Grabaciones de fotometría multifibra bicolor de la Red de Comportamiento Social en ratones

Resumen

La fotometría de fibras es una de las técnicas más comunes para registrar la actividad de calcio en poblaciones neuronales profundas del cerebro. Aquí describimos un protocolo para la imagen personalizable y multisitio en dos colores de la actividad calcio y otras señales fluorescentes dinámicas procedentes de poblaciones neuronales profundas del cerebro en ratones.

Resumen

La fotometría de fibra, el registro masivo de señales a través de un cable de fibra óptica, es un método útil para registrar la actividad de calcio de grupos de neuronas en el roedor en movimiento libre. En particular, este método hace que atacar pequeñas poblaciones de neuronas genéticamente especificadas en áreas más ventrales y menos accesibles del cerebro sea un problema manejable, ya que sigue siendo difícil registrarlo a resolución celular. Esta técnica puede escalarse para registrar desde múltiples sitios simultáneamente mediante un enfoque multifibra agrupada y puede dirigirse a múltiples tipos celulares mediante estrategias genéticas en cada sitio registrado. Aquí proporcionamos un protocolo para construir e insertar matrices multifibra personalizadas para dirigirse a la red de comportamiento social del ratón (hasta 12 sitios). Este protocolo detalla los procedimientos quirúrgicos necesarios para la selección exitosa de múltiples sitios utilizando nuestras matrices multifibras personalizadas y el enfoque viral para la administración de indicadores fluorescentes de actividad calcio con desplazamiento verde y al rojo para la imagen simultánea de dos poblaciones neuronales genéticamente identificadas en cada sitio. Demostramos cómo grabar desde estas regiones utilizando un sistema de cámaras CMOS (semiconductores complementarios de óxido metálico) disponible comercialmente durante el comportamiento social. Además, este protocolo demuestra métodos para el control de calidad y detalla una cadena de preprocesamiento para la corrección de ruido y la estandarización. Por último, discutimos algunas posibles aplicaciones de la herramienta para descubrir hallazgos novedosos sobre redes cerebrales a gran escala.

Introducción

La fotometría de fibra, el registro masivo de señales fluorescentes a través de cables de fibra óptica, ha surgido como una técnica poderosa para medir la actividad de poblaciones neuronales en regiones profundas del cerebro. A menudo, estas regiones no son fácilmente accesibles mediante microendoscopía o enfoques electrofisiológicos^{tradicionales 1,2,3}. Un objetivo principal en la neurociencia de sistemas contemporánea es identificar y desentrañar los cálculos empleados por redes cerebrales a gran escala, específicas de tipos celulares, implicadas en la generación de comportamientos. Las sondas neuropíxeles y las férulas multifibras disponibles comercialmente destacan en el registro de poblaciones neuronales^{linealmente alineadas} 4,5,6,7, mientras que la imagen cortical de campo amplio proporciona una excelente cobertura de la dinámica cortical^{superficial 8,9}. Sin embargo, registrar simultáneamente a partir de poblaciones neuronales subcorticales espacialmente dispersas pero funcionalmente conectadas ha seguido siendo técnicamente^desafiante 5,10,11,12. Además, aunque es posible atacar múltiples estructuras cerebrales profundas utilizando múltiples ferrules de fibra única para la fotometría, este enfoque está limitado a poblaciones neuronales lo suficientemente distales entre sí para implantar múltiples^{férulos 12}. Las matrices de fotometría multifibra a medida cubren esta brecha permitiendo grabaciones simultáneas desde muchas regiones subcorticales en animales que se comportan libremente con restricciones mínimas, proporcionando una ventana única a la coordinación a nivel de red durante comportamientos complejos.

La red de comportamiento social (SBN) representa un sistema ideal para investigar la dinámica de las redes cerebrales a gran escala. El SBN es un conjunto densamente interconectado y evolutivamente conservado de estructuras subcorticales implicadas en la generación del comportamiento social que se ha identificado en todas las clases de^{vertebrados 13, 14 y 15}. Estas estructuras tradicionalmente incluyen, pero no se limitan a, el tabique lateral, la zona preóptica, el núcleo de lecho de la estría terminal, los núcleos hipotalámicos anteriores y ventromediales, la amígdala medial, el núcleo accumbens y el gris^{periacueductal} 13,14,15. Dentro del SBN, poblaciones neuronales específicas definidas por marcadores moleculares desempeñan un papel crítico en la regulación del comportamiento social. Las neuronas del ácido Σ-aminobutírico (GABAérgica) (marcadas por la expresión del transportador vesicular GABA, o VGAT) y las neuronas glutamatérgicas (marcadas por la expresión del transportador vesicular de glutamato, o VGlut) representan los principales tipos celulares excitatorios e inhibidores dentro de la red y probablemente desempeñan roles disociativos en la modulación de la acción^social 16,17,18,19 . Más allá de estos sistemas clásicos de neurotransmisores, la señalización hormonal sexual desempeña un papel fundamental en el funcionamiento de la red. Por ejemplo, muchos comportamientos sociales masculinos y femeninos requieren la expresión del receptor alfa de estrógenos, y la actividad en neuronas SBN que expresan estos receptores impulsa causalmente estos^{comportamientos} 16,20,21,22,23,24,25,26 . Además, las poblaciones neuronales SBN están enriquecidas con ligandos y receptores de muchos sistemas neuromoduladores, incluyendo dopamina, arginina vasopresina, oxitocina, opioides, taquiquinina, neuropéptido Y, prolactina, orexina, péptido relacionado con agoutinas, melanocortinas, kisspeptina y la hormona liberadora de^{gonadotropinas} 17,18,19,27,28,29,30.³¹, y los avances recientes en sensores codificados genéticamente permiten ahora el seguimiento de muchas de estas diversas moléculas de^{señalización 32,33,34,35,36,37,38}. Dado que las poblaciones neuronales de SBN están espacialmente dispersas a lo largo de las estructuras subcorticales, las preparaciones experimentales tradicionales (por ejemplo, electrofisiología extracelular, imagen de superficies corticales y enfoques anteriores de fotometría multifibra) no pueden capturar la dinámica de actividad momento a momento a lo largo de esta red cerebral a gran escala. No obstante, al monitorizar la dinámica del calcio en poblaciones neuronales definidas genéticamente junto con los patrones de liberación de neuromoduladores, plataformas personalizadas de fotometría de fibras multisitio pueden revelar qué tipos celulares específicos y moléculas de señalización codifican características concretas del comportamiento social, proporcionando nuevas perspectivas mecanicistas.

