Presentamos un protocolo para el análisis cuantitativo de moléculas o iones en compartimentos subcelulares de células vivas utilizando biosensores basados en transferencia de energía por resonancia Förster (FRET). Incluye imágenes estandarizadas, procesamiento de máscaras binarias y análisis ratiométrico con regresión lineal aplicada al fosfato en Arabidopsis thaliana (A. thaliana), pero es ampliamente aplicable a otros biosensores y organismos.
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Artículo de método
El análisis ratiométrico cuantitativo de biosensores basados en FRET en Arabidopsis thaliana permite la medición en tiempo real de analitos en compartimentos subcelulares
En este artículo
Resumen
Resumen
Los biosensores fluorescentes proporcionan un enfoque no invasivo y versátil para monitorizar cambios dinámicos en las concentraciones de metabolitos o iones dentro de las células vivas. Específicamente, los biosensores basados en FRET permiten mediciones ratiométricas que informan los niveles de analitos subcelulares siendo independientes de los niveles de expresión de los biosensores. Describimos un protocolo integral y estandarizado para el análisis ratiométrico cuantitativo de biosensores basados en FRET en plantas. El protocolo guía a los usuarios mediante la preparación de muestras en vivo, adquisición de imágenes confocales de donantes, canales FRET y aceptores, generación de máscaras binarias para regiones subcelulares de interés, seguida de análisis de datos ratiométricos basados en regresión. El resultado principal es una lectura ratiométrica derivada de regresión que permite comparaciones cuantitativas entre genotipos, tejidos, etapas de desarrollo y condiciones de tratamiento. Usando el biosensor cpFLIPPi-5.3m para fosfato inorgánico como ejemplo, demostramos la medición de los niveles de fosfato inorgánico en el estroma de cloroplasto de A. thaliana. Este marco analítico es ampliamente aplicable a otros biosensores y sistemas modelo basados en FRET, permitiendo la cuantificación espaciotemporal precisa de metabolitos e iones in vivo. Esta estrategia ofrece conocimientos medibles sobre la dinámica subcelular de metabolitos e iones, apoyando comparaciones en entornos experimentales variados.
Introducción
Monitorizar la dinámica de metabolitos e iones en células vegetales vivas es esencial para entender cómo se coordinan las vías metabólicas y las redes de señalización en espacio y tiempo para apoyar el crecimiento ydesarrollo 1,2. Los niveles de metabolitos celulares fluctúan rápidamente en respuesta a señales ambientales como la disponibilidad de nutrientes, la intensidad de la luz y elestrés 3. Entre estos, el nivel de fosfato inorgánico (Pi) es especialmente importante y tiene roles clave en la transferencia de energía, la señalización y la regulación metabólica, aunque su dinámica subcelular sigue siendo difícil de medir4.
Los ensayos colorimétricos estándar y la resonancia magnética nuclear de fósforo-31, (³¹P)-RMN, pueden estimar el Pi total o compartimental, pero carecen de resolución de célula única y tienen una precisión temporallimitada de 5,6. Aunque la espectrometría de rayos X sincrotrón y la imagen por radiotrazador proporcionan información subcelular o de flujo, no pueden distinguir de forma fiable el Pi de los metabolitos fosforilados y suelen ser invasivos. La fraccionación no acuosa y los ensayos cinéticos basados en enzimas ofrecen estimaciones indirectas de la Pi estromalica y citosólica, pero estos enfoques requieren mucho trabajo y son susceptibles a la contaminación 7,8. En conjunto, estas limitaciones subrayan la necesidad de métodos no destructivos con alta resolución espacial y temporal para monitorizar metabolitos como Pi, como la imagen en vivo de biosensores basados en FRET.
