiento Celular Genesis, con portaobjetos microfluídicos de captura celular, puede capturar CTCs en un proceso semiautomatizado con alta viabilidad y alta eficiencia de captura, basándose en su mayor tamaño y reducida deformabilidad en comparación con la población primaria de glóbulos blancos y^{rojos 5,6}. Los CTC capturados pueden recuperarse de las láminas de captura celular microfluídica mediante flujo inverso fuera del portaobjetos para un análisis genómico posterior posterior. Para determinar la presencia de mutaciones específicas de EGFR dentro del ADN genómico de las células capturadas, se realizó ddPCR sobre ADN genómico derivado de CTC utilizando ensayos para EGFR T790M y L858R.

Este protocolo, que utiliza una muestra modelo de CTC y ensayos ddPCR disponibles comercialmente, está diseñado para ejemplificar un punto de entrada para la detección dirigida de mutaciones asociadas al cáncer en CTCs. Este protocolo proporciona un enfoque práctico para detectar mutaciones asociadas al cáncer en células tumorales circulantes y puede apoyar más investigaciones sobre aplicaciones en biopsias líquidas.

Protocolo

Declaración ética:

Se obtuvieron muestras de sangre de fuentes autorizadas para su uso en investigación, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de la recogida. Todos los protocolos experimentales que involucraban muestras de sangre humana fueron revisados y aprobados por el Comité de Revisión Institucional de un proveedor de sangre, Discovery Life Sciences (Alabama, EE. UU.). Todos los procedimientos que involucraron muestras de sangre humana se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares éticos del comité de investigación institucional y con la Declaración de Helsinki.

1. Enriquecimiento de células cancerosas mediante sistema semiautomatizado de aislamiento celular

Nota: Esta sección describe el enriquecimiento de células tumorales circulantes (CTC) utilizando una plataforma semiautomatizada de aislamiento celular, seguida de la detección de mutaciones en EGFR mediante PCR digital de gotas. Se utiliza una muestra modelo de CTC para demostrar su viabilidad y se recomienda la validación del ensayo antes de su aplicación clínica. Se utilizaron dos líneas celulares de cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC): NCI-H1975 (mutaciones EGFR L858R/T790M) y A549 (tipo silvestre EGFR), que sirvieron como control negativo para la detección de mutaciones.