Aquí desarrollamos una plataforma personalizable para fotometría de fibra multisitio y bicolor que permite grabar simultáneamente desde hasta 12 regiones cerebrales en ratones que se comportan libremente. Utilizando este enfoque, realizamos registros fotométricos en dos colores de la actividad calciaria de 22 poblaciones neuronales identificadas distribuidas en 11 regiones cerebrales de SBN, junto con mediciones de fluctuaciones de dopamina en el núcleo accumbens con un sensor DA basado en activación de GPCR (GRAB-DA1m)³³ (Tabla 1). Este protocolo (Figura 1) detalla la construcción de matrices multifibras personalizadas, procedimientos quirúrgicos para dirigirse a múltiples sitios profundos del cerebro, estrategias de administración viral para expresar indicadores duales de calcio (GCaMP³⁹ y RCaMP⁴⁰), adquisición de datos mediante un sistema de fotometría de fibra basado en cámara CMOS comercialmente disponible, métodos de control de calidad y una cadena de preprocesamiento para la corrección de ruido y la estandarización de señales. De forma crucial, nuestra pipeline de preprocesamiento incorpora grabaciones de longitud de onda de control isoséstico que nos permiten realizar correcciones de artefactos de movimiento. Adoptamos un enfoque basado en regresión⁴¹ para corregir artefactos de movimiento, asegurando la fidelidad de la señal durante comportamientos sociales vigorosos como montar o pelear. Como nuestro método personalizado de fotometría multifibra puede monitorizar simultáneamente la actividad dispersa tanto en estructuras cerebrales profundas proximales como distales manteniendo la especificidad de tipo celular de los registros mediante la segmentación^{genética 42,43}, ofrece ventajas significativas frente a enfoques alternativos para registrar la dinámica de la actividad neuronal a través de redes cerebrales profundas y a gran escala.

Este protocolo es ideal para experimentos que requieren registros simultáneos de regiones cerebrales subcorticales espacialmente dispersas (≥4 sitios) en animales que se comportan libremente, especialmente al investigar dinámicas a nivel de red entre tipos celulares definidos genéticamente o al rastrear la liberación de neuromoduladores junto con la actividad neuronal. El enfoque es especialmente valioso para estudiar comportamientos naturalistas que implican movimiento vigoroso (por ejemplo, interacciones sociales), donde nuestra cadena de corrección de artefactos de movimiento garantiza la fidelidad de la señal. Sin embargo, los investigadores que buscan resolución de célula única, distinción entre señales somáticas y axonales, o registros de regiones corticales superficiales pueden encontrar más apropiados enfoques alternativos (por ejemplo, microscopía en miniatura, neuropíxeles o imagen de campo amplio). Las consideraciones prácticas clave incluyen la complejidad quirúrgica, la necesidad de fabricación personalizada de matrices multifibra y el establecimiento de la infraestructura de materiales necesaria (capacidades de impresión 3D, herramientas de fibra óptica).

Protocolo

NOTA: Este protocolo fue probado y validado con ratones adultos de entre 8 y 25 semanas. Los ratones se alojaron a 21–26 °C y humedad entre el 30% y el 70% en un ciclo de luz oscura inversa de 12 horas (OFF: 10:00 AM; EL DÍA: 22:00). Los experimentos se realizaron exclusivamente durante la fase activa subjetiva (oscura). Se proporcionaban comida y agua ad libitum. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Princeton y estaban de acuerdo con los Estándares de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Fabricación de matrices multifibra y patchcord (Figura 1A)