Los biosensores basados en FRET codificados genéticamente son herramientas poderosas para análisis in vivo de la dinámica intracelular de iones y metabolitos. Estudios tempranos demostraron la utilidad de estos biosensores para monitorizar las concentraciones de glucosa, sacarosa y ATP en las células 9,10,11. Avances más recientes han ampliado este enfoque para monitorizar calcio, nitrato, fosfato, auxina, ácido abscisico y gibberelina, proporcionando información valiosa sobre la regulación de nutrientes yhormonas 12,13,14,15,16.
cpFLIPPi-5.3m es un biosensor Pi basado en FRET optimizado para monitorizar niveles subcelulares de Pi en célulasvegetales 17. Este biosensor consiste en una proteína que se une a Pi a cianobacterias flanqueada por un donante de FRET (eCFP, proteína fluorescente cian mejorada) y un aceptor de FRET (cpVenus, una variante modificada de la proteína fluorescente amarilla de Venus), y experimenta un cambio conformacional al unirse a Pi. Este cambio altera la señal de fluorescencia derivada de FRET dependiente de Pi, que se captura mediante imágenes confocales de modo que un aumento en la concentración de Pi resulta en una disminución de la relación FRET/donante. El análisis ratiométrico dependiente de Pi se realiza durante el post-procesamiento de imágenes comparando las intensidades de las emisiones del aceptor y deldonante 18.
El análisis cuantitativo ratiométrico de FRET en tejidos vegetales vivos requiere corrección para la hemorragia espectral y la excitación cruzada de los fluoróforos donante (CFP) y aceptor (cpVenus), respectivamente18. El bleed-through surge cuando se detecta la emisión de CFP en el canal FRET, mientras que la excitación cruzada resulta de la excitación de cpVenus durante la excitación CFP. Estos artefactos espectrales pueden variar entre células y compartimentos subcelulares, especialmente en tejidos vegetales pigmentados, y por tanto confunden las mediciones ratiométricas. Para obtener una emisión corregida o sensibilizada de FRET, se restan las contribuciones de sangrado y excitación cruzada de la señal cruda del FRET de la siguiente manera:
Emisión de FRET sensibilizada = Emisión de FRET en bruto - filtración - excitación cruzada
Los factores de corrección para la hemorragia y la excitación cruzada se determinan mediante imágenes de plantas que expresan CFP o cpVenus individualmente en las mismas ubicaciones celulares y subcelulares que elbiosensor 18. La emisión de FRET sensibilizada se calcula de la siguiente manera:
Emisión de FRET sensibilizada = Emisión de FRET en bruto - (emisión de CFP × factor de corrección de filtro) - (emisión de cpVenus × factor de corrección de excitación cruzada)
La relación entre la emisión de FRET sensibilizada y la emisión del donante (relación FRET) informa de cambios relativos en la concentración de ligandos y es independiente de los niveles de expresiónde biosensores 19.
El biosensor cpFLIPPi-5.3m ha sido dirigido con éxito a compartimentos subcelulares distintos de A. thaliana y otras especies, permitiendo la visualización de la dinámica Pi 18,20,21,22. Este biosensor reveló heterogeneidad en la distribución y el transporte citosólico de Pi entre tejidos y ha relacionado las fluctuaciones estromales Pi de los cloroplastos con la actividad del transportador y el rendimientofotosintético 20,21. Dado que el biosensor informa de cambios dentro de un rango dinámico definido, la interpretación requiere que el rango abarque niveles Pi in vivo bajo condiciones de imagen estables. La iluminación desigual o la abundancia muy baja de biosensores pueden influir en las mediciones ratiométricas, destacando la importancia de los ajustes de adquisición estandarizados y los controles negativos apropiados, como el sensor de controlinsensible a Pi 20. Cuando la variación de la razón FRET entre regiones de interés (ROI) es mínima, el análisis de regresión puede no ser apropiado y se recomienda agrupar las medias del ROI.