1. Muestra de sangre
   1. Asegúrate de obtener el consentimiento informado de los donantes de sangre o pacientes antes de la recogida. Obtener la aprobación del Comité de Revisión Institucional (IRB), cuando sea necesario, para investigaciones que involucren especímenes humanos, incluida la sangre.
   2. Para pruebas de viabilidad, obtén una muestra de sangre de un proveedor externo autorizado solo para uso en investigación.
   3. Recoger sangre periférica en tubos de ácido etilendediaminético tetraacético (EDTA) y procesar la muestra mediante el protocolo de enriquecimiento Genesis en un plazo de 48 horas.
      Nota. Para análisis descendentes y el protocolo de enriquecimiento Genesis, se recomiendan tubos EDTA. Se pueden usar tubos de Streck y EDTA para inmunotinción en portaobjetos con protocolos de enumeración Genesis (directo/indirecto).
   4. Almacenar muestras de sangre recogidas en tubos EDTA a 2–8 °C hasta su uso. Para el aislamiento de células Génesis, no se requiere tratamiento previo y se puede usar sangre entera de hasta 10 mL para el protocolo de enriquecimiento.
2. Preparación de muestras CTC con modelo / Muestras clínicas
   1. Preparar una solución de stock celular a una concentración de 100–1.000 células en un medio de cultivo celular apropiado de 10 μL o en un tampón de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Sáltate este paso si se utilizan muestras clínicas.
      NOTA: Las concentraciones de aumento utilizadas en este estudio son superiores a los niveles clínicos típicamente observados de CTC y están destinadas únicamente a fines de demostración de métodos.
   2. Añadir los 10 μL de la solución de celulose en hasta 10 mL de sangre total de un donante sano para preparar una muestra modelo de CTC. Para muestras clínicas, no incluyas células cancerosas en las muestras de sangre entera de los pacientes.
   3. Mezcla la muestra de sangre con un volumen igual de PBS (1x) y agita suavemente sobre una mecedora a temperatura ambiente hasta que se use. Si el almacenamiento supera una hora, guarda a 4 °C.
3. Enriquecimiento CTC
   1. Enciende el Sistema de Aislamiento de Celdas Génesis y espera a que el sistema se inicialice. Esto puede tardar hasta 5 minutos.
   2. Coloca el tarro de residuos en posición en la base de las bahías de la estación y conecta el tubo del tarro de residuos al tarro de basura.
   3. Presiona el tubo en la válvula de presión hasta que notes que encaja y conecta el tubo del sistema Genesis a la salida del tarro de desechos.
   4. Haz una autoprueba pulsando "iniciar" desde la pantalla de inicio y tocando la opción 'Autoprueba' en la pantalla.
   5. Cuando la autoprueba esté completada, selecciona '2.0 Kit Enrichment' en las opciones de protocolo seleccionado.
   6. Sigue las instrucciones en la pantalla, rellena los campos de entrada de datos necesarios y termina el procedimiento de cebado y ensamblaje. Un cebado exitoso usando etanol al 70% y PBS 1x proporciona el mejor rendimiento de captura celular y recuperación para la extracción de ADN. El cebado tarda unos 20 minutos en completarse.
   7. Asegúrese de que se haya seleccionado el programa de enriquecimiento correcto (2.0 Kit Enrichment) y que todas las conexiones de los tubos y posiciones de las correderas estén bien aseguradas antes de comenzar la prueba. Evitar introducir burbujas de aire durante la carga de la muestra, ya que esto puede afectar la consistencia del flujo y la eficiencia de captura.
