Method Article

Método de cocultivo tridimensional para el estudio de interacciones indirectas entre diferentes tipos celulares a través de una membrana basal reconstituida

DOI:

10.3791/70027

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April 17th, 2026

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1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo detalla un método sencillo para el cocultivo tridimensional de dos tipos celulares separados por una membrana basal reconstituida que requiere poco equipo especializado y puede analizarse fácilmente mediante diversas técnicas experimentales.

Abstract

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El cocultivo tridimensional (3D) es una técnica que evoluciona rápidamente para investigadores que buscan estudiar con precisión las interacciones célula-célula mediante experimentos in vitro . Las limitaciones del cultivo celular monocapa, incluyendo interacciones limitadas entre el entorno celular y extracelular y la morfología celular alterada, se abordan simulando el entorno celular in vivo . Utilizando un andamiaje para proporcionar soporte estructural e incluyendo componentes de la matriz extracelular biológicamente activa, los cultivos 3D muestran comportamientos y morfologías más congruentes con el tejido. Incorporar múltiples tipos celulares en este tipo de entorno 3D permite estudiar las interacciones célula-célula dentro de un sistema modelo biomimético. Ha surgido una amplia gama de tecnologías de co-cultura 3D, cada una con sus propias ventajas y desafíos. A menudo, estas tecnologías requieren equipos especializados, una configuración compleja o conocimientos técnicos específicos. Asimismo, existen algunos métodos estandarizados para estudiar las interacciones indirectas entre células entre dos tipos celulares separados por una membrana basal reconstituida. Aquí describimos un método de co-cultivo 3D que solo requiere habilidades técnicas fundamentales y utiliza materiales más ampliamente aplicables para recapitular con éxito las interacciones indirectas célula-célula a través de una membrana basal. Una monocapa de células está cubierta por una capa de matriz extracelular, en forma de Matrigel, y un segundo tipo celular se siembra encima. La cocultura resultante se mantiene durante cinco días, momento en el que las células se analizan para detectar cambios morfológicos mediante inmunofluorescencia o se extraen de la co-cultura para análisis genómicos, transcriptómicos o proteómicos más detallados. Este protocolo es ideal para estudiar el impacto de la comunicación célula-célula en el comportamiento celular cuando el contacto físico está prohibido por una membrana basal. A medida que los investigadores siguen optando por métodos de cultivo celular más relevantes para el in vivo , es necesario un enfoque simplificado para evitar barreras de entrada elevadas.

Introduction

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El cultivo celular in vitro es una técnica de investigación robusta, rápida y ampliamente utilizada. Aunque los métodos tradicionales de cultivo celular son potentes, difieren mucho de un entorno in vivo. La naturaleza espacialmente restringida del cultivo celular monocapa conduce a cambios en la expresión génica, la morfología yla bioquímica 1,2,3. Las técnicas de cultivo tridimensional (3D) abordan esta disparidad, ya que las células se cultivan en un andamio que simula la matriz extracelular (ECM) presente en órganos y tejidos. En el cultivo 3D, las células muestran morfología y comportamiento más parecidos a los observados in vivo 4,5 Sin embargo, el cultivo 3D por sí solo no recapitula completamente los muchos componentes de un microambiente in vivo porque carece de contribuciones de otros tiposcelulares 6.