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para el análisis ratiométrico cuantitativo de cpFLIPPi-5,3m en A. thaliana, incluyendo imágenes confocales, segmentación de imagen mediante máscaras binarias y cálculos de la relación FRET para el monitoreo dinámico de Pi en células vivas. Este método proporciona un flujo de trabajo reproducible para analizar señales de biosensores basadas en FRET, con datos ratiométricos analizados mediante regresión lineal y comparaciones estadísticas entre condiciones experimentales. Se muestran datos representativos utilizando acumulación alterada de estroma Pi de cloroplasto en pht2; 1, un mutante transportador Pi cloroplasto que expresa el sensor cpFLIPPi-5.3m 21,23. Este protocolo ayudará a los investigadores a aplicar la imagen ratiométrica basada en FRET a otros sistemas experimentales detallando correcciones espectrales de biosensores, ajustes de imagen y pasos de análisis cuantitativo. Al estandarizar la adquisición de imágenes y el análisis basado en regresión dentro de contextos experimentales definidos, el flujo de trabajo permite la comparación consistente de las respuestas FRET entre muestras analizadas bajo condiciones de emparejamiento. Es adecuado para quienes buscan medir cambios rápidos y específicos de compartimentos en los niveles de analito en tejidos vegetales vivos, incluidos mutantes o líneas transgénicas con alteración del transporte o metabolismo de metabolitos. Este enfoque estandarizado facilitará la reproducibilidad de los estudios cuantitativos de imagen de células vivas en biología vegetal. Además de la biodetección Pi localizada en cloroplastos descrita aquí, la estrategia analítica puede adaptarse a otros biosensores basados en FRET y tejidos específicos de organismos, siempre que se establezcan mediciones de calibración y control específicas de biosensores.
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Protocolo
NOTA: Las líneas transgénicas de Arabidopsis que expresan cpFLIPPi-5.3m y cpFLIPPi-nulo (variantes citosólicas y dirigidas a plastidos) se generaronpreviamente 17,18 y pht2; El 1-1 (CS19883) se obtuvo del Centro de Recursos Biológicos Arabidopsis, medio MS, gafas de cubierta, perfluorodecalina, microscopio confocal y un objetivo de inmersión en aceite de 40x (apertura numérica 1.3), láseres de excitación (CFP/445 nm y cpVenus/515 nm o longitudes de onda de emisión apropiadas al instrumento), filtros de emisión para CFP, cpVenus/FRET y aceptor cpVenus, cámara o detectores, estación de trabajo de análisis de imágenes, FIJI24 y Excel.
1 . Preparación de muestras
- Generación de líneas transgénicas de A. thaliana
- Clonar los biosensores cpFLIPPi-5.3m, y controles insensibles a Pi-insensibles (cpFLIPPi-Null), solo donante (CFP) y solo aceptor (cpVenus) en vectores de expresión vegetal17.
- Para una expresión estable, transformar plantas de A. thaliana en el fondo mutante SGS3-13 mediante dip floral de Agrobacterium tumefaciens , cosechar semillas de T1 y seleccionar transformantes en placas de agar de Murashige & Skoog (MS) 0,5x que contengan el agente de selección adecuado, por ejemplo, fosfinotricina (10 μg/mL).
- Esteriliza las semillas de A. thaliana que expresan los biosensores sumergiéndolas en etanol al 70% durante 1 minuto, transfiere a lejía al 50% durante 1 minuto y luego enjuaga 6-10 veces con agua estéril.
PRECAUCIÓN: El etanol y la lejía son irritantes y deben manipularse mientras se lleva el equipo de protección personal (EPP) adecuado. Realiza la esterilización de semillas en una campana extractora química o en un área bien ventilada para evitar la inhalación de vapores y nunca mezcles lejía y etanol directamente. Eliminar las soluciones de residuos según las directrices de seguridad química de la institución. - Estratificar las semillas a 4°C en la oscuridad durante 2-3 días para sincronizar la germinación, luego transfiere las semillas a un medio MS solidificado con agar o líquido 0,5x que contenga un 0,25% de sacarosa y la concentración deseada de Pi (250 μM) para el diseño experimental. Incluye al agente de selección si seleccionas transformantes.
- Transfiere las placas a una cámara de crecimiento controlada ajustada a 21°C, 16 h de luz: 8 h de fotociclo oscuro, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ de intensidad de luz y ~60% de humedad relativa. Cultiva plántulas durante 4-7 días para imaginar raíces o transfiere plántulas al suelo durante 21 días para hacer imágenes de hojas.
