Estrategia integrada de microplacas y HPTLC para determinar y perfilar fenólicos totales y flavonoles en extractos de piel de cítricos

Resumen

Este estudio presenta un enfoque combinado AlCl₃/Folin–Ciocalteu para el perfilado y cuantificación de HPTLC de flavonols/5-hidroxiflavonas y compuestos fenólicos en cáscaras de cítricos, complementado con análisis de microplacas.

Resumen

Los compuestos fenólicos y los flavonoides contribuyen significativamente a la actividad antioxidante y al valor funcional de los subproductos cítricos. Sin embargo, los ensayos colorimétricos convencionales, aunque ampliamente utilizados, carecen de separación cromatográfica y pueden verse afectados por interferencias químicas. Este protocolo presenta un flujo de trabajo analítico integrado que combina ensayos espectrofotométricos de microplacas con cromatografía de capa delgada de alto rendimiento (HPTLC) para la determinación y perfilado del contenido fenólico total (TPC) y del contenido total de flavonoiles más el contenido de 5-hidroxiflavonas (TFHC) en extractos de cáscara de cítricos. Se evaluaron extractos etanólicos de cáscaras de cal (Citrus aurantifolia) y mandarina (Citrus reticulata) utilizando ensayos de Folin–Ciocalteu (FC) y cloruro de aluminio (AlCl₃) en formato de microplacas de 96 pozos, seguidos de un análisis HPTLC que empleó dos fases móviles secuenciales y derivación doble post-cromatográfica. Las mediciones de microplacas arrojaron valores TPC de 74,2 mmol/g para cal y 72,8 mmol/g para mandarina, mientras que los valores TFHC fueron 15,5 mmol/g y 6,0 mmol/g, respectivamente. La separación de HPTLC resolvió cuatro bandas fenólicas en cal y seis en mandarina. Dos bandas de cal se visualizaron selectivamente tras la derivatización de AlCl₃, consistentes con flavonoiles o 5-hidroxiflavonas. La suma de malos fenólicos estimados por HPTLC fue de 22,0 y 20,8 mmol/g de materia seca para cal y mandarina, respectivamente, mientras que TFHC alcanzó 13,4 mmol/g en cal y no se detectó en mandarina. Estos hallazgos demuestran que los ensayos de microplacas proporcionan una estimación rápida y sensible del contenido total, mientras que el HPTLC mejora la selectividad mediante la separación de compuestos y la derivatización específica de grupos funcionales. La estrategia combinada permite un cribado de alto rendimiento seguido de confirmación cromatográfica, ofreciendo una plataforma práctica y reproducible para la caracterización fitoquímica de matrices vegetales complejas.

Introducción

Las cáscaras de cítricos son un subproducto de la industria del zumo y han demostrado la presencia de compuestos funcionales como los^{antioxidantes 1}. Se han utilizado como alimentos^{neuroprotectores 2}, antiinflamatorios, cosmecéuticos^{antiacné 3} y aditivos^{alimentarios 4}. Varias de estas bioactividades se atribuyen a flavonoides⁵ y a compuestos^{fenólicos 6}. En la literatura 7 se han establecido métodos generales para estimar la cantidad total de flavonoides y fenoles^{, siendo} los más comunes el Folin-Ciocalteu para el contenido fenólico total (TPC⁾⁸, y el cloruro de aluminio para compuestos flavonoides totales (TFC⁾⁹ mediante espectrofotometría. El método de Folin-Ciocalteau se publicó por primera vez en 1927¹⁰, basado en una modificación de la reacción de^{Folin-Denis 11}, ambos basados en una reacción redox de compuestos fosfotongsícolas-fosfohomolibdicos. El método de Folin-Ciocalteau mide la capacidad reductora de los compuestos^{fenólicos 12}. La prueba de cloruro de aluminio y flavonoides se propuso por primera vez en 1960, basada en complejos entre el metal y los ligandos^{flavonoides 13}.

Ambos ensayos espectrofotométricos son herramientas útiles para estimar y comparar el contenido general de fitocompuestos comúnmente encontrados en materiales vegetales. Sin embargo, están sujetas a diversas limitaciones. Por ejemplo, surgen algunas limitaciones por el uso de estándares^{externos 14}, donde generalmente se asume que la naturaleza química del estándar no afecta significativamente a la respuesta de la señal. En la práctica, esta suposición es difícil de validar, ya que la absorción molar depende de factores como la conjugación y otras características estructurales que son difíciles de estandarizar en productos naturales. Por ejemplo, Appel et^{al. 15} evaluaron el TPC de once especies de roble y desarrollaron el llamado enfoque "autoestándar", reportando diferencias superiores al 50% en las pendientes de las curvas de calibración. La utilización autoestándar es una estrategia diseñada para representar la misma mezcla compositiva de compuestos que la presente en la muestra, proporcionando así una coincidencia más cercana al contenido fenolico total (TPC) real de la muestra¹⁶. Los autoestándares también proporcionan información sobre la relación entre grupos reactivos y peso molecular medio; sin embargo, es laborioso y difícil de estandarizar.