   8. Dispensa suavemente la muestra de modelo preparada desde el paso 1.2.3 (Muestra CTC modelo/Preparación de muestra clínica) en el embudo de entrada y continúa el protocolo de enriquecimiento pulsando 'Reanudar' en la pantalla del sistema.
   9. Cuando se completa la captura CTC, el sistema semiautomatizado de aislamiento de celdas pedirá al usuario que retire el tarro de residuos y vuelva a unir el depósito de cebado.
   10. Desconecta el tubo del Sistema Génesis del tarro de residuos y pipea 4 mL de tampón de dilución en el depósito de cebado.
   11. Conecta el adaptador de reflujo al depósito de cebado y vuelve a unirlo al tubo del Sistema Genesis. Pulsa Reanudar en la pantalla para continuar el protocolo de enriquecimiento. Esto libera las células capturadas en el portaobjetos microfluídicos hacia el embudo de entrada aplicando el retroflujo.
   12. Recoge las células recuperadas pipeteando desde el embudo de entrada hasta un tubo Eppendorf de 5,0 mL. Asegúrate de recoger todas las muestras acuosas del embudo de entrada, que a menudo pueden superar los 4 mL.
   13. Centrifuga la muestra recuperada a 600 g durante 5 minutos para pelletar las células capturadas antes de la lisis celular.
   14. Retirar el sobrenadante con cuidado y proceder al protocolo de Extracción de ADN (Sección 1.4).
4. Extracción de ADN
   Precaución: El DNAzol BD es perjudicial si entra en contacto con la piel o se ingiere. Evita el contacto con la piel y los ojos. Úsalo solo en un entorno de campana extractora química y no inhales niebla/vapor/spray. En caso de contacto con la piel, lava con agua inmediatamente.
   1. Añade 1 mL de BD de DNAzol directamente en el tubo del paso 1.3.14.
   2. Transfiere todo el volumen de la muestra a un nuevo tubo de microcentrífuga de ADN Eppendorf LoBind de 1,5 mL y agita vigorosamente.
   3. Incuba el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Haz un vórtice vigoroso en el tubo e incuba a temperatura ambiente durante al menos 4 minutos.
   4. Asegura la mezcla completa durante los pasos de lisis y precipitación para maximizar la recuperación del ADN. Se puede incluir un tratamiento opcional por RNasa si la contaminación por ARN es una preocupación.
   5. Añade 400 μL de isopropanol directamente a la mezcla de muestras de lisato de células BD de DNAzol.
   6. Centrifuga el tubo a 10.000 g durante 6 minutos para precipitar ADN.
   7. Tras la centrifugación, retira el sobrenadante y añade suavemente 0,5 mL de BD de DNAzol al ADN en pellet.
   8. Haz un vórtice en el tubo hasta que la pelota de ADN esté completamente dispersa.
   9. Centrifuga la mezcla a 10.000 g durante 5 minutos.
   10. Retira el sobrenadante y lava la pelota de ADN pipeteando 1 mL de etanol al 75%.
   11. Repite los pasos 9–10 para un total de dos lavados.
   12. Elimina cualquier etanol residual en el fondo del tubo usando una micropipeta.
       NOTA: Asegúrate de que el pellet no se seque completamente.
   13. Añade 20 μL de agua desionizada (DI) libre de DNasa-/RNasa para solubilizar el ADN de las muestras CTC.
   14. Cuantifique el ADN de doble cadena (dsDNA) en la muestra utilizando kits o plataformas de análisis de cuantificación de dsDNA, como el Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit o el Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis.
   15. Almacenar muestras de ADN extraídas a 4 °C o -20 °C para evitar la degradación.
       Punto de pausa: Las muestras de ADN extraídas pueden almacenarse a -20 °C para almacenamiento a corto plazo o a -80 °C para almacenamiento a largo plazo antes de pasar a análisis posteriores.