Las interacciones directas (contacto entre células) e indirectas entre células juegan un papel fundamental en el comportamiento de las células in vivo 7,8. Recapitular estas interacciones requiere modelos de cocultivo 3D, donde varios tipos celulares se cultivan juntos en un entorno 3D. Utilizando estas técnicas, se puede establecer un entorno de crecimiento in vivo similar a la in vitro, mejorando la relevancia biológica de losresultados 9,10. Sin embargo, cuanto más específico es el entorno requerido para un experimento concreto, más compleja se vuelve la metodología. No existe un sistema modelo estandarizado que pueda utilizarse para estudiar las interacciones célula-célula entre células separadas por una matriz de membrana basal. Por ello, este protocolo fue diseñado para simular las interacciones célula-célula que ocurren a través de una matriz de membrana basal de manera robusta y reproducible. Adaptada de un modelo de cultivo 3D previamenteestablecido 11, la técnica utiliza una capa de Matrigel, denominada gel ECM, para separar físicamente dos tipos celulares diferentes en cultivo mientras permite el paso de factores secretados. Originalmente fue diseñado para estudiar el impacto indirecto de los adipocitos en las células mesenquimales del cáncer de mama, pero puede modificarse fácilmente para acomodar una variedad de tipos celulares. Se debe considerar cuidadosamente si este método es apropiado para un diseño experimental dado. Este método no permite la interacción directa célula-célula y, por tanto, debería limitarse a modelar escenarios in vivo que impliquen comunicación indirecta entre células a través de una matriz basal de membrana. Por ejemplo, este sistema no sería ideal para modelar las interacciones entre las células T citotóxicas y las células tumorales, ya que suelen interactuar directamente. En su lugar, consideremos escenarios biológicos en los que una membrana basal separa de forma natural los dos tipos celulares de interés. Por ejemplo, este método podría aplicarse al estudio de las interacciones entre células tumorales y células endoteliales vasculares antes de la intravasación.

Un método alternativo común de co-cultura 3D implica el uso de chips microfluídicos especializados, o "órgano-en-un chip (OoC)". Los sistemas OoC son potentes y pueden adaptarse a experimentos individuales, pero requieren un tiempo y recursos significativos dedicados al diseño de chips, selección de materiales, equipos periféricos, optimización y recogidade datos 12,13. Además, actualmente no existe ningún material o método estándar que pueda proporcionar las señales biológicas y físicas de la matriz de membrana basal sin interferir con el flujomicrofluídico 14. Por ello, aplicar la tecnología OoC a estudios de las interacciones célula-célula a través de la membrana basal presenta desafíos adicionales. El método descrito en este protocolo busca ofrecer una alternativa estandarizada que mantenga la relevancia y accesibilidad biológicas.

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Protocol

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Este protocolo (Figura 1A) describe un sistema de co-cultivo 3D diseñado para recapitular las interacciones célula-célula a través de una matriz de membrana basal. El análisis posterior es posible mediante microscopía confocal (Figura 1B) o mediante la extracción de células dentro del cocultivo (Figura 1C). Mediante una construcción en 'sándwich', donde una capa de gel ECM está intercalada entre dos poblaciones celulares, el protocolo no requiere aparatos especializados y puede realizarse con conocimientos básicos de técnicas modernas de cultivo celular.

1. 3D Preparación de la cocultura

NOTA: El protocolo descrito pretende ser una aplicación representativa del método de co-cultivo 3D utilizando adipocitos 3T3-L1 y células de cáncer de mama MDA-MB-231. El uso de diferentes tipos celulares requerirá optimización de la densidad de siembra celular y prepruebas de lotes de gel ECM para garantizar su eficacia. Este protocolo aborda el uso de un control sin adipocitos y un control condicionado de medios. Puede ser necesario más controles dependiendo del objetivo experimental.