El ensayo total de compuestos flavonoides basado en la complexación con cloruro de aluminio ha sido evaluado críticamente en estudios^{recientes 17,18}, que concluyeron que AlCl₃ forma específicamente complejos con dos subgrupos de flavonoides: flavonoides y 5-hidroxiflavonas. Normalmente, los flavonoiles presentan una absorción máxima alrededor de 440 nm, mientras que las 5-hidroxiflavonas se absorben cerca de 415 nm. Además, ciertos flavonoides pueden mostrar una absorbancia intrínseca dentro del rango de 415–440 nm incluso en ausencia de derivatización, y el aumento de absorpción al hacer la complejación varía entre compuestos individuales. Además, ambos ensayos colorimétricos carecen de separación y, por tanto, no pueden distinguir entre diferentes constituyentes fenólicos; Aunque esta característica puede ser ventajosa para estimar el contenido total, resulta en una especificidad limitada. Estas consideraciones ponen de manifiesto la necesidad de una estrategia analítica que resuelva los componentes individuales antes de la detección colorimétrica, distinguiendo así las verdaderas respuestas de ensayo de las interferencias espectrales o químicas.

A pesar de estas limitaciones, estos ensayos siguen siendo herramientas valiosas para el cribado general de compuestos fenólicos bioactivos en extractos de plantas y^{frutas 19}. Para evaluar posibles interferencias, el uso de un método de cromatografía de capa delgada de alto rendimiento (HPTLC), que se ha revelado con los reactivos Folin–Ciocalteu y AlCl₃, representa un enfoque eficaz. La separación cromatográfica permite la detección de sustancias que interfieren con bandas de absorción preexistentes antes de la complejación, mientras que la documentación fotográfica permite el análisis simultáneo de múltiples máximos de absorción. Además, el análisis HPTLC ofrece varias ventajas frente a técnicas cromatográficas más completas como HPLC–MS/MS, incluyendo menor consumo de disolventes, menor tiempo de análisis debido al procesamiento simultáneo de múltiples muestras (hasta 18 por placa⁾²⁰, y una interpretación facilitada de mezclas complejas gracias a la selectividad de la derivatización^{post-cromatográfica 21}.

En este trabajo, presentamos un protocolo integrado para la determinación de los compuestos específicos que comprenden el contenido total de polifenólicos (TPC) y los flavoroles totales más 5-hidroxiflavonas (TFHC) en extractos de cáscara de cítricos mediante separación cromatográfica de capa fina de alto rendimiento (HPTLC), junto con una estimación general del contenido basada en un ensayo colorimétrico de microplacas. La cuantificación cromatográfica planar de compuestos fenólicos se realiza utilizando el reactivo de Folin–Ciocalteu, mientras que la derivatización por cloruro de aluminio se aplica exclusivamente para la identificación cromatográfica de bandas correspondientes a flavonoiles y 5-hidroxiflabonas. En este enfoque, la determinación de TFHC se basa en la respuesta de Folin–Ciocalteu de compuestos cromatográficamente resueltos e identificados químicamente, en lugar de la complexación de cloruro de aluminio para cuantificación. El análisis HPTLC permite la separación y visualización específica de los compuestos, permitiendo la identificación de constituyentes fenólicos individuales y la detección de posibles interferencias espectrales. Además, se presenta un método espectrofotométrico basado en microplacas para la estimación rápida del total de TPC y TFHC, proporcionando una herramienta complementaria de cribado de alto rendimiento para matrices vegetales complejas.

Protocolo

1. Preparación de las cáscaras de fruta

1. Retira aproximadamente 50 g de cáscaras de cada fruta, separándolas de la parte comestible. Para nuestros resultados representativos, se compraron mandarinas en una tienda local (importadas de Chile, variedad isabelina), y se recogieron tilos de un árbol cerca de San José, Costa Rica (ejemplar de prueba JVR-16434).
2. Coloca las cáscaras en una bolsa plástica zip-lock y congélalas a -20 °C durante al menos 2 horas.
3. Transfiere las cáscaras congeladas a un liofilizador preenfriado, mantenga las bolsas abiertas y aplique vacío (0,1 mbar) durante la noche hasta que esté completamente seca.
4. Muele cada material seco a aproximadamente 0,1 mm usando un molino de cuchillas.