2. Análisis de mutaciones EGFR usando ddPCR

La PCR digital es un método adecuado para detectar mutaciones raras con alta sensibilidad y precisión. Los ensayos de detección de mutaciones dddPCR proporcionados en un solo tubo suelen incluir una sonda marcada con FAM dirigida a un alelo mutante y una segunda sonda etiquetada con HEX dirigida a un alelo de tipo salvaje.

1. Configuración de la reacción y generación de gotas
   1. Descongelación ddPCR Supermix, ddPCR Ensayos de detección de mutaciones sobre hielo.
   2. Alterna cada tubo para asegurar que el contenido sea homogéneo, ya que puede formarse un gradiente de concentración durante el almacenamiento a -20 °C.
   3. Centrifuga brevemente hasta sedimentar el contenido en el fondo del tubo y coloca el tubo sobre hielo.
   4. Preparar las muestras de ADN extraídas a la concentración deseada antes de preparar la mezcla de reacción según la receta de la Tabla 1.
   5. Haz una mezcla premezclada que contenga supermezcla, ensayos y enzimas de restricción, además de agua para todas las muestras necesarias para la prueba y añade ADN de muestra individualmente como último componente de reacción. Asegúrate de que la concentración final de muestras de ADN sea de 50 fg–100 ng.
      Nota: Se recomienda la fragmentación del ADN por digestión por restricción antes de la generación de gotas para mejorar la precisión, reducir la viscosidad y mejorar la accesibilidad a la plantilla. Se recomienda la digestión directa utilizando 2–5 U de enzima de restricción durante la configuración de ddPCR. Para ensayos de mutación puntual EGFR (T790M/L858R), se recomienda MseI; consulte las hojas de datos del ensayo para enzimas compatibles antes de personalizar. Las hojas de datos están disponibles para descargar de ensayos individuales en el portal de ensayos digitales Bio-Rad (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assaysings | Inicio)
   6. Preparar un control negativo para al menos un pozo, que contenga solo plantilla de tipo salvaje a una concentración similar a la concentración de muestras desconocidas.
   7. Haz un vórtice en los tubos de reacción para mezclarlos a fondo y centrifuga brevemente para sedimentar todas las muestras en el fondo de cada tubo de reacción. Deja que los tubos de reacción se equilibren a temperatura ambiente durante 2 minutos.
   8. Cargar 20 μL de cada mezcla de reacción en un pozo de muestra de un cartucho microfluídico (cartucho DG8) seguido de 75 μL de aceite de generación de gotas para las sondas en los pozos petrolíferos.
   9. Cubre el cartucho con una junta y colócalo en el generador de gotas QX200.
   10. Pulsa el botón en la parte superior del Generador de Gotas para cerrar la tapa. Cuando la tapa se cierra, la generación de gotas comienza automáticamente. Este procedimiento combina las muestras y el aceite dentro de los microcanales del cartucho microfluídico para crear una emulsión de ~20.000 gotas del tamaño de un nanolitro para cada muestra.
2. Amplificación por PCR (condiciones de ciclo térmico)
   1. Programar las condiciones de ciclo térmico en un ciclador térmico como se recomienda en la Tabla 2
   2. Cuando la generación de gotas termina, todas las luces del instrumento están en verde fijo. Abre el instrumento pulsando de nuevo el botón del Generador de Gotas y retira el portacartuchos y el cartucho.
   3. Retira la junta desechable y aspira 45 μL de gotas del cartucho, asegurando un ligero ángulo en la punta de la pipeta para evitar que se deshagan las gotas.
   4. Dispensa las gotas en las placas ddPCR de 96 pozos y sella la placa con el sellado térmico de placa PCR usando el sellador de placas PCR PX1.
   5. Tras sellar la placa de 96 pozos que contiene las gotas, transfiere cuidadosamente la placa de 96 pozos al ciclador térmico preparado en el paso 2.2.1 y comienza el ciclo térmico.
3. Lectura de gotas y análisis de datos
   1. Inicia el instrumento lector de gotas ddPCR (lector de gotas QX200 o lector de gotas QX600) y un ordenador conectado en el que se instale y configure el software gestor QX.
   2. Una vez completado el paso de ciclo térmico, mueve la placa sellada de 96 pozos a un instrumento lector de gotas.
   3. Open QX Manager Software para configurar una nueva disposición de placas basada en un diseño experimental. Haz clic en la pestaña 'Añadir placa' y el software activará el botón Configurar matrícula. Haz clic en 'Configurar placa' para asignar detalles de muestra a la placa.
   4. Rellena los detalles de la placa y la información del pozo, selecciona los pozos, designa el estado de la muestra, tipo de experimento, nombre(s) del objetivo(s), tipo(s) de objetivo(s) y referencia: ch1 para FAM y ch2 para el color HEX.
   5. Haz clic en 'Aplicar' para cargar el pozo y, una vez terminado, selecciona 'OK'.
   6. Cuando la disposición de las placas esté completa para todas las muestras, seleccione 'Ejecutar' para iniciar el proceso de lectura de gotas.
   7. Tras la adquisición de datos, selecciona muestras en el selector de pozos bajo 'Analizar' y establece el umbral adecuado para el ensayo de detección de mutaciones ddPCR para distinguir señales mutantes de tipo salvaje.
   8. Para ensayos de mutación dúplex como los utilizados en este protocolo, los umbrales pueden establecerse automáticamente usando la configuración predeterminada del software QX Manager (referencia a la figura en los resultados).
   9. Alternativamente, los umbrales pueden establecerse manualmente usando los métodos de mira o lazo, asegurando que los umbrales o los límites del lazo separen los grupos positivos y negativos y se posicionen según las ubicaciones de los clústeres definidas tanto por los controles positivos como negativos incluidos en cada secuencia.
      NOTA: Los umbrales deben establecerse de forma consistente entre las muestras dentro de un lote usando controles positivos y negativos para asegurar la llamada reproducible de mutaciones.
   10. La concentración reportada es el número de copias por μL de la reacción final 1x ddPCR.

Resultados

El sistema de aislamiento celular Genesis con portaobjetos microfluídicos de captura celular aisló un promedio del 84% de células cancerosas con picos en muestras de sangre a una concentración de 25–250 células·^mL-1 (Figura 3A). Esta alta eficiencia de captura demuestra la eficacia del paso de enriquecimiento para aislar células tumorales raras circulantes de muestras de sangre total. La inmunotinción opcional de células capturadas en portaobjetos microfluídicos de captura celular utilizando el protocolo de enumeración del sistema demostró identificación celular rara utilizando dos anticuerpos positivos contra la citoqueratina, DAPI para identificar células nucleadas y un anticuerpo negativo contra CD45 que se expresa en la mayoría de los glóbulos blancos pero normalmente no se expresa en CTC (Figura 3B). Este patrón de tinción confirma la identificación exitosa de las células tumorales circulantes excluyendo los glóbulos blancos de fondo.

