Perfilado fenotípico de fenotipos conductuales tipo parkinsoniano inducidos por MPTP en larvas de pez cebra basado en un experimento conductual

Resumen

Este protocolo establece un paradigma de fenotipado conductual en larvas de pez cebra tratadas con MPTP para evaluar déficits motores y no motores similares a la enfermedad de Parkinson.

Resumen

Este artículo presenta un protocolo único y multiparamétrico de fenotipado conductual para la enfermedad de Parkinson (EP) inducida por MPTP en larvas de pez cebra. La inducción química de patologías similares a la PD en el pez cebra proporciona un sistema de alto rendimiento y genéticamente manejable, aunque la mayoría de los estudios se han centrado estrechamente en ensayos locomotores básicos o transiciones simples luz-oscuridad. Estos enfoques limitados no logran abarcar el espectro más amplio de disfunciones relacionadas con la MP, que van desde bradicinesia y déficits sensorimotores hasta comportamientos similares a la ansiedad y alteraciones del sueño. Para cubrir esta carencia, este estudio desarrolló una batería integrada de 6 ensayos complementarios: ensayo locomotor para evaluar la conducción locomotora general y exploratoria; evaluación de tigmotaxis para detectar comportamientos de preferencia de borde relacionados con la ansiedad; prueba de respuesta al sobresalto para registrar bradicinesia y reactividad motora alterada; ensayos de desafío luz-oscuridad para evaluar la toma de riesgos y la respuesta al estrés; paradigmas de respuesta fotomotora (incluida la estimulación con luz estroboscópica) para cuantificar el movimiento sensorimotor y reflejo; y monitorización de la regulación sueño-vigilia para medir el comportamiento de sueño-vigilia. Las larvas de pez cebra están expuestas a concentraciones subletales de MPTP desde 1 día después de la fertilización (dpf) hasta 5 dpf, con evaluaciones de comportamiento iniciadas entre 4 y 6 dpf. El seguimiento automatizado de alta resolución genera varios puntos finales de comportamiento por ensayo. Este enfoque revela alteraciones similares a las EP no detectadas hasta entonces, como una arquitectura desordenada del sueño, aprendizaje de habituación alterado, movimiento sensorimotor y reflejo, reflejando síntomas no motores tempranos. Al combinar estos ensayos, los investigadores obtienen un síntoma conductual integral que refleja más de cerca la complejidad de la EP humana. Este protocolo amplía el paradigma para estudiar la patogénesis de la EP, seleccionar terapias candidatas y explorar moduladores ambientales. Ejemplifica el objetivo de la colección de presentar modelos animales innovadores que mejoren la relevancia traslacional mediante un fenotipado robusto y multifacético.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más prevalente después de la enfermedad^{de Alzheimer 1}. Su prevalencia y el número de personas afectadas han ido aumentando de forma constante en los últimos años, lo que supone un importante desafío de salud pública^{a nivel mundial 2}. La tasa de incidencia de la EP aumenta notablemente a los ^3,4 años. Clínicamente, la EP se manifiesta tanto por síntomas motores —como discinesia, bradicinesia, temblor en reposo e inestabilidad postural— como por una variedad de síntomas no motores, incluyendo deterioro cognitivo, ansiedad y alteraciones del^{sueño 5}. Actualmente, el diagnóstico de EP depende principalmente de la presencia de síntomas motores⁶; Sin embargo, para cuando estos síntomas se hacen evidentes, más del 60% de las neuronas de dopamina en la sustancia negra ya se han perdido⁷. Aunque los síntomas no motores suelen aparecer antes, la ausencia de criterios de evaluación específicos y objetivos complica el diagnóstico y la intervención^precoz. Actualmente, el tratamiento principal para la MP implica la administración de levodopa⁹, que se convierte en dopamina en el cerebro, reponiendo así los niveles de dopamina en el estriado. Aunque este tratamiento puede aliviar los síntomas temporalmente, no detiene la progresión de la^{enfermedad 10}. Por ello, es esencial investigar más sobre la patogénesis de la MP y el cribado de drogas.