  1. Cultivo celular y preparación de soluciones
    1. Adquirir y establecer cultivos de líneas celulares de preadipocitos 3T3-L1 y MDA-MB-231 de cáncer de mama. Cultivar y mantener de forma independiente todas las células utilizando técnica aséptica en un gabinete de seguridad biológica clase II y métodos estándar de cultivo celularadherente 15. Mantener las células 3T3-L1 en el Medio Águila Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero de terneros recién nacidos al 10% (v/v) y al 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL). Mantener las células MDA-MB-231 en RPMI 1640 suplementadas con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL).
      NOTA: Nunca permitas que las células 3T3-L1 superen el 80% de confluencia durante el mantenimiento, y no uses cultivos más allá del número 20del paso.
    2. Adquiere o prepara una solución estándar de 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO 4, 1,8 mMde KH 2PO4, pH 7,4.
    3. Prepara 50 mL de solución de lavado de PBS-glicina añadiendo 0,375 g de glicina a 50 mL de PBS para una concentración final de glicina de 100 mM. Conserva la solución a 4 °C hasta 12 meses.
    4. Prepara 10 mL de tampón de permeabilización añadiendo 50 μL de Triton X-100 a 9,5 mL de PBS. Llena hasta 10 mL para una concentración final de 0,5% (v/v) de Triton X-100. Almacena a 4 °C y úsalo en un mes.
    5. Preparar 50 mL de tampón de inmunofluorescencia (IF) añadiendo 50 μg de albúmina sérica bovina (BSA), 100 μL de Triton X-100 y 25 μL de Tween-20 a 45 mL de PBS. Llena hasta 50 mL para una concentración final de 0,1% (v/v) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 y 0,05% (v/v) Tween-20. Almacena a 4 °C y úsalo en un mes.
    6. Prepara 10 mL de tampón bloqueador añadiendo 1 mL de suero animal a 9 mL de tampón de ayuno intermitente para una concentración final del 10% de suero. Almacena a 4 °C y úsalo en un mes.
      NOTA: La identidad del suero por especie depende de la especie hospedadora de los anticuerpos fluorescentes secundarios utilizados (véase 2.2.4).
    7. Descongelar el gel ECM (concentración total de proteínas ~9-9,5 mg/mL) a 4 °C durante la noche. Preparar alicotas de 500 μL en tubos microcentrífugas de 1,5 mL y almacenarlos a -20 °C.
      NOTA: El gel de ECM es muy variable y debe verificarse para inducir el comportamiento esperado en cada tipo celular. Diferentes tipos celulares pueden requerir distintas concentraciones de proteínas o rigidez de la matriz.
      NOTA: Siempre utiliza puntas y recipientes de pipeta preenfriados al manipular gel ECM para evitar la polimerización a temperatura ambiente. Siempre mantén el gel ECM en hielo durante el manejo.
  2. Diferenciación de adipocitos
    1. Siembra entre 50.000 y 80.000 preadipocitos 3T3-L1 en 0,5 mL de medio de crecimiento estándar en 2 pozos de una lámina de cámara de 4 pozos. Los pozos vacíos se utilizarán para controles sin adipocitos y medios acondicionados.
      NOTA: Los cultivos celulares de portaobjetos en cámara son propensos a alteraciones mecánicas. Evita la aspiración al vacío del medio y utiliza una técnica suave de pipeteo con pipeteos manuales.
    2. Sembra entre 50.000 y 80.000 preadipocitos 3T3-L1 en 0,5 mL de medio de crecimiento estándar en un solo pozo de una placa de cultivo tisular de 24 pozos. Esto se utilizará para recoger medios condicionados para el control de medios condicionados.
    3. Permite que ambas culturas alcancen la confluencia del 100% en 24 horas.
    4. Iniciar la adipogénesis reemplazando el medio de crecimiento por un medio de inicio de adipogénesis, compuesto por DMEM suplementado con 10% FBS, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) y 1 μM dexametasona. Incubar las células durante 48 horas a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 .
    5. Tras 48 horas, se sustituye el medio gastado por un medio de progresión de adipogénesis fresco, compuesto por DMEM con 10% FBS y 10 μg/mL de insulina. Incubar células durante otras 48 horas a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
    6. Antes de continuar con el cocultivo 3D, confirma visualmente la presencia de gotas lipídicas en el >60% de las células. Si la acumulación de gotas lipídicas es lenta, sustituye el medio de progresión por DMEM suplementado con FBS al 10% y monitoriza el contenido lipídico cada 24 horas.
  3. Superposición y mantenimiento de la cocultura 3D
    1. Descongela gel ECM a 4 °C durante la noche antes de continuar con la superposición.
      NOTA: Para evitar efectos de variabilidad de lote a lote, se recomienda usar el mismo lote de gel ECM para todos los experimentos dentro de un mismo estudio.