- Si se prueban tratamientos con Pi, transfiere las plántulas al medio de Pi deseado (por ejemplo, 250 μM de Pi para el Pi completo; 10 μM de Pi para el deficiente en Pi) y mantener el tratamiento durante el periodo definido (por ejemplo, 48 h para privación aguda de Pi).
- If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-10x magnification).
- Evalúa las líneas del mismo fondo genético que expresan cpFLIPPi-nulo como controles insensibles a ligandos.
2 . Imagen confocal
- Para las raíces, monta las plántulas en su medio de crecimiento/agua estéril sobre un portaobjetos de cristal. Aplica suavemente una pequeña capa para aplanar las raíces sin compresión. Haz la imagen inmediatamente.
- Para las hojas, extirpe la hoja objetivo (por ejemplo, la tercera o cuarta hoja en plantas de 21 días), coloca la superficie adaxial en un portaobjetos.
- Infiltra con 10-15 μL de perfluorodecalina para despejar los espacios de aire si es necesario, y superpon suavemente un pequeño peso de vidrio para aplanar la muestra. Haz la imagen inmediatamente.
- Utiliza un objetivo de alto NA adecuado para células vivas (por ejemplo, 40× / 1.2-1.3 NA). Utiliza el mismo objetivo para todas las muestras para mantener la comparabilidad.
- Utilizando el software Metamorph, configura los canales de excitación y emisión y captura imágenes (Figura 1).
NOTA: Para capturar la emisión del donante (CFP): se podría utilizar excitación a ~445 nm (o línea CFP adecuada al instrumento) y recogida de emisión donante (por ejemplo, paso de banda de 470-500 nm). Por ejemplo, se utilizó la excitación del láser de 445 nm al 70% (Figura 1A) con un tiempo de exposición de 1000 ms (Figura 1B) para capturar la emisión de CFP. Para capturar el FRET (emisión del aceptor sensibilizado): excitación en longitud de onda donante (445 nm) y recogida de la banda de emisión del aceptor (por ejemplo, 530-560 nm). Para capturar el canal aceptor directo: excitación en excitación aceptor (por ejemplo, 500-515 nm) y recogida de la misma banda de emisión del aceptor que para FRET. - Adquiere imágenes secuencialmente: captura excitación/emisión donante, excitación donante/emisión de trastes, y luego excitación aceptor/emisión aceptor. Mantén el tiempo de imagen por campo corto para limitar el fotoblanqueo (500-1000 ms).
NOTA: Para cada localización celular (citosol de raíz, citosol mesófilo foliar, estroma de cloroplastos), determinar la potencia óptima del láser, la ganancia del detector y el tiempo de exposición (Figura 1) de modo que la intensidad media de los píxeles esté por encima del fondo local pero por debajo de la saturación del detector. Mantener la misma configuración de captura para los canales derivados de excitación donante (donante y FRET) para una ubicación determinada. Los parámetros de imagen dependen de la muestra, microscopio, fuente de luz y sistema de detección, por lo que deben determinarse empíricamente, evaluando y documentando rangos aceptables mediante análisis de regresión según se describe en este protocolo. El software de captura de imágenes que se utiliza aquí es Metamorph versión 7. - Utiliza la misma sensibilidad del detector (por ejemplo, aquí, se usó una ganancia de 2,4x y desplazamiento cero) en todas las imágenes para la ubicación del objetivo. Si se utilizan múltiples detectores, caracterízase las respuestas espectrales de cada detector y documentarlas.
- Adquiere imágenes de control para cada tejido/genotipo de interés.
- Imagen de tejido silvestre sin transformar para determinar la autofluorescencia de fondo para cada canal.
- Imágenes de plantas que expresan solo donante (CFP) y solo aceptor (cpVenus) con los mismos ajustes de captura para cada ubicación para derivar coeficientes de corrección espectral (sangrado y excitación cruzada). Captura imágenes de múltiples individuos (≥6-8) con un rango de intensidades de emisión.