Construir modelos animales adecuados es crucial para la investigación sobre la patogénesis de la EP y el cribado de fármacos anti-EP. Ahora bien, existen tres modelos principales para los estudios de EP: modelo¹¹ de inducción química, modelo¹² de edición genética y modelo¹³ de xenotrasplante humano. Los animales modelo más utilizados incluyen roedores, como^{ratones 14}, y primates no humanos como^{monos 15}. Recientemente, el pez cebra (Danio rerio) ha ganado cada vez más atención en los estudios sobre DP por sus ventajas como su pequeño tamaño, crecimiento rápido, alta homología genética con humanos y embriones^{transparentes 16}. El uso de neurotoxina MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) para inducir daño a las neuronas^{dopaminérgicas 17,18}, es un método clásico para construir un modelo de DP. El pez cebra expuesto a concentraciones subletales de MPTP exhibe varios fenotipos conductuales similares a la^{PD 19}.

Sin embargo, la mayoría de los estudios actuales sobre la PD en peces cebra se centran principalmente en comportamientos locomotores básicos o transiciones simples de luz a^{oscuridad 16,20}, y los ensayos conductuales unidimensionales son difíciles de reflejar plenamente las complejas características conductuales de la EP, especialmente los cambios conductuales en la función no motora. Teniendo en cuenta que la MP es una enfermedad que involucra múltiples sistemas neuroconductuales más allá del control motor 21,22,23, se necesita urgentemente un método multiparamétrico de evaluación de fenotipos conductuales para capturar sus fenotipos ^{multisistémicos 24}.

En consecuencia, este estudio desarrolla un protocolo de ensayo de fenotipado conductual multimétrico y rápido para describir de forma más completa los fenotipos conductuales similares a la DP en larvas de pez cebra tratadas con MPTP. Se aplicó una dosis subletal de MPTP (50 μM)²⁵ a las larvas de 1 a 5 días después de la fertilización (dpf)16,20,26. De 4 a 6 dpf^{16, 20, 24}, realizamos 6 pruebas de comportamiento: monitorización de regulación sueño-vigilia, paradigmas de respuesta fotomotora, evaluación de timotaxis, evaluación locomotora, prueba de respuesta al sobresalto y ensayos de desafío luz-oscuridad. Estas evaluaciones conductuales abarcan tanto aspectos motores como no motores, como déficits de movimiento, sensoriomotor, aprendizaje por habituación, toma de riesgos, respuesta al estrés y ritmo sueño-vigilia.

Utilizando el sistema de seguimiento de vídeo de alto rendimiento Zebrabox y el método de análisis cuantitativo, extrajimos y cuantificamos varios parámetros conductuales y comparamos estadísticamente las diferencias conductuales entre el grupo tratado con MPTP y el grupo de tipo salvaje (WT). En comparación con los ensayos existentes de PD de pez cebra, esta batería de comportamiento multiparamétrica captura fenotipos motores y no motores dentro de un marco estandarizado. El sistema automatizado de seguimiento garantiza la adquisición objetiva de datos conductuales y una alta reproducibilidad. Además, el pequeño tamaño corporal de las larvas permite colocar a los animales individuales en placas de varios pozos, lo que permite una evaluación de alto rendimiento. Las ventajas anteriores son beneficiosas para analizar en profundidad el mecanismo patológico de la MP, analizar los fármacos o compuestos candidatos y explorar la influencia de factores ambientales en la aparición o desarrollo de la MP.