1. Fabricar un parche (Figura 2A).
   1. Obtén un cable de parche ramificado de fibra 12 e imprime el conector de cable de parche y los accesorios de perforación estereotáctica proporcionados (Archivo Suplementario 1, Archivo Suplementario 2, Archivo Suplementario 3) usando resina (resistencia a la tracción: 8,7 kilolibras/pulgada cuadrada [ksi], módulo e: 377 ksi, deflexión térmica: 138 °F, alargamiento: 8%).
   2. Construye el puck de pulido proporcionado (Archivo Suplementario 4) con una varilla de acero inoxidable de 2 pulgadas de diámetro e incluye un recorte del tamaño de la matriz multifibra en el centro del puck.
   3. Limpia manualmente el exceso de resina de los agujeros pasantes del pasador en la matriz multifibra con una broca de 1,22 mm x 11 mm. Incluso con impresión 3D de precisión, los agujeros de los alfileres de la vareta son un poco demasiado pequeños para que la vara pueda pasar.
   4. Taladra los agujeros de fibra a paso.
      1. Inserta los pasadores de varilla de acero aleado (1,19 mm x 12,7 mm) en los 4 orificios de los 4 pasadores del accesorio de perforación estereotáctica y coloca el conector del cable de parche con la parte inferior hacia arriba en el accesorio de perforación estereotáxica, con los pasadores de la varilla pasando por los agujeros de la varilla multifibra.
      2. Aprieta los tornillos de la M4 tamaño en los orificios roscados para asegurar el conector del cable de parche y asegura el accesorio de perforación estereotáxica en el marco estereotáctico.
      3. Introduce una broca de 0,25 mm x 5,5 mm en el taladro estereotáctico y monta el taladro en el marco estereotáctico. Con esta broca, nivela la guiñada, el paso y el balanceo de la matriz multifibra con una tolerancia máxima de desviación de ±0,03 mm.
         NOTA: Nivelar la guiñada y el paso en las posiciones más anteriores y posteriores de la impresión 3D, nivelar el rollo en las cuatro esquinas de la matriz multifibra.
      4. Centra el taladro sobre uno de los agujeros de fibra impresos en 3D y ajusta las coordenadas estereotácticas X/Y del marco estereotáctico a las coordenadas ML (X) y AP (Y) de la región cerebral asociada (Tabla 1). Mueve el taladro a las nuevas coordenadas (0, 0) del marco estereotáctico para centrar el taladro sobre el agujero pasante del pasador anterior.
      5. Utiliza la broca de 0,25 mm x 5,5 mm para perforar cada agujero de fibra hasta una profundidad de 5,5 mm en las coordenadas estereotácticas definidas (Tabla 1).
         NOTA: Utiliza un trozo largo de fibra sobrante para comprobar que todos los agujeros están completamente despejados antes de retirar la matriz multifibra del marco estereotáctico. Esto limitará el número de veces que la matriz multifibra necesitará nivelarse y perforarse para despejar los agujeros pasantes.
   5. Adjunta el conector del cable de parche y el cable de ramificación
      1. Expone >10 cm de las fibras del parche. Recorta las fibras con un trazado para asegurarte de que tengan la misma longitud. Luego, coloca una sola pieza de tubo termoretráctil de 3/16" y otro de 5/16" alrededor de las 12 fibras del parche.
         NOTA: El tubo protegerá cualquier fibra expuesta una vez que esté pegada al conector.
      2. Inserta cada fibra en uno de los orificios pasantes del conector del cable de conexión de modo que aproximadamente 0,3 mm de fibra queden expuestos en la superficie inferior. Después de insertar todas las fibras, utiliza una punta de aguja de 21–27 G para aplicar superpegamento en la superficie superior del conector del parche y así fijar las fibras en su lugar.
      3. Aplica epoxi en la superficie superior del conector del cable de parche en forma de pirámide de 0,5–1 cm de altura. Asegúrate de que ninguna resina epoxi cubra ninguna zona que no sea la superficie superior donde se insertaron las fibras. Deja que la resina epoxi cure a temperatura ambiente durante la noche.
      4. Utiliza una pistola de calor en la configuración más baja para encoger el tubo termoretráctil sobre la resina epoxi y la fibra expuesta que hay encima (<3–5 cm).
         NOTA: Evita tocar el tubo termoretráctil mientras haces esto para evitar quemaduras.
      5. Corta un trozo de tubo de plástico blando con un diámetro interior de 3 mm a la longitud de las fibras expuestas restantes, corta una rendija a lo largo del borde del tubo y encierra la fibra expuesta restante dentro del tubo.
      6. Colorea el tubo transparente con un marcador negro opaco para asegurarte de que las fibras ya no sean visibles, minimizando la iluminación de la fibra expuesta durante los experimentos de imagen.
   6. Pule el cable de parche.
      1. Asegura el conector del cable de parche en la superficie inferior del puck de pulido personalizado. Pulir el conector del cable de parche en láminas de pulido de grano de 6 μm, 3 μm, 1 μm y luego de grano 0,01 μm con 10–20 movimientos en forma del símbolo o lámina de infinito. Para las láminas de grano de 1 μm y 0,01 μm, coloca 5 gotas de agua destilada antes de pulir.