3 . Procesamiento de imágenes
- Abre las imágenes en bruto de los canales de donante (denominados CC para excitación/emisión por donante), FRET (CY para excitación/emisión de aceptor donante) y receptores (YY para excitación/emisión por aceptador) en software de análisis como FIJI o ImageJ. (Figura 2).
- Determinar la intensidad media de fondo por canal muestreando múltiples (5-10) ROIs en ubicaciones equivalentes de plantas no transformadas con imágenes con los mismos ajustes. Resta el valor medio de fondo de cada imagen de canal correspondiente.
- Pasos a seguir en FIJI
- Haz clic en Analizar la pestaña> Establecer Medidas > Seleccionar el valor gris medio. Mide la intensidad de fondo eligiendo un ROI específico o una media de toda la imagen.
- Haz clic en Analizar en pestañas> Medir. Guarda los valores en una hoja de Excel y calcula valores medios de fondo para cada canal. Umbraliza la imagen del donante (CFP) para definir el límite espacial del biosensor (el donante suele tener la señal más baja). Convierte la imagen donante con umbral a una máscara binaria (Figura 3 A).
- Haz clic en la imagen de la pestaña> ajustar> umbral.
- Se abrirá una ventana para el umbral. Elige el método de Max Entropy para el umbral. Establecemos el límite espacial, en este caso el estroma del cloroplasto, y aplicamos el umbral. Esto genera una imagen binaria en blanco y negro (Figura 3 B).
- Haz clic en pestaña Matemáticas> Dividir> Introduce el valor 255. La imagen se volverá completamente blanca. Guarda esta imagen binaria de máscara como un archivo .tiff.
- Multiplica la máscara binaria por las tres imágenes relevadas de fondo para crear imágenes enmascaradas para análisis (Figura 3C).
- Abre el archivo binario de máscara en FIJI.
- Haz clic en Proceso de pestaña> Matemáticas>Multiplicar.
- Elige la máscara binaria como una de las imágenes y la imagen CC con fondo como la otra.
- Repite los pasos para CY y YY.
- Dibuja los ROI de las imágenes enmascaradas apropiadas a la estructura estudiada (célula entera, citosol, estromalo de cloroplastos). Para cada ROI, extrae la intensidad media de píxeles para los canales donante, FRET y aceptor directo. Guarda los metadatos del ROI (nombre de la imagen, coordenadas, condición experimental, ID de réplica) para análisis estadísticos posteriores.
- Imágenes abiertas en CC, CY y YY.
- Haz clic en Pestaña Matemáticas> Restar> Introduce el valor medio de fondo. Alternativamente, esto se puede hacer justo antes de calcular el FRET sensibilizado en Excel.
- Abre el archivo de CC enmascarado.
- Haz clic en Pestañas Proceso > Calculadora de Imágenes. Multiplica CC con el archivo de imagen CC enmascarado. Esto abrirá un nuevo archivo de imagen de 32 bits.
- Dibuja los ROI usando las herramientas FIJI adecuadas en la barra de tareas principal. Por ejemplo, aquí el estroma del cloroplasto se selecciona usando la herramienta ROI "Oval". Añade los ROIs a un gestor de ROI (ctrl+T). Elige 5-10 ROIs por imagen. Marca "Mostrar todo". Estos ROIs pueden almacenarse como un metaarchivo separado (Figura 3D). No cierres el responsable de ROI.
- Haz clic en Analizar la pestaña> Establecer medidas> Seleccionar el valor gris medio.
- Haz clic en "Medir" en el gestor de ROI.
- Los valores medios de píxeles de los ROIs elegidos aparecerán como una lista en una ventana separada.
- Copia estos datos a Excel. No cierres el responsable de ROI.
- Repite la multiplicación del archivo CC enmascarado con las imágenes CY y YY para obtener mediciones de los mismos ROI usando el gestor de ROI en cada canal individual. Guarda los valores en Excel.