Protocolo

Este estudio sobre peces cebra se realizó en cumplimiento de las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales, y fue aprobado por el Comité Ético de la Escuela de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Shandong (Nº YXDW2025-0056). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación para el MPTP

1. Preparar 1× medio E3 diluyendo 100× solución original de E3 1:100 con agua ultrapura (por ejemplo, mezcla 5 mL de 100× E3 con 495 mL de agua ultrapura para obtener 500 mL de medio 1× E3).
   NOTA: Prepara el E3 medio fresco el día de su uso.
2. Prepara una solución de MPTP de 1 mM añadiendo 5,0 mg de polvo MPTP a un tubo de centrífuga de 50 mL y añadiendo medio E3 a un volumen final de 25 mL (utiliza el tubo de la centrífuga como recipiente de mezcla, pero no se requiere centrifugación). Etiqueta la solución como solución MPTP de 1 mM. Guarda la solución de stock en la oscuridad.
3. Preparación de la solución MPTP de 50 μM: transferir 2,5 mL de la solución stock de MPTP de 1 mM a un recipiente limpio y diluir con 47,5 mL de medio E3 para obtener un volumen final de 50 mL a una concentración final de 50 μM MPTP. La parte restante de la solución original siguió almacenándose en la oscuridad.
   PRECAUCIÓN: El MPTP es una neurotoxina potente y debe manejarse con extrema precaución. Siempre llevar el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluidos guantes, bata de laboratorio y gafas de protección. Eliminación de residuos MPTP según las directrices institucionales de bioseguridad.

2. Preparación y agrupación de embriones de pez cebra

1. Selecciona peces cebra adultos machos y hembras sexualmente maduros y realiza crías controladas utilizando acuarios de cría con divisores removibles. A las 20:00, coloca a los peces cebra macho y hembra por separado en los acuarios de cría en una proporción de 2:3, y sepáralos con divisores.
2. Al día siguiente, retira los separadores a las 8:00 de la mañana para permitir el apareamiento, iniciando así la puesta en desove. Recoge embriones después de 1 hora y lávalos tres veces con agua limpia del sistema.
3. Alojan embriones en placas de Petri de 100 mm con medio fresco de E3, y los incuban a 28 °C bajo un ciclo de 14 horas de luz / 10 horas de oscuridad (luces encendidas de 08:00 a 22:00).
   NOTA: No excedas los 50 embriones por plato con 20 mL de medio para asegurar un desarrollo normal.
4. A 1 dpf, retirar cuidadosamente los embriones no fecundados, malformados y anormales usando una pipeta Pasteur y reemplazar la solución que contiene embriones de pez cebra. Para el grupo WT, sustituye el medio existente por medio embrionario fresco de E3. Para el grupo tratado con MPTP, se sustituye el medio por una solución de MPTP de 50 μM (Figura 1A), y luego se devuelven ambos grupos a la incubadora.
5. Para ambos grupos, recoloca la solución y retira cualquier embrión muerto o enfermo cada 24 horas. Para el grupo tratado con MPTP, se sustituye la solución de MPTP diariamente desde la mañana de 1 dpf hasta la mañana de las 4 dpf (Figura 1A). Luego, se pasa el grupo tratado con MPTP a medio E3 a partir de la mañana de 5 dpf hasta el final del experimento.
   NOTA: Sustituye la solución suavemente con una pipeta Pasteur. Aspira el medio lentamente desde el borde de la placa de Petri y añade una solución fresca a lo largo de la pared de la placa de Petri para minimizar la perturbación de los embriones.