Los ensayos de detección de mutaciones ddPCR permitieron identificar y perfilar mutaciones EGFR en células cancerosas enriquecidas. Este estudio demostró la detección de mutaciones de ADNG en células, inicialmente enriquecidas por la plataforma Genesis, utilizando ensayos de detección de ddPCR y mutaciones. Los gráficos ddPCR (Figura 4) de las líneas celulares cancerosas A549 (tipo salvaje EGFR) y H1975 (L858R/T790M) para las dos mutaciones EGFR probadas mostraron que ddPCR puede detectar sensiblemente mutaciones presentes en la línea celular H1975 tras dispararse en sangre entera y su posterior enriquecimiento mediante la plataforma Genesis. Se observaron señales de mutación positivas en células H1975, mientras que en células A549 no se detectaron señales de mutación, lo que confirma la especificidad del ensayo. Las muestras añadidas con la línea celular de control A549 no mostraron gotas presentes de mutación, lo que confirma que la detección de mutaciones en L858R y T790M está asociada específicamente con la línea celular H1975. Esta demostración del aislamiento CTC en la plataforma Genesis, seguida de un análisis molecular utilizando ddPCR, puede ofrecer una potente herramienta diagnóstica molecular para estudios de biopsia líquida y estudios preclínicos utilizando muestras clínicas para monitorizar la progresión de la enfermedad y tratamientos personalizados. En conjunto, estos resultados demuestran que el flujo de trabajo combinado de enriquecimiento y ddPCR puede detectar y cuantificar de forma fiable mutaciones en EGFR en células tumorales circulantes.

Figura 1: Flujo de trabajo de biopsia líquida para perfilar mutaciones del ADN EGFR en cáncer de pulmón. (A) Ilustración de la heterogeneidad tumoral que muestra diferentes perfiles de mutación EGFR detectados mediante biopsias tisulares convencionales y células tumorales circulantes (CTC) a partir de biopsias líquidas. (B) Flujo de trabajo esquemático para el perfilado de mutaciones del ADN EGFR en células tumorales circulantes mediante biopsia líquida. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Demostración del perfilado de mutaciones en ADN de EGFR utilizando muestras artificiales. (A) Preparación de una muestra modelo de CTC mediante el spiking de líneas celulares de cáncer de pulmón con estado definido de mutación EGFR en sangre total de un donante sano. (B) Flujo de trabajo que ilustra la detección de mutaciones en ADN de EGFR en células tumorales circulantes utilizando plataformas comercialmente disponibles. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Aislamiento y identificación sin etiqueta de células tumorales circulantes. (A) Eficiencia de captura de líneas celulares de cáncer de pulmón (A549 y H1975) disparadas a muestras de sangre entera de donantes sanos utilizando una plataforma semiautomatizada de aislamiento de células raras. (B) Inmunotinción de células capturadas mostrando células tumorales positivas a citoqueratina. Barra de escala = 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Perfilado de mutaciones EGFR usando PCR digital basada en gotas. Gráficos de amplitud bidimensionales que muestran la detección de mutaciones en EGFR en células cancerosas enriquecidas tras la lisis celular y la extracción de ADN. Las células A549 (tipo silvestre) muestran ausencia de señales específicas de mutación, mientras que las células H1975 presentan señales positivas para mutaciones EGFR L858R y T790M. El ensayo permite la detección y cuantificación sensible de poblaciones de ADN mutante y de tipo salvaje. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Componente	Volumen por reacción (μl)	Concentración final
2x ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)	10	1x
Cebadores/sonda de tipo 20x objetivo (FAM) y tipo salvaje (HEX)	1	1x
Enzima de restricción, diluida (Msel)	1	2-5 U/reaction
Muestra objetivo y/o agua libre de DNasa (NTA)	Variable	Variable
Volumen total	20	-

Tabla 1: Configuración de la reacción para la detección de mutaciones por PCR digital basada en gotas. Composición y concentraciones finales de reactivos utilizados para detectar mutaciones raras de EGFR en muestras de ADN derivadas de células cancerosas.

Paso de ciclo térmico*	Temperatura	Tiempo	Tasa de rampa	Número de ciclos
	(ºC)		(ºC/s)
Activación enzimática	95	10 min	2	1
Desnaturalización	94	30 segundos	2	40
Recocido/extensión	55	1 min	2	40
Desactivación enzimática	98	10 min	2	1
Refrigeración	4	30 min	2	1
Mantener (opcional)	4	∞ (infinito)	1	1
Usa una tapa calefactada a 105ºC y el volumen de muestra a 40μl para el C1000 Touch Thermal Cycler con un módulo de reacción de pozo de 96 profundidades.