    2. Tras la diferenciación exitosa de los 3T3-L1, se retira el medio de cultivo gastado, dejando un pequeño buffer de ~50 μL de medios.
    3. Añade cuidadosamente 110 μL de gel ECM a cada pozo de la lámina de la cámara que contiene adipocitos, teniendo cuidado de no alterar la monocapa de adipocitos.
      NOTA: El gel ECM se solidifica rápidamente a temperatura ambiente. Para evitar una polimerización prematura de la matriz, siempre mantenga el gel ECM sobre hielo y utilice puntas preenfriadas a -20°C.
    4. Añade 110 μL de gel ECM al pozo de control vacío sin adipocitos. Para asegurar una distribución uniforme de Matrigel, añade en caída hacia las esquinas del pozo y el centro del pozo. Utiliza la punta de la pipeta para extender suavemente el Matrigel sobre la superficie del cultivo sin raspar.
    5. Incuba la lámina durante 1 hora a 37 °C para permitir que el gel ECM se polimerice.
    6. Durante este paso de incubación, recoge y cuenta las células MDA-MB-231
      OPCIONAL: Consulta el paso 1.4 para detalles sobre el marcado fluorescente de estas células.
    7. Prepara una suspensión diluida de células MDA-MB-231 a 30.000 células/mL en un medio de crecimiento mamario que contenga gel ECM (v/v) al 2%.
      NOTA: La densidad óptima de siembra de células varía entre tipos de células y debe optimizarse antes de la experimentación. NOTA: El medio de crecimiento mamario es un medio de cultivo celular disponible comercialmente optimizado para células epiteliales mamarias. Contiene 0,4 % de extracto de la hipófisis bovina, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (humano recombinante), 5 μg/mL de insulina (humana recombinante) y 0,5 μg/mL de hidrocortisona. El medio de cocultivo debe elegirse cuidadosamente para adaptarse a las necesidades de ambos tipos celulares.
    8. Una vez que el gel ECM se haya polimerizado, añade suavemente 450 μL de suspensión MDA-MB-231 a cada pozo. Esto da lugar a un recuento total de células de 13.500 células por pozo.
      NOTA: En este paso es posible una superposición desigual de la suspensión celular sobre el gel. Evalúa visualmente los laterales de la cámara y golpea suavemente todos los lados para distribuirla de forma uniforme.
    9. Al cultivo de adipocitos en la placa de 24 pozos, añadir 450 μL de medio de crecimiento mamario que contenga gel ECM (v/v) al 2%. Cosecha y cambia el medio cada 48 horas.
    10. Mantén la co-cultura durante un máximo de 5 días, con cambios de medios cada 48 horas.
      NOTA: Abstén la aspiración al vacío y utiliza pipeteo suave. El desprendimiento del gel de ECM es un posible problema que puede surgir durante el mantenimiento del cocultivo.
    11. Solo para el medio condicionado para el pozo de control, los adipocitos diluidos extraídos (del paso 1.3.9) condicionaron el medio 1:1 con medios frescos antes de reemplazar el medio de cocultura gastado en los días 2 y 4.
      NOTA: En este punto, el periodo de cocultivo ha finalizado y debe analizarse fijando y teñiendo los cultivos para determinar la morfología y expresión de marcadores ( véase la sección 2) o extrayendo células del entorno de cocultivo y preparando las células para análisis posteriores ( véase la sección 3).
  4. Etiquetado de células fluorescentes (Opcional)
    NOTA: El marcado de células superpuestas puede realizarse antes del paso 1.3.7 para ayudar a identificar células superpuestas durante la captura de imágenes por inmunofluorescencia.
    1. Prepara una solución de 5 mM de éster succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) disolviendo 10 mg de CFSE en 4,22 mL de DMSO. Almacena 500 μL de aliteras a -20 °C, protegidas de la luz.
    2. Después de contar las células del paso 1.3.6, lava las células una vez con 5 mL de PBS. Resuspende el pellet resultante en 1x PBS hasta una concentración final de 1.000.000 de células/mL.
    3. Añadir 1 μL de 5 mM de CFSE por mL de suspensión celular para lograr una concentración final de trabajo de 5 μM. Incubar la suspensión celular durante 20 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.
    4. Apaga la tinción CFSE añadiendo 5 volúmenes de medio de cultivo. Incuba 5 minutos adicionales a temperatura ambiente.
    5. Haz las células en pellet y lávate dos veces con PBS para eliminar el CFSE residual. Resuspende células en un medio de crecimiento mamario precalentado. Incuba durante otros 10 minutos a temperatura ambiente para asegurarte de que no quede tinte.
    6. Semillar células marcadas con fluorescencia como se describe en el paso 1.3.7. El resto del protocolo puede llevarse a cabo tal y como se describe.