3. Monitorización de la regulación del sueño y la vigilia

1. A 4 dpf, selecciona larvas de pez cebra de cada grupo a las 18:00 y transfiere a una placa de 96 pozos usando una pipeta Pasteur modificada de 3 mL con la punta cortada, una larva por pozo (Figura 1B). Las primeras cuatro filas representan los grupos WT, y las últimas cuatro filas representan los grupos MPTP (48 pez cebra en cada grupo).
   NOTA: Para evitar estimular o dañar al pez cebra, modificar las pipetas Pasteur cortando la punta (10 mm) para proporcionar un diámetro ancho mayor que el tamaño de 4 larvas de pez cebra dpf (la longitud corporal supera los^{3,7 mm 27,28}).
2. Observa cada pozo con un microscopio estereoscópico para asegurarte de que la apariencia de cada larva de pez cebra está sana, las aletas están abiertas y se mueven regularmente, el cuerpo está erguido y la vejiga natatoria está^{inflada hasta 29}. Después de asegurarse de que los peces cebra en cada pozo están en buen estado, llena cada pozo con medio E3.
   NOTA: Rellena cada pozo con E3 de medio a casi abultamiento, asegurando que se mantenga la tensión superficial. Añade cuidadosamente el líquido para evitar burbujas y desbordamientos de pozo cruzado.
3. Después de transferir el pez y el líquido a una placa de 96 pozos, colócalo en la cámara de la caja de cebra para aclimatarse durante 30 minutos antes de la prueba conductual sueño-vigilia.
   NOTA: Antes de colocar la placa de 96 pozos en la cámara de la Zebrabox, limpia cuidadosamente la parte inferior de la placa para evitar que la suciedad afecte los resultados del seguimiento de vídeo.
4. Abre el software de seguimiento de vídeo Zebralab, selecciona el modo de cuantización y asegúrate de que la placa de 96 pocillos esté posicionada centralmente en la parte inferior de la cámara Zebrabox.
5. Ajusta la luz para apagar la luz a las 22:00 y enciende la luz a las 8:00, lo cual es coherente con las condiciones de luz cuando se cría el pez cebra. Durante el día, la luz blanca suele estar alrededor de 1000 lux. Establece los parámetros del software^{de la siguiente manera:} umbral de detección, 40; ráfaga, 25 (umbral para el movimiento); congelación (umbral para el movimiento), 4; tamaño del contenedor, 60 s; Tiempo total de monitorización, 52 h (20:00 del primer día hasta 00:00 p.m. del tercer día). Inicia el procedimiento de sueño-vigilia a las 20:00.
   NOTA: Una vez iniciado el procedimiento, prohíbe cualquier ruido y vibración del exterior durante todo el experimento, para no afectar el ritmo normal de sueño-vigilia del pez cebra. Para evitar la evaporación del agua durante la monitorización a largo plazo, cubre la placa de 96 pozos con film transparente.
6. Después de 52 horas, detener el experimento sueño-vigilia y guardar el archivo de datos. Quita la placa de 96 pozos de la ZebraBox.
   NOTA: Usando MATLAB y Excel, parámetros necesarios como el número de episodios de sueño (el episodio de sueño se define como periodos de inactividad que duran al menos 1 minuto⁾²⁹, la duración media de los episodios de sueño (duración media de los episodios), la duración total del sueño (toda la duración de los episodios durante el periodo de monitorización), la latencia del sueño (tiempo desde una transición ligera hasta el inicio del primer episodio de sueño). La actividad media (definida como actividad locomotora durante todo el periodo de monitorización) y la actividad despierta (definida como actividad locomotora solo durante el periodo de vigilia, excluyendo los episodios de sueño) se extrajeron y analizaron del archivo de datos.
   1. Utiliza la prueba t de un estudiante para comparar las diferencias entre el grupo WT y el grupo tratado con MPTP. Además, grafica la curva del sueño, la curva de actividad despierta y la curva de actividad media de los peces cebra durante las 52 horas usando el software MATLAB.

4. Paradigmas de respuesta fotomotora

NOTA: Los paradigmas de respuesta fotomotora (incluida la luz estroboscópica) son pruebas conductuales de alto rendimiento en 5 larvas dpf para cuantificar cambios locomotores sensorimotores y reflexivos en respuesta a una transición repentina de luz. Esta prueba se realizó utilizando una placa de 96 pozos, incluyendo 2 paradigmas: (1) una transición de luz de 1 minuto de oscuridad a 1 minuto de luz constante (1000 lx), y (2) una respuesta de luz estroboscópica que implica una transición de 1 minuto de oscuridad a 1 minuto de luz estroboscópica a 10 Hz.