      2. Limpia la superficie del conector para eliminar cualquier exceso de agua destilada. Comprueba si hay imperfecciones o grietas en la parte pulida del conector del cable de parche usando un microscopio de campo claro y, si existe, repite el pulido.
   7. Comprueba la salida del cable patchcable.
      1. Conecta el extremo del conector Sub-miniature versión A (SMA) del parche a un sistema de fotometría de fibra basado en cámara CMOS. Utilizando software de codificación visual, sigue el manual del sistema de imagen fotométrica y enfoca la cámara CMOS en el extremo SMA del cable de conexión.
         NOTA: El manual se actualiza regularmente para alinearse con las actualizaciones de software. Como el código visual del sistema de fotometría suele cambiar con las nuevas versiones de software, este manual contiene la información más actualizada sobre las versiones actuales de software.
      2. Mide la salida de un cable de parche de 470 nm al 20% de potencia con un medidor óptico. Repite el paso 1.1.7 si la salida del cable es < 2,5 mW.
2. Fabrica una matriz multifibra.
   1. Imprime la matriz multifibra proporcionada (Archivo Suplementario 5, Archivo Suplementario 6) usando resina con las especificaciones técnicas descritas en el paso 1.1.1.
   2. Prepara la matriz multifibra.
      1. Inserta tuercas hexagonales de latón M0.6 en cada una de las cuatro ranuras en las esquinas laterales de la matriz multifibra y alinea el orificio de la tuerca hexagonal en el centro de la abertura.
      2. Aplica una gota de superpegamento desde el lateral de cada ranura de la tuerca hexagonal con una punta de aguja de 21–27 G, añadiendo gotas adicionales para reforzar si es necesario. Deja que el pegamento se seque a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de pasar al siguiente paso.
      3. Afeita cualquier pegamento de los laterales de la matriz multifibra usando una cuchilla para asegurarte de que encaje en el puck de pulido.
      4. Si el exceso de superpegamento se secó en el lado superficial de la matriz multifibra, pule la superficie de la matriz multifibra usando el puck de pulido personalizado y láminas de pulido de grano de 30 μm hasta que se retire el pegamento y la superficie de la matriz multifibra quede plana.
      5. Limpia manualmente el exceso de resina de los agujeros de paso del pasador en la matriz multifibra con una broca de 1,22 mm.
   3. Perfora los agujeros de fibra atravesante (Figura 2B-C).
      1. Inserta los pines de varilla de acero aleado (1,19 mm x 12,7 mm) en los agujeros de 4 pasadores del accesorio de perforación estereotáxica y coloca la matriz multifibra en el lado superficial (lado plano) hacia arriba en el accesorio estereotáxico de perforación, con los pasadores de varilla pasando por los agujeros pasantes del clavillo de la matriz multifibra.
      2. Repite el paso 1.4.2– paso 1.4.5.
   4. Prepara fibras para la matriz multifibra.
      1. Quita la carcasa de plástico de una sección de fibra óptica de 200 μm y 0,39 NA usando un decapador. Limpia la fibra con etanol.
      2. Corta las fibras en secciones de ~3–5 cm de largo usando un cuchillo de fibra. Corta estas secciones por la mitad usando un grabador de fibra. Utiliza un microscopio de campo claro para asegurarte de que al menos un extremo de las secciones cortadas esté sin astillas ni imperfecciones. Solo usa fibras con al menos un extremo sin imperfecciones.
      3. Pega una regla precisa de al menos 15 mm de longitud bajo el microscopio de campo brillante. Coloca el lado sin imperfecciones de la fibra en la posición 0 mm de la regla (Figura 2D). Corta fibras a la longitud deseada para cada región objetivo (Tabla 1).
         NOTA: La longitud de la fibra se calcula sumando 6 mm a la coordenada estereotáctica D/V para la fibra más profunda, y luego ajustando ese valor para todas las fibras para que coincida con la diferencia entre su coordenada D/V y la coordenada D/V de la fibra más profunda.
   5. Inserta fibras en la matriz multifibra.
      1. Coloca la matriz multifibra en el soporte de fabricación con la superficie hacia abajo. Alinea y asegura la pieza usando alfileres de varilla.
      2. Ajusta la longitud de la fibra al sitio (Tabla 1) e inserta fibras cortadas en los orificios pasantes apropiados de la matriz multifibra con el lado sin imperfecciones hacia arriba. Asegúrate de que todas las fibras estén completamente introducidas antes del siguiente paso.
      3. Aplica superpegamento con una punta de aguja de 21–27 g para pegar todas las fibras en su lugar. Deja que el pegamento se despliegue al menos 30 minutos a temperatura ambiente antes de continuar.
   6. Pulir el array multifibra repitiendo el paso 1.1.6 con el array multifibra con el lado hacia abajo (Figura 2E).
   7. Comprueba la eficiencia de la matriz multifibra.
      1. Limpia la superficie pulida de la matriz multifibra con etanol y luego aplica gel de ajuste de índice. Inserta 4 clavijas en el conector del parche y asegura la matriz multifibra a ella usando tornillos de accionamiento G5 y un destornillador asociado (Figura 2F).
      2. Utiliza un medidor de potencia para medir la emisión de LED de 470 nm y 560 nm de la matriz multifibra. Eficiencia de cálculo usando estos valores:
         