2. Inmunofluorescencia

  1. Fijación
    NOTA: Para evitar la despolimerización del gel ECM y la pérdida de muestras durante el lavado, deja que todos los reactivos se equilibren a temperatura ambiente durante ~30 minutos antes de su uso.
    1. Tras 5 días de cocultivo, sustituye el medio por 500 μL de PBS.
      NOTA: Los pasos 2.1.2 a 2.3.7 pueden realizarse en condiciones no estériles.
    2. Retira PBS y sustituye por paraformaldehído al 2% (PFA) en PBS (preparado fresco) a temperatura ambiente durante 10 minutos.
      NOTA: El gel ECM es sensible al PFA y puede provocar el desprendimiento de la capa de gel.
      PRECAUCIÓN: El PFA se descompone en formaldehído con el tiempo. Evita inhalar vapores, asegúrate de tener una ventilación adecuada y siempre lleva el equipo de protección personal adecuado (es decir, guantes, bata de laboratorio, protección ocular) al manipular PFA.
    3. Retira el PFA y lava los pozos con 500 μL de solución de lavado PBS-Glicina durante 15 minutos a temperatura ambiente con una agitación suave.
      NOTA: El uso de lavado con PBS-Glicina es fundamental para evitar que los aldehídos libres produzcan fluorescencia de fondo. No laves con PBS sin glicina.
    4. Repite el paso 2.1.3 dos veces para un total de tres lavados. Consulta la 2.1.5 para las condiciones de almacenamiento, salta al paso 2.2.2 si no es necesario.
    5. En este punto, el protocolo puede pausar hasta una semana y el portaobjetos puede almacenarse a 4 °C. Para almacenar la lámina, llena todos los pozos con 1 mL de PBS y sella la tapa de la lámina con una fina cinta de parafilm. Coloca la lladera plana en un recipiente impermeable, sobre un tejido delicado y mojado para asegurarte de que los cultivos no se sequen.
  2. Tinción por anticuerpos
    1. Lleva las láminas previamente almacenadas a temperatura ambiente, retira el PBS y lava los pozos con 500 μL de PBS fresco durante 15 minutos con una agitación suave. Sáltate este paso si continúas directamente desde el paso 2.1.4.
    2. Permeabiliza las células con 500 μL de tampón de permeabilización durante 15 minutos a temperatura ambiente sin agitación.
    3. Lava los pozos con 500 μL de PBS, con 15 minutos de agitación suave. Repite dos veces para un total de 3 lavados.
    4. Añade 500 μL de tampón bloqueante a cada pozo e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con una agitación suave.
      NOTA: Asegúrese de que la especie fuente del suero en el tampón bloqueador coincida con la especie hospedadora del anticuerpo secundario. En este protocolo, usamos suero de burro y anticuerpos secundarios de burro.
    5. Diluir los anticuerpos primarios de interés en el amortiguador de FI, según las recomendaciones del fabricante. Retira el tampón bloqueante y añade 300 μL de solución diluida de anticuerpos a cada pozo.
    6. Sella la tapa de la corredera de la recámara con parafilm y coloca la llave en un recipiente a prueba de luz. Incuba durante la noche a 4 °C con una agitación suave.
    7. Lava los pozos con 500 μL de tampón de FI, con 15 minutos de agitación suave. Repite dos veces para un total de 3 lavados.
    8. Diluir el anticuerpo secundario marcado fluorescentemente adecuado en el tampón de jeun intermitente, según las recomendaciones del fabricante. Añade 300 μL de dilución secundaria de anticuerpos a cada pozo e incuba durante 1 hora a temperatura ambiente con una agitación suave.
      NOTA: Evita la exposición prolongada a la luz después de este paso para limitar el fotoblanqueamiento.
    9. Repite el paso 2.2.7.
    10. Diluir una solución original de 300 μM de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:800 en PBS. Añade 300 μL a cada pozo e incuba durante 20 minutos, a temperatura ambiente, con una agitación suave.
    11. Lava las células con 500 μL de PBS durante 5 minutos con una agitación suave. Repite una vez.
  3. Montaje de corredera
    1. Elimina la mayor cantidad posible de PBS residual sin alterar los cultivos. Vuelve a poner la tapa y separa la cámara de la corredera de vidrio usando la herramienta proporcionada por el fabricante de la corredera.
    2. Utilizando un pañuelo delicado, limpia los bordes de la lámina para eliminar el PBS residual sin alterar el gel ECM.
    3. Aplica lentamente sellador de silicona alrededor de los bordes de la llanta usando una jeringuilla y una aguja de 18G. Deja 3 minutos para que la silicona se asiente.
    4. Mientras la silicona se asienta, añade 1-2 gotas de medio antifundido en cada pozo. Evita las burbujas. Si se forman burbujas, utiliza una pipeta para retirarlas cuidadosamente sin dañar el cultivo.
    5. Después de que la silicona se haya fijado, baja suavemente una capa de vidrio en un ángulo poco pronunciado. Utiliza pinzas o una punta de pipeta para expulsar las burbujas de aire mientras se baja la cubierta. Aplica una presión suave para evitar romper la funda.
    6. Coloca la lámina en un recipiente a prueba de luz a temperatura ambiente y déjala reposar toda la noche. El portaobjetos puede almacenarse a 4 °C y el protocolo puede pausar hasta una semana.
      NOTA (Opcional): Para sellar mejor las correderas, aplica esmalte transparente en los bordes de la cubierta 1 hora después de la cubierta.
    7. Imágenes de diapositivas usando un microscopio de fluorescencia confocal con un aumento de 10-20x. Captura cinco campos de visión aleatorios para minimizar el sesgo del operador.