1. Coloca las 5 larvas de dpf en una placa de 96 pozos (1 larva por pozo) (Figura 1B) y llena cada pozo con medio E3. Dividir un total de 96 larvas en el grupo WT y el grupo MPTP de media.
2. Paradigma de luz oscura-constante constante:
   1. Coloca la placa de 96 pozos con 5 larvas de dpf en la cebra y deja que las larvas se aclimaten durante 5 minutos en la oscuridad antes del ensayo.
   2. Abre el modo de seguimiento en línea de análisis.
   3. Establece el programa de transición de la luz de la siguiente manera: 0-60 s: Oscuro, 60-120s: Luz constante (1000 lx).
   4. Inicia el protocolo, recoge los parámetros de movimiento relacionados cada 6 s durante los 120 s de ensayo.
   5. Detener el protocolo en^{el 120} s, exportar el archivo de datos. Coloca las larvas en completa oscuridad durante 5 minutos para aclimatarlas al entorno, preparándolas para el siguiente ensayo de luz estroboscópica oscura.
3. Paradigma de luz estroboscópica oscura:
   1. Configura el programa de transición de luz de la siguiente manera: 0-60 s: oscuro, 60-120s: luz estroboscópica (1000 lx) a 10 Hz.
      NOTA: Un estroboscópico de 10 Hz corresponde a 10 pulsos de luz por segundo. En ZebraLab, implementa esto alternando la intensidad de la luz de 0 a 1000 lx cada 100 ms.
   2. Al completar la adaptación de 5 minutos de oscuridad, comienza el análisis de luz oscura a luz estroboscópica. Recoge los parámetros de movimiento cada 6 s durante el ensayo de 120 s.
4. Análisis de datos: Una vez que termina el ensayo, exporta el archivo de datos. Utiliza el software MATLAB para extraer la distancia de nado cada 6 segundos. Grafica la distancia total (valor medio por cada 6 segundos) nadada en el periodo de 2 minutos para ambos ensayos. Calcula el índice de congelación restando la distancia total recorrida en 1 minuto en oscuridad de la distancia total recorrida en^{luz 30}.
   NOTA: El índice de congelación < 0 indica comportamiento de congelación; El índice de congelación > 0 indica escape; Índice de congelación = 0 significa que no hay reacción. Utiliza una prueba t de Student y una ANOVA bidireccional para comparar las diferencias entre el grupo WT y el grupo tratado con MPTP. Se utilizaron un total de 48 larvas de pez cebra (n = 48) para cada grupo.

5. Evaluación de la tigmotaxis

1. Selecciona dos platos de 6 pozos y llena cada pozo con medio E3 de 4 mL.
2. A 5 dpf, se recogieron larvas de pez cebra del grupo WT y del grupo tratado con MPTP y se colocaron en dos placas de 6 pozos (uno es el grupo WT y el otro es el grupo tratado con MPTP, 1 larva por pozo) (Figura 1C).
   NOTA: Asegúrese de que la posición inicial de las larvas esté en el centro de los pozos.
3. Antes de la evaluación de la thigmotaxis, las placas del pozo deben colocarse en la posición adecuada de la caja de cebra con 15 minutos de antelación para acomodarlas.
4. Recogida y análisis de datos: Utilizando la función de área de dibuja , dibuja dos círculos concéntricos en el área de observación de cada pozo (el radio del círculo central representa la mitad del radio del pozo) (Figura 1C), y los parámetros restantes se ajustan a la evaluación locomotora. Inicia el protocolo para una evaluación de tigmotaxis de 5 minutos y haz un experimento paralelo.
   NOTA: Al finalizar el programa, el software Zebralab generará la trayectoria de las larvas de pez cebra en 5 minutos y varios parámetros de movimiento relacionados. En el archivo de datos, an1 representa toda el área de cada pozo, y an2 representa la zona interior de cada pozo. Así, dis(an1) total y dur(an1) total denotan la distancia total de nado y el tiempo total pasado en todo el pozo, mientras que dis(an2) total y dur(an2) total representan la distancia y el tiempo pasado en la zona interior, respectivamente.
   1. Calcula la thigmotaxis con las siguientes fórmulas:
      Calcula el porcentaje de distancia nadada en la zona exterior:
      