      3. Si la eficiencia es <75%, repite los pasos 1.2.7.1–1.2.7.2.
         NOTA: Si volver a pulir no mejora la eficiencia y no hay imperfecciones en las fibras, es posible que las fibras de la matriz multifibra estén desalineadas con el conector del cable de parcheo.
   8. Preparar una matriz multifibra para su uso (Figura 2G).
      1. Inserta 4 clavijas en los orificios pasantes del conjunto multifibra. Asegúrate de que los pasadores de la varilla no sobresalgan más de 1 mm desde el lado del cerebro de la matriz multifibra.
      2. Coloca el superpegamento en el lado del cerebro sobre los pasadores de la varilla. Deja que el pegamento seque al menos 10 minutos a temperatura ambiente antes de usar la matriz multifibra.

2. Cirugía (Figura 1B)

1. Prepara el espacio y las herramientas quirúrgicas.
   1. Limpia el marco estereotáctico para asegurar un área de trabajo aséptica.
   2. Obtén sutura estéril y absorbible.
   3. Autoclave: un par de pinzas finas, tijeras finas y dos pinzas bulldog.
   4. Asegúrate de que el vaporizador esté lleno de isoflurano. Asegúrate de que el tubo para las líneas de isoflurancia, vacío y oxígeno esté bien conectado al vaporizador, la cámara de inducción y el cono de nariz del marco estereotáctico.
2. Obtén los virus adenoasociados jRCaMP1b, GCaMP6f y GRAB-DA1m.
   PRECAUCIÓN: Siempre lleva equipo de protección individual al manipular virus.
   1. Diluir los virus a una concentración de trabajo entre 1x10,¹³ y 4x10,¹³ partes por mililitro si es necesario.
   2. Prepara una mezcla 1:1 de virus adenoasociados jRCaMP1b y GCaMP6f.
   3. Coloca una alicota de la mezcla viral 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f y una alicota del virus GRAB-DA1m sobre hielo para mantener la temperatura a 4 °C.
3. Induce anestesia.
   1. Coloca el ratón en la cámara de inducción y cierra la puerta de la cámara. Inicia el flujo de oxígeno hacia el vaporizador a 1 L/min.
   2. Dirige el flujo de gas hacia la cámara de inducción y enciende la línea de vacío para eliminar el exceso de gas de la cámara. Ajusta el vaporizador a una concentración de isoflurano entre el 3% y el 5%.
4. Transfiere el ratón al fotograma estereotáxico.
   1. Una vez que la respiración del ratón se haya ralentizado a 1 respiración/s, muévelo al marco estereotáctico. Engancha los incisivos delanteros del ratón en la ranura de la boquilla del cono nasale y aprieta el cono nasale sobre la nariz del ratón.
   2. Cambiar el flujo de gas al marco estereotáctico con la concentración de isoflurano ajustada al 1%–2% para mantener la anestesia. Cambia la línea de vacío para eliminar el gas del cono de nariz.
      NOTA: Monitoriza la respiración del ratón durante toda la cirugía y ajusta la concentración de isoflurano según sea necesario para mantener una anestesia profunda con una frecuencia respiratoria de 1 respiración/s. La anestesia profunda debe confirmarse periódicamente durante la cirugía asegurándose de que el ratón no responda a un pellizco en el dedo del pie.
   3. Ajusta el sistema de calefacción para mantener una temperatura corporal de 35 °C y aplica ungüento óptico en los ojos del ratón para evitar que se sequen.
   4. Inserta barras estereotácticas para que presionen a ambos lados del cráneo, ligeramente dorsales y anteriores a los conductos auditivos. Aprieta las barras de los oídos y asegúrate de que el cráneo del ratón esté fijo aplicando una presión suave en la parte superior de la cabeza.
5. Prepara el cuero cabelludo para la incisión.
   1. Recorta o afeita el pelo de la parte superior de la cabeza del ratón hasta que quede corto. Aplica gel depilatorio en la parte superior de la cabeza del ratón y deja actuar aproximadamente un minuto. Retira el gel restante con un hisopo limpio.
   2. Repite la 2.5.1 según sea necesario hasta eliminar todo el vello de la parte superior de la cabeza.
   3. Desinfecta la piel de la parte superior de la cabeza aplicando bastoncillos de algodón para aplicar betadina (solución de povidona-yodo al 10%) seguida de una solución de etanol al 70%.
6. Exponed el cráneo.
   1. Corta una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, que se extiende desde ligeramente posterior de la vena lambda hasta ligeramente anterior de la vena rin rostral.
      NOTA: La vena rhinal rhostral es el vaso sanguíneo que se sitúa en la superficie dorsal del cerebro, entre el bulbo olfativo y la corteza prefrontal.
   2. Corta y retira la piel afeitada alrededor de los lados de esta incisión para formar un corte en forma de lágrima que expone los huesos parietales, la punta anterior del hueso intraparietal y la porción de los huesos nasales que está anterior a la vena rin rostral (Figura 2H).
   3. Limpia suavemente la superficie del cráneo con solución salina al 0,9% y un hisopo limpio.
7. Nivela el cráneo.
   1. Localiza dónde la vena rin rostral se une con la sutura sagital. Marca este punto con una hoja de bisturí estéril.
   2. Inserta una broca de carbono #92 en el taladro estereotáctico y monta el taladro en el marco estereotáxico. Utiliza el manipulador estereotáctico para colocar la punta del taladro sobre la superficie del cráneo en el punto marcado y poner a cero las coordenadas X, Y y Z del taladro.