3. Co-cultivos de extracción para análisis aguas abajo

NOTA: La extracción de células o biomoléculas es incompatible con la inmunofluorescencia. Se recomienda cultivar cocultivos destinados a otros análisis aguas abajo en platos estándar de cultivo de 24 pozos utilizando las mismas concentraciones y volúmenes celulares que se describen en las secciones 1 y 2.

  1. Extracción celular
    1. Retira el medio usado y lava suavemente los pozos con PBS bien frío. Repite una vez para un total de dos lavados.
    2. Utilizando una punta de pipa de gran calibre, añade 1 mL de solución de recuperación de celdas heladas, denominada en adelante solución de recuperación. Pipetea suavemente arriba y abajo para romper la capa de gel ECM. Transfiere líquido a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: La solución de recuperación celular es una solución no enzimática comercialmente disponible diseñada para liberar suavemente células incrustadas en el gel de ECM. Es una composición propietaria y puede ser incompatible con ciertos tipos de células. Como alternativa, se puede considerar la despolimerización enzimática del gel ECM utilizando proteinasas suaves como Dispase o Accutasa. Esto requerirá incubaciones a 37 °C junto con la optimización del tiempo de incubación.
    3. Añadir 250 μL de solución de recuperación helada a cada pozo para recoger las celdas restantes. Transfiere al tubo microcentrífuga correspondiente.
    4. Invierte los tubos 4-5 veces para mezclar.
    5. Transfiere los tubos al hielo y incuba durante 60 minutos con una agitación suave. Cada 10 minutos, invierte los tubos 2-3 veces para evitar que el contenido del tubo se asiente.
    6. Tubos de centrífuga a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C
    7. Verifica la presencia de una pastilla celular visible. Retira con cuidado el sobrenadante y añade 1 mL de 1x PBS bien frío. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C. Repite una vez para un total de dos lavados. Espera que el pellet contenga entre el 80 y el 90% de las células inicialmente sembradas, manteniendo las proporciones de cada tipo de célula constantes.
      NOTA: En este punto, el pellet celular puede ser lisado para recoger proteínas o ácidos nucleicos. Los pellets lisados pueden almacenarse a -80 °C, y el protocolo puede pausar durante 3 meses. La lisis es incompatible con la 3.2.
  2. Preparación de suspensión de celda única
    1. Resuspende el pellet en 200 μL de 0,25% de tripsina-EDTA. Luego, incuba a 37 °C durante 3-4 minutos.
    2. Añadir 600 μL de medio de crecimiento completo para apagar la digestión de tripsina.
    3. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Elimina el sobrenadante y añade 500 μL de PBS a temperatura ambiente.
    4. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Repite una vez para un total de dos lavados.
    5. Resuspender el pellet en 80 μL de PBS con 0,04% de BSA, filtrar la suspensión usando un colador de celda de 40 μm.