2. Extracción

1. Pesa aproximadamente 100 mg de cáscara seca y molida de cítricos (lima o mandarina) y colócala en un tubo de vidrio de 15 mL.
2. Añade 3 mL de etanol al 60% al tubo.
3. Sonica la mezcla en un baño ultrasónico durante 10 minutos a 40 °C para alterar las células vegetales y facilitar la liberación de fitoquímicos.
4. Centrifuga la muestra a 850 × g durante 10 minutos.
5. Transfiere cuidadosamente el sobrenadante etanólico a un matraz volumétrico de 10 mL usando una pipeta Pasteur, evitando la perturbación del sedimento.
6. Añade 3 mL adicionales de etanol al 60% al tubo que contiene el residuo sólido húmedo.
7. Repite los pasos de sonicación y centrifugación descritos anteriormente en los pasos 2.3 y 2.4.
8. Transfiere el sobrenadante al mismo matraz volumétrico y combínalo con el extracto anterior.
9. Realiza una tercera extracción repitiendo los pasos anteriores (2.6–2.8).
10. Acidular el extracto combinado (≈9 mL) con dos gotas de 0,1 mol/L de HCl (para aumentar la estabilidad de antocianinas y otros compuestos fenólicos) y aumentar el volumen a 10 mL con metanol.
11. Realiza este procedimiento en triplicado para cada muestra.

3. Contenido total de flavoroles y 5-hidroxiflavonas (TFHC) mediante espectrofotometría de microplacas

1. Prepara una solución de quercetina (100 μg/mL) o un estándar flavonoide equivalente.
   1. Pesa 10 mg de quercetina usando una balanza con precisión de 0,1 mg.
   2. Disuelva la quercetina en aproximadamente 5 mL de etanol al 95% y transfiere la solución a un matraz volumétrico de 10 mL etiquetado como solución estándar.
   3. Enjuaga el vaso dos veces con 2 mL de etanol al 95% y añade los enjuagues al matraz.
   4. Reduce el volumen con un 60% de etanol.
   5. Preparar soluciones estándar (10–100 μg/mL) y un blank en tubos microcentrífugas de 1,5 mL según la Tabla 1.
   6. Asegúrese de que todas las muestras y estándares estén dentro de un rango de absorbancia de 0,2–0,8, ajustando las concentraciones si es necesario.
   7. Prepara el diseño de la microplaca dispensando 60 μL de blank, muestra o estándar en cada pozo según la Figura 1. Realiza tres réplicas por muestra o estándar.
   8. Dispensar soluciones acuosas de cloruro de aluminio al 2%, acetato de sodio al 5% y metanol al 80% en depósitos de reactivos separados.
      NOTA: Manipula con cuidado las soluciones de cloruro de aluminio y metanolas. Las soluciones de cloruro de aluminio son irritantes, y el metanol es tóxico por ingestión, inhalación y absorción de la piel. Evita el contacto visual y de piel y usa el EPP adecuado
   9. Utilizando una pipeta multicanal de 8 canales, añade 10 μL de solución de AlCl₃, 10 μL de solución de acetato de sodio y 200 μL de metanol al 80% en cada pozo.
   10. Sacude el plato a intensidad intermedia durante 10 segundos y déjalo incubar en la oscuridad durante 30 minutos.
   11. Mide la absorbancia a 415 nm. Si no se puede agitar, mezclar manualmente con una micropipeta antes de incubar (Figura 2).
   12. Interpóla los valores de absorbancia de la muestra desde la curva de calibración y aplica factores de dilución, volumen y corrección de masa según sea necesario.

Tabla 1: Cantidades de estándares de quercetina para la curva de calibración de flavonoles totales y contenido de 5-hidroxiflavonas (TFHC). Por favor, haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 1: Disposición de microplacas para el análisis de microplacas con flavonoiles totales y contenido de 5-hidroxiflavonas (TFHC). (A) Esquema de microplacas. (B) Programa de diseño de software Gen5. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Configuración del software de microplacas para análisis de contenido de flavonoiles totales y 5-hidroxiflavonas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Contenido total de polifenolos (TPC) por espectrofotometría de microplacas