Tabla 2: Condiciones de ciclo térmico para amplificación digital por PCR. Parámetros de ciclo térmico utilizados para amplificar objetivos de mutación EGFR mediante un ciclador térmico con un módulo de reacción de 96 pozos.

Discusión

La presencia de células tumorales circulantes en la sangre de pacientes con tumores sólidos ha sido objeto de investigación durante más de 60 años⁷ y ha sido reconocida como biopsia líquida primaria desde antes de su primera inclusión en el término colectivo en 2010⁸. Sin embargo, las CTC son raras y difíciles de aislar selectivamente de la sangre^{entera 9}. Sin embargo, existen numerosos métodos para capturar y enriquecer CTC, como ilustran las siguientes^{revisiones 10,11}, que abarcan enfoques físicos/microfluídicos así como métodos de selección de marcadores en la superficie celular. Muchos de estos métodos consumen mucho tiempo, requieren mucho trabajo y a menudo implican varios pasos o sistemas para lograr la selectividad requerida.

La captura de CTCs de sangre total en este protocolo depende de su tamaño (> 8 μm) y de la ausencia de deformidad en el fondo de glóbulos rojos y blancos fenotípicamente normales que pasan por los poros microfluídicos dentro de las láminas de captura celular microfluídica. Por lo tanto, la carga correcta de la muestra, el cebado adecuado de la lámina y la prevención de obstrucciones son pasos críticos para mantener la eficiencia de captura y la recuperación de muestras.

Para que el flujo de trabajo tenga éxito, la gestión de las muestras de sangre es el factor clave; asegurando que se utilice sangre fresca para el procesamiento de muestras y manteniendo las condiciones adecuadas de transporte y almacenamiento para prevenir la hemólisis. La degradación de glóbulos rojos o glóbulos blancos afectará respectivamente a la calidad de la captura de CTC y a la sensibilidad de detección de cualquier variante genómica rara. Si se observa hemólisis, coagulación o degradación visible de la muestra, la muestra no debe ser procesada, ya que estas condiciones pueden reducir la recuperación del CTC y la sensibilidad a la detección de mutaciones posteriores.

Dado que las CTC pueden estar presentes en niveles inferiores a 1 CTC por cada 10 millones de glóbulos blancos en sangre total, es esencial capturar el mayor volumen permitido para el enriquecimiento. Las láminas de captura de células microfluídicas pueden contener 10 mL de sangre en línea con tubos estándar de captura como Streck y EDTA, que normalmente contienen ~7,5–10 mL de sangre. Una reducción en el volumen sanguíneo recogido afectará directamente a la sensibilidad a la captura del CTC y a la posterior detección de variantes genómicas. Obtener volúmenes más allá de esta rutina de los pacientes que reciben tratamiento puede ser un reto tanto clínico como ético. Más allá de aumentar el volumen más de 10 ml o utilizar muestras diagnósticas de leucaferesis para incrementar las poblaciones de leucocitos/^{CTC 12}, aumentar la sensibilidad con volúmenes mayores está fuera del alcance actual de la plataforma Genesis.

El protocolo se ejecutó según lo establecido en la norma estándar, pero con cuidado para asegurar la recogida de sangre fresca, la mezcla exhaustiva de EDTA con sangre en la recogida y el almacenamiento cuidadoso de la sangre recogida antes de su uso, ilustrando el potencial de este protocolo para utilizarse en un entorno clínico donde se valoran los procedimientos operativos estándar rutinarios. Sin embargo, dado que este protocolo se demostró utilizando muestras artificiales, se requiere validación con muestras clínicas de pacientes antes de la implementación clínica rutinaria.

La sensibilidad en la detección de mutaciones dentro de una población de CTC depende tanto de la presencia de CTC en una muestra estándar de sangre entera como de la posterior detección de mutaciones somáticas dentro de esa población de CTC, que depende de la frecuencia de la mutación en la subpoblación de CTC. Estos dos factores de confusión limitarán en última instancia la sensibilidad global a la detección de mutaciones en una población capturada de CTC; teniendo un mayor impacto en muestras de detección temprana, en comparación con las muestras en fase avanzada que probablemente presenten mayores recuentos de CTC y poblaciones más altas de CTC con mutaciones.