   3. Nivelar el paso del cráneo midiendo la profundidad Z en el punto marcado y -8,25 mm posterior a este. Nivelar la guiñada del cráneo midiendo la distancia lateral entre el punto marcado y la posición -8,25 posterior. Balanceo nivelado midiendo la profundidad Z en posiciones ±2,0–2,5 mm desde la línea media en las posiciones -2,0, -4,5 y -7,0 mm respecto al punto marcado.
8. Realizar craneotomías y duratomías.
   1. Sustituye la broca por una de carburo #76 o #78. Poner el taladro a cero en la posición marcada en la unión de la sutura sagital, la vena rin rostral y la superficie del cráneo.
   2. Mueve el taladro a las coordenadas A/P y M/L de cada región cerebral (Tabla 1). En cada sitio, realiza una craneotomía y retira cuidadosamente la duramadre en cada craneotomía usando una punta vacía de jeringuilla de 27G o menos.
9. Inyecta el virus.
   1. Extrae micropipetas de vidrio de modo que su punta se estrecha al menos 7 mm y tenga una abertura de 10–30 μm.
      NOTA: Reinicie los pasos 2.9.2–2.9.12 si la micropipeta contiene burbujas de aire después de cualquiera de los pasos siguientes.
   2. Rellena una punta vacía de micropipeta de vidrio con aceite mineral. Inserta y asegura la punta de la micropipeta en el inyector de nanolitros. Utiliza la interfaz del inyector de nanolitros para expulsar la mayor cantidad posible de aceite mineral de la micropipeta.
   3. Monta el inyector de nanolitros en el marco estereotáctico. Corta un pequeño trozo de lámina de cera de parafina y colócala sobre la cabeza del ratón.
   4. Pipeta 1 μL de la mezcla del virus jRCaMP1b:GCaMP6f sobre la cera de parafina. Baja la punta del inyector de nanolitros para que la punta de la micropipeta de vidrio quede dentro de la mezcla del virus y rellene la micropipeta con virus usando la interfaz del inyector.
   5. Repite 2.9.4 hasta que todo el virus que se va a usar haya sido transferido al inyector de nanolitros (Tabla 1). Retira y desecha la cera de parafina en un contenedor de residuos de riesgo biológicos.
   6. Poner la punta de la micropipeta del inyector en la posición marcada en la unión de la sutura sagital, la vena rin rostral y la superficie del cráneo.
   7. Comenzando por el sitio de inyección más ventral a dorsal (Tabla 1), mueve la punta de la micropipeta a cada sitio, bájala hasta tocar la superficie cerebral y pone a cero la posición Z en el marco estereotáctico.
   8. En cada sitio, baja la punta de la micropipeta hacia el cerebro hasta que esté a 0,1 mm ventral respecto al lugar de la inyección. Luego, eleva la punta de la micropipeta 0,1 mm hasta el lugar final de inyección. Deja que el tejido circundante se asiente alrededor de la punta de la micropipeta durante 30 segundos.
   9. Utilizando la interfaz del inyector de nanolitros, inyecta 300 nL de la mezcla 1:1 del virus jRCaMP1b:GcaMP6f a una tasa de 1–2 nL/s para dispersar la mezcla en el sitio de inyección actual.
   10. Deja que la punta de la micropipeta permanezca en el lugar de la inyección al menos 5 minutos tras la finalización de la inyección. Eleva lentamente la punta de la micropipeta fuera del cerebro para reducir el riesgo de propagación dorsal del virus a lo largo de la trayectoria de la inyección.
   11. Después de inyectar la mezcla viral 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f en cada sitio, se utiliza la interfaz de inyección de nanolitros para devolver el émbolo del inyector de nanolitros a su posición original. Retira la micropipeta y deséchala en un contenedor de residuos biohazard sharps.
   12. Si es necesario, repite los pasos 2.9.2–2.9.11 para cada región cerebral dirigida a la expresión de GRAB-DA1m. En cada sitio objetivo, inyecta 150 nL en lugar de los 300 nL usados para la mezcla viral.
10. Implanta la matriz multifibra.
    1. Fija la matriz multifibra al marco estereotáctico usando cualquier accesorio que pueda sujetar la matriz multifibra por los pines de la varilla para mantenerla estable durante la implantación (Figura 2I).
    2. Ajusta la posición de la matriz multifibra de modo que cada fibra se alinee con el centro de su respectiva craneotomía y con la fibra más larga descansando en la superficie cerebral. Poner a cero el manipulador estereotáctico en esta ubicación y bajar lentamente la matriz multifibra hasta que esté 0,25 mm por encima de la posición D/V de la inyección virus más profunda (Tabla 1, Figura 2J).
    3. Coloca un recipiente frío sobre hielo y añade 1 cucharada de polvo de cemento, 4 gotas de base líquida y 1 gota de catalizador. Mezcla durante 20 s.
       NOTA: Repita este paso siempre que se utilice cemento líquido y se requiera más.
    4. Utiliza una jeringuilla y una aguja de 23–31 g para transferir cemento líquido en el espacio entre la matriz multifibra y el cráneo.
    5. Aplica cemento líquido usando un aplicador plástico fino o una aguja de jeringuilla para cubrir completamente los cuatro lados de la matriz multifibra, formando una forma piramidal a partir del cráneo (Figura 2K). Deja que el cemento se seque al menos 15 minutos.
    6. Sutura la piel a lo largo de la incisión para asegurarte de que no quede expuesto el cráneo.
11. Permite que el ratón se recupere.
    1. Reduce la concentración de isoflurano a 0.
    2. Transfiere el ratón del marco estereotáxico a una almohadilla térmica y espera a que el ratón esté alerta y ambulante antes de devolverlo a su jaula.
    3. Deja que el ratón se recupere al menos dos semanas antes de comenzar los experimentos.