1. Preparar una curva estándar de ácido gálico (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Pesa aproximadamente 0,0123 g de ácido gálico (pureza del 98%) usando una balanza analítica y disuelve en agua destilada.
   2. Transfiere la solución a un matraz volumétrico de 10 mL, enjuaga dos veces y llena hasta la marca con agua destilada para obtener la solución de fondo.
   3. Prepara una solución de trabajo diluyendo 1 mL de la solución de base a 10 mL con agua destilada.
   4. Preparar los estándares de calibración diluyendo aún más la solución de trabajo según la Tabla 2.
   5. Ajusta las concentraciones si los valores de absorbancia están fuera del rango de 0,2–0,8.
   6. Prepara el reactivo de trabajo Folin–Ciocalteu diluyendo el reactivo comercial 1:14 con agua destilada.
      NOTA: Las soluciones del reactivo Folin–Ciocalteu y de ácido clorhídrico son corrosivas. Evita salpicaduras y contacto directo. Realiza la manipulación de reactivos en una campana extractora.
   7. Pipete 30 μL de cada muestra, estándar o blank en una microplaca de 96 pozos siguiendo el diseño de la Figura 3A, usando tres réplicas por muestra.
   8. Añade 215 μL de reactivo de trabajo Folin–Ciocalteu a cada pozo utilizando una pipeta multicanal.
   9. Añade 50 μL de solución de carbonato de sodio al 20% en cada pozo y mezcla bien con una micropipeta.
   10. Incubar la placa durante 20 minutos a 40 °C con agitación (Figura 3B).
   11. Mide la absorbancia a 755 nm.

Tabla 2: Cantidades de estándares de ácido gálico para la curva de calibración del contenido fenólico total (TPC). Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Figura 3: Disposición de microplacas y configuración de software para el análisis de microplacas con contenido fenólico total (TPC). (A) Diseño. (B) Programa de software. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Condiciones generales utilizadas para el análisis cromatógráfico de capa fina de alto rendimiento

1. Curvas estándar
   1. Preparar soluciones de quercetina y ácido gálico (100 μg/mL cada una) como se ha descrito anteriormente en las secciones 3 y 4.
   2. Aplicar ácido gálico a seis líneas a volúmenes de 2, 4, 6, 8, 10 y 12 μL.
   3. Aplicar 5 μL de ácido gálico y quercetina individualmente en carriles separados para su identificación.
2. Disposición de la placa:
   1. Utiliza una placa TLC de 10 × 20 cm con respaldo de aluminio y gel de sílice de 60 °F₅₄ como fase estacionaria.
   2. Establece los parámetros de aplicación de la siguiente manera: posición Y 7,0 mm, longitud de banda 6,0 mm, primera posición X 14,0 mm, distancia entre vías 9,4 mm.
   3. Aplica 10 μL de cada extracto por banda utilizando nitrógeno como gas de pulverización.
   4. Ajusta la distancia del disolvente en 70 mm.
3. Desarrollo de placas:
   1. Desarrollar placas en una cámara manual que contenga 40 mL de fase móvil, y permitir 10 minutos para la saturación de la cámara usando papel de filtro en contacto con la fase móvil y la pared de la cámara para ayudar a que los vapores de la fase móvil saturen la atmósfera de la cámara.
   2. Revelar placas usando MP1 o MP2, realizando doble revelado cuando sea necesario. Fase móvil 1 (MP1), que está compuesta de acetato de etilo:ácido fórmico:ácido acético:agua (100:11:11:26); y MP2 hecho de tolueno:acetato de etilo: ácido fórmico (5:4:1).
      NOTA: Revela placas HPTLC en una campana extractora. Los componentes de la fase móvil (acetato de etilo, tolueno, ácido fórmico y ácido acético) son volátiles, y el tolueno y el acetato de etilo son altamente inflamables. Evita inhalar vapor y elimina las fuentes de ignición.
   3. Deja que los platos se sequen a temperatura ambiente.
4. Derivatización
   1. Las placas de pulverización con reactivo Folin–Ciocalteu (300 μL de reactivo + 600 μL de etanol al 50%), se secan brevemente con una pistola de calor y se rocían con 1 mL de carbonato de sodio al 10% en etanol al 50%.
   2. Por separado, rocía otras placas con cloruro de aluminio al 1% en etanol al 50%.
5. Placas de calor uniformemente con una pistola de calor hasta que el desarrollo del color se estabilice y las placas estén completamente secas.

6. Desarrollo para el análisis del contenido total de flavonoiles y 5-hidroxiflavonas (TFHC) y del contenido fenólico total (TPC) mediante cromatografía de capa delgada de alto rendimiento

1. Aplicar muestras en líneas triplicadas junto con líneas de referencia de ácido gálico y quercetina (para identificación, como se describe en el paso 5.1.4).
2. Desarrolla una placa usando MP1.
3. Revela la placa de nuevo usando MP2.
4. Deriva la placa usando reactivo FC como se describió antes.
5. Documenta fotográficamente la placa usando iluminación blanca, así como iluminación ultravioleta de 254 nm y 366 nm.
6. Repita el procedimiento, reemplazando el paso final para la derivatización de AlCl₃ , como se muestra en la Figura 4.