    6. Diluir 5 μL de suspensión en 5 μL de azul tripán. Cuenta las células y evalúa la viabilidad con un hemaciómetro. Las celdas ya están listas para análisis aguas abajo.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para demostrar la eficacia de este protocolo en el estudio de los efectos de las interacciones célula-célula a través de una membrana basal, se han reutilizado las Figuras 2 y 3 de una publicación anterior (Pallegar et al.16) como resultados representativos. Las Figuras 4 y 5 son datos novedosos que han sido generados para mostrar la adaptabilida...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La falta de interacciones complejas entre células en el cultivo celular tradicional pone de manifiesto la necesidad de modelos mejorados de órganos y tejidos para estudiar con mayor precisión las respuestas a los fármacos y la progresión de la enfermedad in vivo. El desarrollo de sistemas de cocultivo 3D ha contribuido a cubrir esta carencia al permitir el estudio de las consecuencias de las interacciones célula-célula sin necesidad de estudios in vivo...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo del método fue parcialmente financiado por la Sociedad de Investigación del Cáncer. GRK contó con financiación proporcionada por la beca de posgrado Carol Ann Cole de la Sociedad Canadiense del Cáncer a través del Programa de Formación en Investigación del Cáncer del Instituto de Investigación del Cáncer Beatrice Hunter. El PMMB contó con el apoyo de la subvención del programa MOBILITAS (2024) del Instituto de Investigación en Salud de las Islas Baleares (IdISBa). La Figura 1 fue creada usando BioRender.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de cultivo de tejidos de 24 pozosCorning3524
Vidrio de cubierta de 24 x 60 mmUltident Scientific170-C2460
4% de paraformaldehído en PBSInvitrogenJ61899. AKDiluido al 2% en 1x PBS
Diapositivas de cultura con 4 pozos con cámaraHalcón354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragmento de Burro Anti-Cabra IgG (H+L)Jackson Inmunoresearch Laboratories Inc.705-607-003
Hemacitómetro de línea brillanteHausser Scientific3120
Kit de proliferación CFSE CellTraceInvitrogenC34570
Solución de Recuperación CelularCorning354253
DAPISigma-Aldrich Canada Co.D9542
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado contra IgG de Ratón (H+L), DyLight 594InvitrogenSA5-10168
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo Secundario Altamente Adsorbido Cruzado, Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, sin fenol rojoGibco21041025
Medios Eagle modificados de Dulbecco, alta glucosa, piruvatoGibco11995-065
Suero fetal bovino, origen en CanadáGibco12483-020
Coladores celulares Flowmi, 40 y micro; MBel-Art136800040
Ventana y puerta de silicona GE Advanced, transparenteHenkel International2811093
Policlonal de Cabra Anti ZO-1SantaCruz BiotecnologíaSC8146Anticuerpos primarios, descontinuados
Anti ZO-1 monoclonal de rataSantaCruz BiotecnologíaSC33725Anticuerpo primario alternativo para reemplazar el antiZO-1 SC8416 descontinuado
Medio basal de células epiteliales mamariasPromocellC-21210
Matrigel, sin fenol rojo, factor de crecimiento reducido, sin LDEVCorning356231Concentración de proteínas: 9-9,6 mg/mL
Anti-Vimentina monoclonal de ratónSigma-Aldrich Canada Co.V2258Anticuerpo primario
Suero para terneros recién nacidos, origen en Nueva ZelandaGibco16010159
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4Gibco10010023
Montaje antifade de oro ProLongInvitrogenP36934
Anti-E-Cadherin purificado para ratonesBD Biociencias610181Anticuerpo primario
Conejo Anti-Claudin policlonal 7 AbcamAB27487Anticuerpo primario
RPMI 1640, GlutaminaGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Tinte azul de tripán (0,4%)Gibco15250-061
Tripsina 0,25%-EDTAGibco25200056

References

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