      Calcula el porcentaje de tiempo que pasa en la zona exterior:
      
   2. Emplear la prueba t de un estudiante para comparar las diferencias de tigmotaxis entre el grupo WT y el grupo tratado con MPTP. Se utilizaron un total de 24 larvas de pez cebra (n = 24) para cada grupo.

6. Evaluación locomotora

1. A 5 dpf, seleccionan larvas de pez cebra del grupo WT y del grupo tratado con MPTP, y transfierense respectivamente a dos placas de 12 pozos (uno es el grupo WT y el otro es el grupo tratado con MPTP, 1 larva por pozo, con 2 mL de medio E3) (Figura 1D).
   NOTA: Asegúrate de que los tamaños de las larvas de pez cebra sean similares, y las larvas seleccionadas deben tener aletas abiertas, postura erguida, buena expansión de la vejiga natatoria y movimiento regular.
2. Antes de la evaluación locomotora, coloque la placa del pozo en la posición de prueba del Zebrabox con 15 minutos de antelación para adaptarla.
   NOTA: Asegúrese de que las condiciones de luz durante la adaptación sean coherentes con las condiciones de luz durante la prueba.
3. Tras un periodo de aclimatación de 15 minutos, se selecciona el modo de seguimiento-análisis en línea, se registra la actividad locomotora de cada larva durante 5 minutos utilizando un sistema automatizado de seguimiento por vídeo. Utilizando el software Zebralab para recopilar trayectorias de movimiento y una variedad de parámetros locomotores relacionados cada 60 segundos, exporta el archivo de datos completo y utiliza MATLAB para analizar la distancia total y la velocidad media de cada larva en 5 minutos.
   1. Utiliza una prueba t de Student y una ANOVA bidireccional para comparar las diferencias entre el grupo WT y el grupo tratado con MPTP. Se utilizaron un total de 24 larvas de pez cebra (n = 24) para cada grupo.

7. Prueba de respuesta al sobresalto

NOTA: Esta prueba mide la respuesta visual al sobresalto (VSR), también conocida como sobresalto inducido por un destello oscuro, provocada por transiciones repentinas hacia la oscuridad. Esta prueba de respuesta al sobresalto evalúa un sobresalto visual evocado por fótica inducido por destellos oscuros abruptos a escala milisegundos. A diferencia del paradigma de luz estroboscópica oscura, que implica pulsos de luz repetidos para evaluar respuestas conductuales sostenidas, este ensayo se centra en reacciones motoras rápidas y reflexivas ante un estímulo visual agudo.