Los estudios actuales de biopsia líquida basada en sangre están fuertemente sesgados hacia el ADN tumoral circulante presente en el plasma como indicación de la presencia tumoral. Normalmente, la detección del ctDNA se basa en la presencia de marcadores genómicos específicos del tumor, por ejemplo, SNVs, variantes estructurales, MSI-H, TMB y CGP. Se sabe que los CTC, como biomarcador menos utilizado pero igualmente viable en biopsias líquidas, pueden filtrarse al torrente sanguíneo a partir de tumores en crecimiento y potencialmente^{metástatizos.} El análisis de CTCs se centra principalmente en marcadores superficiales celulares utilizados para su captura o para la validación posterior a la captura, utilizando paneles de anticuerpos establecidos o personalizados, por ejemplo, pan-citoqueratina, vimentina, PD-L1, EpCAM, etc. En cambio, el análisis molecular de CTCs tiene una adopción limitada debido a los desafíos de enriquecer y capturar selectivamente CTCs de sangre entera, seguido de un análisis preciso de la subpoblación de CTC. El método actual utiliza un flujo de trabajo estandarizado que incorpora protocolos establecidos para la captura de CTC seguido de un análisis molecular mediante ddPCR con ensayos comerciales para mutaciones genómicas patológicas relevantes conocidas en muestras de sangre total artificiales. Este enfoque es significativo porque permite el perfilado de mutaciones directamente a partir de CTCs enriquecidos, complementando los enfoques de biopsia líquida basados en ADN computográfico plasmático.

Utilizando el enfoque actual, se pueden investigar CTCs raros capturados tanto por su presencia en sangre entera como por la presencia de marcadores genómicos patológicamente relevantes dentro de la población de CTC. Los estudios han demostrado el valor de evaluar tanto el perfil de ctDNA de pacientes con cáncer como el reservorio CTC que circula en paralelo al ctDNA¹³, ampliando la evaluación de ambas fuentes de mutaciones el panorama molecular global de cada paciente. Esto tiene el potencial para el desarrollo de paradigmas de pruebas de patología dentro del ámbito de la investigación traslacional, pero en última instancia en un entorno clínico. El nuevo paradigma incorporaría tanto la presencia de CTC como indicación de la presencia/progresión del cáncer como mutaciones patológicas presentes en las células capturadas por CTC, lo que podría indicar expansión clonal o resistencia^{terapéutica 14}. La implicación de esto es que el desarrollo de metástasis y expansión clonal, seguido de la posterior resistencia a fármacos, podría monitorizarse tanto a nivel de ctDNA como de CTC de forma conjunta, impactando directamente en la selección de la terapia en cáncer en estadios avanzados.

Las aplicaciones futuras pueden incluir adaptar este flujo de trabajo a mutaciones adicionales asociadas al cáncer y probar su rendimiento en muestras clínicas longitudinales.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Referido como "Sistema semi-automatizado de aislamiento celular")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrumento
QX200 Droplet Reader o QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 o 12013328	Instrumento (Referido como "Instrumento de lectura de gotitas")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrumento
C1000 Touch Thermal Cycler con módulo de reacción de 96–pozos profundos	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrumento
Qubit 4 Fluorómetro	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrumento
Diapositivas Celselect			Consumible (Referido como Diapositivas de Captura Celular Microfluidicas)
Kit de Enriquecimiento de Diapositivas Celselect 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consumible
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reactivo
Enzima de restricción MseI	New England Biolabs	R0525S	Reactivo
Ensayo de detección de mutaciones ddPCR: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	ID de Ensayo dHsaMDV2010019	Ensayo
Ensayo de detección de mutaciones ddPCR: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	ID de Ensayo dHsaMDV2010021	Ensayo
Kit de Ensayo de Alta Sensibilidad Qubit 1X dsDNA	Invitrogen	Q33230	Kit de ensayo
Cartuchos DG8 para QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consumible
Aceite de Generación de Gotitas para Sondas	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consumible
Aceite de Generación de Gotitas Automatizado para Sondas	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consumible (opcional)
Supermix ddPCR para Sondas (sin dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reactivo
Sello de calor para placas PCR	Bio-Rad Laboratories	1814040	Sello de lámina perforable
Tubo de microcentrífuga LoBind para ADN, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Consumible
Placas de 96 pocillos ddPCR	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consumible