Figura 4: Pasos de VisionCats para el análisis de TPC y TFHC por HPTLC. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

Condiciones de extracción
El protocolo general de extracción descrito aquí emplea un 60% de etanol, como se había reportado^{anteriormente con un 22}%. Cuando se extrapola a otras fuentes vegetales, las condiciones de extracción pueden optimizarse en términos de polaridad del disolvente y número de ciclos. En otro lugar se ha detallado una justificación exhaustiva para seleccionar tanto el disolvente como el número de ciclos^. La selección del disolvente puede estar guiada por la literatura previa y los índices de polaridad; En general, se recomiendan mezclas hidroalcohólicas de etanol o metanol, así como acetona. El número óptimo de ciclos de extracción (n) puede evaluarse dividiendo un volumen total fijo de 10 mL en 1–5 ciclos de 10/n mL, seguido de agrupar los extractos líquidos. La eficiencia de los diferentes números de ciclos de extracción se compara estadísticamente para identificar la condición que produce la máxima absorbancia en el ensayo TPC.

Cuantificación de microplacas y HPTLC
Las curvas de calibración estándar tanto para el ensayo de microplacas como para el análisis HPTLC se presentan en la Figura 5. Para la determinación del contenido fenólico total (TPC) mediante el método de microplacas de Folin–Ciocalteu y para placas HPTLC derivadas con el mismo reactivo, se establecieron curvas de calibración utilizando ácido gálico como compuesto de referencia. El ácido galo se seleccionó no solo porque es uno de los estándares más utilizados para la cuantificación de TPC, sino también porque puede eluirse bajo las mismas condiciones de fase móvil aplicadas a las muestras de cal y mandarina. La quercetina también fue evaluada como un posible estándar para el ensayo HPTLC; sin embargo, resultó inadecuado para este sistema cromatográfico, ya que coeluía con el frente disolvente y no podía cuantificarse de forma fiable. No obstante, el TFHC se determinó usando quercetina como estándar de referencia, ya que el ácido gálico no forma un complejo coloreado con cloruro de aluminio, dado que no es ni un flavonol ni una 5-hidroxiflavona.

Figura 5: Placa HPTLC de cal, mandarina, ácido gálico y quercetina desarrollada secuencialmente con MP1 seguida de MP2, y derivada por separado con reactivos de cloruro de aluminio (AlCl₃) y Folin–Ciocalteu (FC). Se muestra el perfil cromatográfico tras la derivatización de AlCl₃. Abreviaturas: FC, derivación de Folin–Ciocaltéu; AlCl₃, derivatización por cloruro de aluminio; W, iluminación de luz blanca; 366, iluminación UV a 366 nm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Los resultados para el contenido fenólico total (TPC) y el contenido total de flavonoides y ácidos hidroxicinnámicos (TFHC) se presentan en la Tabla 3. Como era de esperar, los valores de TFHC fueron significativamente inferiores a los valores de TPC, siendo aproximadamente cinco veces menores en muestras de cal y doce veces menores en muestras de mandarina.

Tabla 3: Resultados para el contenido fenólico total de mandarina y cal mediante el método de microplacas. Abreviaturas: Abs: absorbancia, CV: coeficiente de variación, DF: factor de dilución, GAE: equivalentes de ácido gálico, IR: réplica independiente, QE: equivalentes de quercetina, Rep: repetición, SD: desviación estándar, TFHC: flavonoiles totales y compuestos de 5-hidroxiflabona, TPC: contenido fenólico total y media . *Calculado en base a materia seca. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

De manera similar, los resultados obtenidos del análisis HPTLC se resumen en la Tabla 4. La separación cromatográfica permite visualizar bandas individuales correspondientes a compuestos distintos. Se detectaron cuatro constituyentes fenólicos en muestras de cal y seis en muestras de mandarina. Ninguna de estas bandas cumplía con los factores de retención de los estándares de referencia empleados (ácido gálico y quercetina), lo cual es coherente con las expectativas.

Tabla 4: Resultados para el contenido fenólico total y las bandas correspondientes a AlCl₃ revelaron compuestos derivados por HPTLC con AlCl₃. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

La Tabla 4 también informa del contenido fenólico total estimado a partir del análisis HPTLC, calculado como la suma de los compuestos individuales detectados cromatográficamente (análogo a TPC). Además, la tabla incluye el contenido acumulado de las bandas asignadas a flavonoiles o 5-hidroxiflavans (Rf = 0,46 y 0,62 en cal; ninguna detectada en mandarina). Estas bandas aparecieron amarillas tras la derivatización con AlCl₃ y mostraron fluorescencia amarillenta bajo iluminación ultravioleta de 366 nm. Sin embargo, no se observó coloración visible antes de la derivatización, como se muestra en la Figura 5.