3. Imagen de calcio multisitio y bicolor (Figura 1C)

1. Configurar el Dispositivo de Adquisición de Datos (DAQ).
   1. Conecta el GND al puerto AGND por encima del puerto Ch7 usando cable eléctrico.
   2. Conecta el DIO0 al puerto Ch0 usando cable eléctrico.
2. Conecta el sistema de fotometría al DAQ.
   1. Conecta el extremo del conector Baby Neill Constant (BNC) de un cable BNC dividido (conector BNC en un extremo, cables eléctricos rojo y negro en el otro) al puerto de entrada del sistema de fotometría. Conecta el extremo del conector BNC de otro cable BNC dividido al puerto de salida del sistema de fotometría.
   2. Toma el cable BNC dividido conectado al puerto de entrada del sistema de fotometría y conecta su extremo rojo al puerto DIO1 del DAQ. Toma el cable BNC dividido conectado al puerto de salida del sistema de fotometría y conecta su extremo rojo al puerto Ch1 del DAQ.
   3. Conecta los cables de tierra negros de ambos cables BNC divididos al puerto DAQ GND.
3. Sincroniza las cámaras de comportamiento y fotometría.
   1. Encadena varias cámaras de comportamiento para grabar simultáneamente el comportamiento desde múltiples ángulos.
      1. Conecta la salida opto-aislada (pin 4, cable blanco) de la cámara de comportamiento primaria a la entrada no aislada de la cámara secundaria (pin 1, cable verde) con una resistencia de 3,3 KΩ. Conecta la salida de 3,3 V de la cámara principal (pin 3, cable rojo) a la misma resistencia de 3,3 KΩ y al Ch2 del DAQ.
      2. Conecta la salida opto-aislada de cada cámara secundaria a su salida de 3,3 V usando una resistencia de 3,3 KΩ.
      3. Conecta la tierra de la cámara principal (pin 6, cable marrón) a la tierra de cada cámara secundaria. Conecta todos los cables de tierra de la cámara al puerto DAQ AGND por encima del puerto Ch2 y a la toma de tierra de salida del sistema de fotometría.
4. Configura la configuración de la cámara de comportamiento usando el software de imagen asociado.
   1. Ajusta la "Tasa de Fotogramas de Adquisición" a 45 Hz y la ganancia a 1.
   2. Establece el tiempo de exposición a 2998 μs, el límite inferior a 100 μs y el límite superior a 150000 μs.
      NOTA: "Tasa de fotogramas de adquisición" puede no ser la tasa real que se capturará. Dependiendo del tiempo de exposición y del ancho de banda de datos solicitado, este valor puede necesitar fijarse por encima de la frecuencia final de imagen. Si es necesario, ajusta la "Tasa de Fotogramas de Adquisición" de modo que la "Tasa de Fotogramas Resultante" mostrada sea de 40 Hz.
5. Configurar el software DAQ (Archivo Suplementario 7).
   1. En el software DAQ, añade el DAQ como 'Dispositivo' y cambia al 'Panel de configuración'.
   2. En la pestaña 'Canales', bajo 'Entrada analógica', activa los canales 0–2. En 'Digital', activa el canal 0.
      NOTA: Ch0 corresponde a la señal de lógica transitor-transitor (TTL), Ch1 al sistema de fotometría y Ch2 a las cámaras en cadena.
   3. Bajo 'Entrada analógica', nombre canal 0 "TTL", canal 1 "Photometry_system" y canal 2 "Behavior_cameras", que significa "Lógica Transitor-Transistor". Bajo 'Digital', nombre canal 0 "TTL_trigger".
   4. En la pestaña 'Triggers', configura los gatillos en manual. En la pestaña 'Tasas de muestreo', establece la frecuencia de muestreo a 350 Hz.
   5. Cambia al 'Panel de Pantalla' y pon las ventanas 'Strip', 'Scalar' y 'Output' en la interfaz gráfica de usuario.
6. Configurar el software del sistema de fotometría (Archivo Suplementario 8).
   1. Desarrollar un flujo de trabajo en el software de codificación visual para aceptar un pulso TTL de 5 V que active las grabaciones y guarde la marca temporal de cada fotograma, las emisiones de fluorescencia para los canales rojo y verde de cada fibra, y el vídeo en bruto, tal y como se indica en el manual del sistema de fotometría.
   2. Utilizando el nodo para el sistema de fotometría en el flujo de trabajo, asegúrate de que el sistema esté configurado para grabar fotogramas alternos de LED de 560, 470 y 415 nm a 120 Hz para una tasa de fotogramas funcional de 40 Hz.