4. Análisis ratiométrico
- Abre Microsoft Excel para realizar las siguientes operaciones (Figura 4).
- Cálculo de los coeficientes de corrección.
- Para cada localización celular, representa las intensidades del canal FRET (eje Y) de plantas solo donantes frente a las intensidades del donante (eje X). Ajusta una regresión lineal. La pendiente es el coeficiente de sangrado del donante (designado como a).
- Repita representando las intensidades del canal FRET de plantas solo aceptadoras (eje Y) frente a las intensidades de los aceptores directos (eje X). La pendiente es el coeficiente de excitación cruzada del aceptor (designado como b).
- Utiliza ≥15-20 ROI de varias plantas para obtener coeficientes robustos. Para el estroma de cloroplastos, se eligen entre 50 y 60 cloroplastos.
- Calcular el FRET sensibilizado para cada ROI como
FRET sensibilizado = FRET crudo - (a × donador) - (b × aceptador)
donde a y b son coeficientes específicos de la ubicación derivados anteriormente (Figura 4). - Grafica las intensidades del FRET sensibilizado (eje Y) frente a las intensidades del canal donante (eje X) para los ROI agrupados. Ajusta una regresión lineal y Excel proporcionará un ajuste en el formato y = mx + c, donde y corresponde a las intensidades sensibilizadas del FRET, x a las intensidades del donante, c al intersección y y m a la pendiente de la regresión. Nótese R² para las regresiones ajustadas. Normalmente, R² varía de 0,8 a 1, lo que representa un buen ajuste (Figura 4).
- Para mediciones citosólicas y estromalas, calcula y utiliza la pendiente de FRET/donante (FRET sensibilizado ÷ donante) como lectura ratiométrica, también conocida como relación FRET.
NOTA: El error del ajuste para la regresión representa el error estándar de la pendiente (usar la función LINEST en Excel). Utiliza la selección específica de localización de forma consistente entre muestras y genotipos de interés. La regresión lineal aplicada a datos de múltiples ROIs y plantas independientes confirma que la relación FRET es independiente de la abundancia del sensor. - Calibración, controles y distinción de efectos inespecíficos.
- Utiliza cpFLIPPi-nulo (variante insensible al ligando) expresado en paralelo y procesado idénticamente para distinguir posibles cambios no específicos en la relación FRET (pH, fuerza iónica, fotofísica) de cambios específicos de Pi.
- Datos agregados a nivel de ROI con campos: genotipo, compartimento, planta replicada, ID ROI, donante, aceptor, FRET bruto, FRET sensibilizado, ratio ajustada (según corresponda). Conserva las intensidades crudas.
- Para comparaciones poblacionales, se utilizan las pendientes derivadas de la regresión como estadísticas primarias; informa de pendientes ± SE y % de error relativo.
- Aplicar estadísticas inferenciales apropiadas (por ejemplo, test t de Student o ANOVA) sobre parámetros derivados de regresión. Utiliza pruebas no paramétricas si las distribuciones violan la normalidad. Corrige las comparaciones múltiples cuando sea aplicable.
- Lista de control de calidad (antes de aceptar datos)
- Confirma que los tres canales de cada imagen están por debajo de la saturación del detector y tienen una relación señal-ruido adecuada (>2-10x de fondo).
- Confirmar que los controles de un solo fluoróforo por donante y aceptor se realizaron en configuraciones idénticas y se produjeron relaciones lineales para derivar los coeficientes de corrección a y b.
- Confirmar que el registro de imágenes es preciso y que las máscaras definen correctamente las regiones que contienen biosensores.
- Confirma que el control cpFLIPPi-nulo muestra la falta esperada de sensibilidad a Pi.
- Métricas representativas de control de calidad para ayudar a excluir imágenes
- Tasa de saturación: Menos del 1-2% de los píxeles alcanzan la intensidad máxima (65.535) para imágenes de 16 bits.
- Nivel de fondo: La intensidad media en regiones libres de células oscila entre ~50 y 200 unidades.