1. Preparaciones: a 5 DPF, seleccionar larvas de pez cebra del grupo WT y del grupo tratado con MPTP, y transfiererlas respectivamente a dos placas de 12 pozos (uno es el grupo WT y el otro es el grupo tratado con MPTP, 1 larva por pozo, con 2 mL de medio E3) (Figura 1D).
2. Antes de la prueba de respuesta al sobresalto, coloca la placa del pozo en la posición de prueba del Zebrabox con 5 minutos de antelación para adaptarla.
3. Establecer los parámetros de estimulación: abrir el software Zebralab , ejecutar el modo de análisis en línea de seguimiento , abrir la interfaz de disparo de luz , seleccionar Usar uno de los 3 métodos de disparo a continuación, activar Estímulos mejorados, configurar en Cuando inicia la sesión; en el calendario de transición, el ritmo oscuro del destello se define de la siguiente manera (el programa comienza a activarse tras 21 s): Transición 1: 5 ms, 100% de intensidad de luz; Transición 2: 2890 ms, intensidad lumínica del 100%; transición 3: 5 ms, 0% de intensidad de luz; transición 4: 100 ms, 0% de intensidad luminosa; Marque Repetir lista de transiciones para asegurar parpadeos periódicos.
4. Protocolo de inicio: asegúrate de que la función de grabación de vídeo de Numeriscope esté activada; el seguimiento automatizado de alto rendimiento generará un conjunto de datos multidimensional que abarca 30 endpoints de comportamiento en esta prueba de los 90 s.
5. Análisis de datos: Tras completar el ensayo de respuesta de sobresalto, exporta los archivos de datos en bruto e impórtalos al software MATLAB para su análisis. Calcula la distancia de nado de cada larva en intervalos de 3 s, junto con la velocidad media de natación.
   1. Identifica la distancia máxima de movimiento, la velocidad máxima o la latencia de respuesta tras el estímulo de parpadeo para cada grupo. Utiliza una prueba t de Student y una ANOVA bidireccional para comparar las diferencias entre el grupo WT y el grupo tratado con MPTP. Se utilizaron un total de 24 larvas de pez cebra (n = 24) para cada grupo.

8. Ensayo de desafío claro-oscuro

1. A 5 dpf, transfiere las larvas de pez cebra individualmente en dos placas de 24 pozos (Figura 1E), con una larva por pozo y 1 mL de medio E3 por pozo. Cada placa contenía 24 larvas, y las dos placas de 24 pozos se dividieron equitativamente en el grupo WT y el grupo tratado con MPTP (n = 24 por grupo).
2. Antes de la prueba, coloque la placa de 24 pozos en el área designada dentro del Zebrabox durante un periodo de aclimatación a la luz de 5 minutos para adaptarse al entorno de prueba. Activa el modo Seguimiento - Análisis en línea. Configura el programa de iluminación de la siguiente manera: 6 minutos de luz constante seguidos de 4 minutos de completa oscuridad (Figura 1E). El tiempo total de prueba es de 10 minutos, y el intervalo para recoger puntos de datos es de 60 s.
   NOTA: Los 6 minutos globales de luz son para la aclimatación y habituación, asegurando una línea de base locomotora estable y respuestas especiales^{luz-oscuridad 31,32}.
3. Al minuto 10, detener el registro de comportamiento y guardar datos. Retira cuidadosamente el plato de la caja de cebra.
4. Para cada larva, extrae la distancia de nado cada intervalo de 60 s. Calcula la distancia recorrida durante la fase de luz (^{0-6 min),} la fase oscura (⁷ th-10 min) y el periodo total de 10 minutos. Cuantifique el comportamiento de tigmotaxis y el rendimiento de aprendizaje por habituación en la fase oscura.
   NOTA: El aprendizaje por habituación se define como la reducción de una respuesta conductual cuando un animal está expuesto a un estímulo/entorno continuo^33,34, y se evaluó comparando estadísticamente la distancia media total recorrida (mm) durante el ^{primer y el} cuarto^minuto tras la transición de luz a oscuridad. Utiliza una prueba t de Student y una ANOVA bidireccional para comparar las diferencias entre el grupo WT y el grupo tratado con MPTP. Se utilizaron un total de 24 larvas de pez cebra (n = 24) para cada grupo.

9. Eliminación de residuos MPTP

NOTA: Después de cada experimento conductual, rocía y limpia superficies contactadas con MPTP (por ejemplo, bancos de laboratorio y la ZebraBox) con hipoclorito de sodio recién preparado (lejía; ≥10% v/v).