Para el análisis HPTLC, la derivatización de Folin-Ciocalteu (FC) proporciona una detección completa de compuestos fenólicos, aunque pueden producirse interferencias menores. Además, la derivatización por cloruro de aluminio (AlCl₃) tiñe selectivamente un subconjunto de flavonoides. La aplicación combinada de ambos reactivos mejora la estandarización de los métodos y mitiga algunas de las limitaciones inherentes a cualquiera de los enfoques. Cabe destacar que es improbable que un compuesto no flavonoide exhiba tanto la característica coloración azul bajo FC como la absorbancia amarillo-roja bajo AlCl₃. Además, los cromóforos preexistentes pueden excluirse como interferencias si son visibles con la misma intensidad antes de la derivatización.

Como se muestra en la Figura 5, el extracto de cal mostró dos bandas en Rf 0,62 y 0,46, que no eran detectables en la placa no revelada pero se hicieron claramente visibles tras la derivatización tanto de Folin–Ciocalteu (FC) como de AlCl₃. Este comportamiento respalda su naturaleza flavonoide, posiblemente correspondiente a neoeriocitrino y^{hesperidina 23}. Se observaron constituyentes fenólicos adicionales en Rf 0,21 y 0,37 en la cal, y en Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 y 0,89 en mandarín. Estas bandas fueron detectables tras la derivatización de FC pero no tras el tratamiento con AlCl₃, lo que sugiere que podrían corresponder a compuestos fenólicos no flavonoides. Según la literatura, los principales fenólicos no flavonoides reportados en mandarín incluyen el ácido clorogénico y el ácido transferúlico^24,25. En la cal, otros compuestos previamente descritos incluyen el ácido cumárico y el ácido dihidroxiferúlico²³. No obstante, la confirmación de estas asignaciones requiere análisis con estándares de referencia adicionales.

Comparación de fases móviles HPTLC
Ambas fases móviles se desarrollaron como una modificación de los sistemas^{previamente reportados 26, 27, 28}. La fase más polar móvil (MP1, Figura 6A) proporcionó una separación superior de los constituyentes fenólicos en comparación con MP2. En cambio, la fase móvil menos polar (MP2) (Figura 6B) permitió la retención simultánea tanto de los componentes de la muestra como de los estándares de referencia dentro de la misma secuencia cromatográfica. Sin embargo, bajo condiciones de MP2, los valores de Rf de los constituyentes de la muestra eran relativamente bajos, con algunos compuestos permaneciendo cerca del origen, como se muestra en la Figura 6. Para abordar esta limitación, se implementó un procedimiento de doble revelado usando MP1 seguido de MP2. Esta estrategia aseguró una mejor migración y resolución de los componentes de la muestra, permitiendo la cuantificación contra los estándares de ácido gálico en la misma placa bajo condiciones cromatográficas idénticas. La quercetina presentaba una tenue coloración amarilla antes del tratamiento con AlCl₃, que se intensificó tras la derivatización. Para los extractos de cal y mandarina, se observaron dos bandas distintas además de una banda que permanece en el origen. Además, una banda amarilla con un valor Rf de 0,14 se hizo claramente visible tras la derivatización de AlCl₃.

Figura 6: Placas HPTLC de cal, mandarina, ácido gálico y quercetina desarrolladas con la fase móvil 1 (A) y la fase móvil 2 (B). Para cada placa, las pistas de izquierda a derecha corresponden a: muestras desarrolladas (no derivadas), derivadas de Folin–Ciocalteu y derivadas de AlCl₃. La visualización se realizó bajo iluminación de luz blanca. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

La recogida y almacenamiento de muestras son pasos críticos para garantizar la integridad de los análisis fitoquímicos. Tras la recogida, las muestras deben transportarse en condiciones de refrigeración y liofilizarse lo antes posible para minimizar la degradación. Aunque los materiales biológicos secos suelen ser estables, los extractos en solución son considerablemente más hábiles, incluso cuando se almacenan en refrigeración. Por lo tanto, las determinaciones analíticas se realizan preferiblemente sobre extractos recién preparados. El almacenamiento prolongado, incluso durante unos días bajo condiciones de frío y protección de la luz, o durante unas horas a temperatura ambiente, puede provocar cambios observables en los perfiles cromatográficos, incluyendo alteraciones en la intensidad de la banda y la formación de precipitados. Estos cambios suelen asociarse a transformaciones químicas como la oxidación, la hidrólisis o las reacciones de complejación. Por lo tanto, todos los reactivos y extractos deben almacenarse y manipularse en condiciones de frío y oscuridad para preservar su estabilidad química.