- Rango de intensidad de píxeles: Las intensidades medias están muy por encima del fondo pero permanecen por debajo de la saturación (~2.000-20.000 unidades).
- Relación señal-ruido (SNR): Los valores deben superar entre 2 y 10.
5. Prueba estadística para la diferencia entre dos pendientes de regresión
- Determinar si dos pendientes (pendientes de la razón FRET derivadas de regresión de dos genotipos o tratamientos) difierensignificativamente 25.
- Calcula la estadística de prueba y los grados de libertad de la siguiente manera
con grados de libertad df = n1 + n2 - 4. m1 y m2 corresponden a las pendientes de regresión lineal, sb1 y sb2 se refieren al error estándar de cada pendiente (obtenido de LINEST o de regresión) y n1 y n2 son los tamaños de muestra (número de retornos de inversión usados para ajustar cada regresión). - Obtén un valor p bilateral para t con df (por ejemplo, utiliza una tabla de distribución t o una calculadoraonline 26). Al utilizar la calculadora online (Figura 5C), introduce los sb1 y sb2 y n1 y n2 obtenidos en el paso anterior para calcular el valor p y las estadísticas de prueba.
- La interpretación será rechazar la hipótesis nula (las pendientes no son significativamente diferentes) si p < α (por ejemplo, α = 0,05). Informe b 1, b2, sb1, sb2, t, df y p.
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Resultados
Imagen confocal
Utilizando microscopía confocal y software Metamorph, se adquirieron canales separados para visualizar las señales donantes y aceptadoras de FRET en los tejidos foliares de A. thaliana de tipo salvaje (WT) y el pht2; 1 mutante transportador Pi de cloroplasto (Figura 2). Las imágenes representativas ilustran una clara localización subcelular del biosensor Pi, con cloroplastos fácil...
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Discusión
Este protocolo proporciona un enfoque estandarizado para la cuantificación de metabolitos o iones en células vivas utilizando biosensores basados en FRET. Las principales ventajas incluyen la medición ratiométrica no invasiva y la aplicabilidad a múltiples compartimentossubcelulares 17,20,21,22. El uso de máscaras binarias y regresión lineal mejora la precisión...
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés relacionados con esta obra.
Agradecimientos
Agradecemos las contribuciones de antiguos miembros del laboratorio W.K.V., cuyos esfuerzos han apoyado el desarrollo de este protocolo. El apoyo financiero fue proporcionado por el Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencia, el Programa de Tecnología de Bioimagen (DE-SC0014037) y Ciencias Básicas de la Energía (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. contó con el apoyo parcial de fondos del Hagler Institute for Advanced Study de la Universidad Texas A&M.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Objetivo de inmersión en aceite 40X | Olimpo | https://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P | Lente objetivo para imagen |
| Copas de cubierta / cubiertas | VWR | 48393-081 | Engobe de cubierta para colocar muestras |
| FIJI (ImagenJ) | Código abierto | 2.9.0 | Software de análisis de imágenes |
| Microscopio Olympus IX81 invertido | Olimpo | http://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf | Sistema de imagen confocal |
| iXon3 897 cámara EMCCD | Andor Tecnología | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897 | Parte del sistema de imagen confocal |
| MetaMorph software V7 | Dispositivos moleculares. LLC | Versión 7 | Estación de trabajo de análisis de imágenes |
| Microsoft Excel | Microsoft Suite | v16.68 | Software de análisis de datos |
| Murashige & Skoog (MS) mediano | Cajón | MSP11-10LT | Medio de crecimiento vegetal |
| Perfluorodecalina (Acros Organic) | Acros Organics | P9900-25G | Medio de imagen |
| Fosfinotricina | Sigma | 77182-82-2 | Antibiótico |
| Cámara de crecimiento vegetal | Conviron | Costumbres | Cámara de crecimiento |
| Unidad confocal de disco giratorio Yokogawa CSU-X1 | Yokogawa | https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/ | Parte del sistema de imagen confocal |
Referencias
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