1. Recoge los residuos líquidos (incluyendo las soluciones de exposición restantes y los medios de enjuague) y los residuos sólidos (por ejemplo, pipetas Pasteur, guantes, placas de Petri y placas de varios pozos) del MPTP. Etiquétalos claramente como residuos neurotóxicos peligrosos.
2. Tratar los residuos líquidos y materiales sólidos contaminados con hipoclorito de sodio recién preparado (lejía; ≥10% v/v) durante al menos 24 horas para asegurar la descontaminación, seguido de su eliminación conforme a la normativa institucional.
3. Eutanasiar las larvas de pez cebra tratadas con MPTP sumergiéndolas en una solución diluida de hipoclorito de sodio (por ejemplo, proporción 1:5 de 6% de lejía: agua) durante 5 min³⁵. Muerte confirmada por falta de movimiento y latido cardíaco. Tratar las larvas y medios descontaminados como residuos biológicos peligrosos para su disposición institucional (siguiendo protocolos aprobados por la institución).

Resultados

Monitorización de la regulación sueño-vigilia
La monitorización de regulación sueño-vigilia a 52 horas comenzó a 4 dpf y se realizó utilizando una placa de 96 pozos. El pez cebra en el grupo tratado con MPTP mostró alteraciones significativas en la estructura del sueño en comparación con el grupo WT. En la Figura 2 se muestran curvas representativas de sueño, gráficos de actividad en la vigilia y trazos promedios de actividad. Los parámet...

Discusión

Este estudio desarrolló y verificó un protocolo integral para evaluar y analizar el fenotipo conductual similar al MPTP de tipo DP. Este protocolo integraba 6 pruebas diferentes: evaluación locomotora, ensayo de tigmotaxis, prueba de respuesta al sobresalto, paradigmas de respuesta fotomotora (incluida la estimulación con luz estroboscópica), ensayo de desafío luz-oscuridad y monitorización de la regulación sueño-vigilia, para evaluar y representar los defectos motores y no motores de la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
100 y más veces; Solución estándar E3	Shanghái Feixi Biotecnología	N/A	que contiene 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl2 y middot; 2H2O, y 9,78 g de MgCl2· 6H2O por litro
Placa de cultivo celular de 12 pozos	NEST Biotecnología	712011	No tratado, no pirogénico, estéril, poliestireno. Utilizado para ensayos conductuales larvales de pez cebra
Placa de cultivo celular de 24 pozos	NEST Biotecnología	702011	No tratado, no pirogénico, estéril, poliestireno. Utilizado para ensayos conductuales larvales de pez cebra
Pipeta Pasteur de 3 mL	Biologix	30-0238A1
Placa de cultivo celular de 6 pozos	NEST Biotecnología	703011	No tratado, no pirogénico, estéril, poliestireno. Utilizado para ensayos conductuales larvales de pez cebra
Placa de cultivo celular de 96 pozos	NEST Biotecnología	701011	No tratado, no pirogénico, estéril, poliestireno. Utilizado para ensayos conductuales larvales de pez cebra
MATLAB R2020a	MathWorks, EE.UU.	N/A	MATLAB R2020a, licencia para todo el campus obtenida del portal de software de la Universidad de Shandong (softms.sdu.edu.cn). Utilizado para el análisis estadístico de datos de comportamiento larvario de pez cebra.
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Microsoft Excel (parte de Microsoft Office), versión instalada a través del portal de software licenciado de la Universidad de Shandong (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina)	Beyotime	41125281	5 mg
Placa de Petri	NEST Biotecnología	704202	100 mm, estéril, mango de agarre fácil, tratado con TC
Solución de hipoclorito de sodio	Macklin	S817439	Solución de lejía doméstica de stock (base cloro activo del 6-14%), diluida a ≥ 10% v/v para descontaminación de superficies y residuos; también diluido 1:5 (6% de lejía: agua) para la eutanasia de larvas de pez cebra tratadas con MPTP.
Microscopio estereoscópico	Olimpo	Serie SZX2
Sistema de Seguimiento de Vídeo de Alta Resolución Zebrabox	Viewpoint, Francia y nbsp;	N/A
Zebralab Software	Viewpoint, Francia y nbsp;	N/A	Versión (3,52,3,87)