Al comparar ambas técnicas (Tabla 3 y Tabla 4), se evidencian diferencias cuantitativas sistemáticas. Tanto en cal como en mandarín, los valores de TPC obtenidos mediante el ensayo de microplacas fueron aproximadamente tres veces superiores a los estimados por el HPTLC. En cal, el TPC fue de 74,2 mmol/g por microplaca frente a 22,0 mmol/g DM por HPTLC, mientras que los valores de TFHC fueron 15,5 mmol/g y 13,4 mmol/g, respectivamente. En mandarina, el TPC alcanzó 72,8 mmol/g por microplaca, frente a 20,8 mmol/g por HPTLC. Para TFHC, el método de microplacas dio 6,0 mmol/g, mientras que no se detectaron bandas correspondientes por HPTLC.

Estas discrepancias pueden explicarse por las limitaciones intrínsecas y los mecanismos de respuesta de cada método. Se sabe que el ensayo Folin–Ciocalteu (FC) reacciona no solo con compuestos fenólicos, sino también con diversas sustancias reductoras no fenólicas, incluyendo ácido ascórbico, tirosina, ácido fórmico y ácido^{acético 29}, así como otros reductores de bajo peso molecular. Estos compuestos contribuyen a la señal espectrofotométrica global, lo que podría llevar a una sobreestimación de la TPC. Además, los constituyentes fenólicos menores pueden aumentar colectivamente la absorción total en el ensayo de microplacas, incluso si sus concentraciones individuales son demasiado bajas para producir bandas distintas y cuantificables en HPTLC. Algunos metabolitos pequeños o altamente polares también pueden no ser retenidos, resueltos o visualizados bajo las condiciones cromatográficas empleadas.

Figura 7: Representación esquemática de complejos AlCl₃ formados con flavoroles y 5-hidroxiflavonas. (A) Flavonoles y (B) 5-hidroxiflavonas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Las diferencias metodológicas en la química de detección contribuyen además a las variaciones observadas. La reacción de FC produce un aumento sustancial en la absorbancia debido a la reducción del reactivo, lo que resulta en una alta sensibilidad analítica. En cambio, el método AlCl₃ es relativamente inespecífico y se basa en la formación de complejos con ciertos flavonoides. Los flavonoiles suelen mostrar una absorción máxima alrededor de 410 nm, mientras que la 5-hidroxiflavolona absorbe cerca de 440^{nm 18}, y sus complejos con Al³⁺ se ilustran en la Figura 7. Sin embargo, el aumento de la absorbancia tras la complejación es relativamente modesto, lo que hace que el ensayo AlCl₃ sea más susceptible a interferencias de componentes de la matriz coloreada, incluidos los propios flavonoides.

A pesar de estas limitaciones, el uso combinado de la derivatización de FC y AlCl₃ en HPTLC representa una poderosa estrategia complementaria para el análisis fenólico. Este enfoque combina la alta sensibilidad de la reacción de FC con la discriminación estructural proporcionada por la complexación AlCl₃ y la separación cromatográfica. Además, se sabe que varios flavonoiles presentan bandas características amarillentas bajo iluminación UV³⁰, lo que apoya aún más la clasificación y confirmación de los compuestos.

Los métodos de microplacas son especialmente ventajosos para el cribado de alto rendimiento (CPC). Requieren una preparación mínima de la muestra, un bajo consumo de reactivos y permiten el análisis simultáneo de decenas de muestras. En condiciones típicas de laboratorio, se puede realizar un ensayo completo de microplacas en aproximadamente 4 horas utilizando instrumentación ampliamente disponible. Estas características hacen que los ensayos de microplacas sean muy adecuados para estudios comparativos rápidos, control de calidad rutinario y la evaluación preliminar de grandes conjuntos de muestras. En cambio, el HPTLC requiere más tiempo y trabajo, con un flujo de trabajo analítico completo que normalmente requiere entre 7 y 8 horas. También depende de instrumentación especializada que puede no estar disponible en todos los laboratorios, y el uso de placas dedicadas y reactivos de derivatización aumenta el coste por análisis. Otra limitación es que los metabolitos presentes en concentraciones muy bajas pueden permanecer indetectables bajo condiciones estándar de visualización. Sin embargo, estas limitaciones prácticas y relacionadas con la sensibilidad se ven compensadas por la principal ventaja de la separación^{cromatográfica 30,31}. El HPTLC permite la resolución de componentes individuales en matrices vegetales complejas, la confirmación de respuestas genuinas al ensayo y la detección de posibles compuestos interferentes. Además, la derivatización post-cromatográfica selectiva permite una clasificación sencilla de los compuestos en grupos funcionales (por ejemplo, flavonoiles y 5-hidroxiflavonas), mejorando la interpretación química más allá de la estimación total del contenido.

Por ello, en estudios a gran escala, el flujo de trabajo analítico puede comenzar con ensayos de microplacas para identificar rápidamente muestras con niveles elevados de compuestos objetivo. Las muestras seleccionadas pueden ser sometidas a análisis HPTLC para visualizar los componentes individuales, evaluar la selectividad y evaluar posibles interferencias mediante derivación dual. Esta estrategia integrada (ilustrada en la Figura 8) combina velocidad y rendimiento con especificidad química y conocimiento estructural.

Figura 8: Flujo de trabajo propuesto para el cribado y análisis de muestras. (A) Cribado de microplacas de alto rendimiento de un gran lote de muestras. (B) Análisis HPTLC de muestras seleccionadas para cuantificación utilizando el método de Folin–Ciocalteu y para la identificación de flavonoiles y 5-hidroxiflavonas mediante derivatización de AlCl₃. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

En comparación con la HPTLC, la HPLC acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (HPLC–HRMS) —la alternativa más común reportada en la literatura— ofrece una sensibilidad inigualable y una identificación estructural inequívoca de compuestos^{individuales 32}. No obstante, los análisis HPLC–HRMS son inherentemente más lentos, ya que cada prueba cromatográfica debe realizarse secuencialmente y conllevan costes sustancialmente mayores asociados con la instrumentación, los requisitos de pureza del disolvente y el consumo de disolventes. Además, el cribado de clase funcional a menudo requiere un procesamiento complejo de datos e interpretación específica de compuestos, mientras que HPTLC permite agrupar visualmente directamente los compuestos tras la derivatización. En consecuencia, el HPTLC representa una plataforma intermedia eficaz entre el cribado rápido de microplacas y el análisis exhaustivo de HPLC–MS, equilibrando el rendimiento, el coste y la selectividad química.

El análisis flavonoide y fenólico tiene aplicaciones de amplio alcance en la ciencia de los alimentos, nutracéuticos, farmacéuticos, agricultura e investigación de materiales. En ciencia alimentaria, se utiliza para evaluar la capacidad antioxidante, la autenticidad, la vida útil y el control de calidad de productos como zumos, vinos y tés, así como para apoyar estudios agronómicos, incluyendo la determinación del tiempo óptimo de cosecha basado en la madurez^{fenólica 33}. En el sector nutracéutico, el perfilado fenólico es esencial para la estandarización y el control de calidad de extractos botánicos y productos comerciales como cápsulas de extracto de té verde, suplementos de extracto de semilla de uva, tabletas de quercetina y formulaciones de bioflavonoides cítricos. En la investigación farmacéutica y biomédica, estos análisis apoyan el cribado de compuestos bioactivos con potencial antioxidante, antiinflamatorio y^{antimicrobiano 6}. En agricultura y fisiología vegetal, la determinación fenólica ayuda a evaluar las respuestas al estrés de las plantas y a guiar estrategias de mejora de cultivos. Además, en ciencia de materiales —particularmente en estudios de inhibidores de corrosión derivados de plantas^34,35— la caracterización fenólica ayuda a correlacionar la composición química con el comportamiento de adsorción y la eficiencia protectora.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubos Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf
Frascos volumétricos de 10 mL	Eisco Labs	CH0451B	Tapón de polipropileno 10/19, vidrio borosilicato, ámbar - Marca de graduación blanca, tolerancia y plusmn; 0,025 ml
100 & micro; L y 1000 & micro; Puntas de micropipeta L	genérico
100– 1000 y micro; Micropipeta L	Eppendorf	Research Plus
10– 100 & micro; Micropipeta L	Eppendorf	Research Plus
Tubos de vidrio tapados de 15 mL	genérico
Vasos de precipitados de 50 mL	genérico
Micropippette multicanal de 8 canales	TermoCientífico
Microplacas de 96 pozos	Greiner	655891	Policicloolefina, fondo de cristal, negro
Balance analítico y nbsp;			± 0,0001 g
Sampler TLC automático	CAMAG	ATS4
Centrifugadora	TermoCientífico	Sorvall ST8R	≥ 850 y horas; g
Papel de filtro	Whatman		Para la saturación de la cámara
Liofilizador	LABCONCO	Modelo 10
Reservorios de reactivos plásticos	Eppendorf
Espátula con extremo plano y extremo de cuchara	Productos químicos Merck	HS15906
Lector de Microplacas de Detección Multi-Detección Synergy HT	BioTek Instruments	Synergy HT
Placas TLC con respaldo de aluminio 60 F254 (10 y multiplicadas por 20 cm)	Merck
Pulverizador TLC	Sigma-Aldrich		20 mL
TLC Visualizer	CAMAG	2
Baño/limpiador ultrasónico	Creworks	ZX-040	con control de temperatura a 40 °F; C
Cordero UV	UPV	UVGL-58
Software VisionCATS	CAMAG
Bolsas zip-lock	Genérico		1/4 de cuarto de galón