      NOTA: Este enfoque de multiplexación por división temporal (TDM) aborda la superposición espectral entre GCaMP y RCaMP separando temporalmente su excitación, asegurando que cada indicador se excite de forma independiente a través de tramas consecutivas. El sistema de registro empleado aquí utiliza filtros de emisión pasa-banda optimizados (canal verde: 500–530 nm; canal rojo: >580 nm paso largo) que minimizan aún más la diafonía espectral restringiendo los fotones detectados a longitudes de onda predominantemente emitidas por cada indicador. La longitud de onda isosbética de 415 nm excita tanto GCaMP como RCaMP por igual, pero produce cambios de fluorescencia dependientes del calcio mínimos, proporcionando una señal de control de artefactos de movimiento. En conjunto, la excitación TDM y el filtrado espectral aseguran que los tramas de 470 nm capturen predominantemente la actividad de GCaMP (Figura 3A), las de 560 nm capturen predominantemente la actividad RCaMP (Figura 3B), y las de 415 nm proporcionen señales de referencia independientes del calcio para la corrección del movimiento.
7. Realiza grabaciones de fotometría in vivo .
   1. Compra ratones que hayan sido sometidos a inyecciones virales e implantación de matriz multifibra según se detalla en el Paso 2.
   2. Limpia las superficies de conexión del cable de parche y de la matriz multifibra implantada con etanol y un hisopo de algodón. Utilizando el nodo para el sistema de fotometría en el flujo de trabajo de codificación visual y un fotómetro, se configuró cada uno de los niveles de potencia LED 415, 470 y 560 para que emitieran aproximadamente 1,2 mW de iluminación desde el parcheo.
   3. Aplica gel de ajuste de índice en la superficie de conexión del parcheo. Alinea el parche con la matriz multifibra implantada del ratón con los pasadores de la matriz y desliza el parche hacia abajo hasta que quede a ras con la superficie de la matriz multifibra implantada.
   4. Aprieta los tornillos del cable para asegurar la matriz multifibra dentro del parcheo. Dejemos que el ratón se habitue antes de comenzar los experimentos (Figura 2L–M).
   5. Establece nombres de archivos.
      1. Para cada cámara de comportamiento, pulsa el botón círculo rojo 'grabar' para abrir su ventana de grabación en el software de grabación de cámara de comportamiento y especifica su nombre de archivo.
      2. Abre el programa DAQ, haz clic en el botón de engranaje y ve a 'opciones de registro', y especifica el nombre del archivo.
      3. Haz clic en el nodo 'PhotometryWriter' del flujo de trabajo de codificación visual del sistema de fotometría para especificar el nombre del archivo.
   6. En las ventanas de grabación del software de la cámara de comportamiento, haz clic en 'iniciar grabación' para cada cámara. A continuación, pulsa el botón de reproducir en el flujo de trabajo de codificación visual del sistema de fotometría y pulsa grabar en el software DAQ.
   7. Haz clic en el interruptor TTL para comenzar a grabar de forma sincrónica entre todas las cámaras.
   8. Fin de la grabación.
      1. Haz clic en el interruptor TTL para terminar las grabaciones de cámara síncronas
      2. Pulsa el botón de parada en el flujo de trabajo de codificación visual del sistema de fotometría, "detener la grabación" en las ventanas de grabación del software de la cámara de comportamiento.
   9. Repite los pasos 3.7.5–3.7.8 hasta el final de los experimentos y desconecta el ratón.
      NOTA: Tras los experimentos, los flujos de datos de fotometría y comportamiento de la cámara pueden alinearse con código personalizado usando la salida del software DAQ. Específicamente, (1) el cambio en el voltaje TTL indica el momento de inicio y desplazamiento TTL, (2) los cambios en el voltaje de comportamiento de la cámara indican cuándo se abre y cierra el obturador de la cámara para capturar cada fotograma de vídeo de comportamiento, y (3) el cambio inicial en el voltaje del sistema de fotometría registrado en el DAQ puede compararse con el tiempo de inicio TTL y las marcas de tiempo de la cámara de fotometría que emite el software de codificación visual para determinar las marcas de tiempo de la cámara de fotometría.

4. Procesamiento de datos (Figura 1D, Archivo Suplementario 9)

1. Preprocesar datos de imagen de calcio.
   1. Desentrelazado de tramas de datos de imagen de calcio para crear flujos separados de señal registrados en respuesta a LEDs de 415 nm, 470 nm y 560 nm.
   2. Utiliza el algoritmo de mínimos cuadrados penalizados adaptativos iterativamente reponderados (airPLS)⁴⁴ para corregir la deriva base.
   3. Calcular ΔF/F usando:
      
      NOTA: El periodo de referencia debe ser una época estable antes de la manipulación experimental (por ejemplo, antes de introducir una pareja social). Si el periodo base es demasiado corto (<2–3 minutos) o presenta grandes fluctuaciones que pueden estar contaminadas por artefactos de movimiento, considera normalizar usando la fluorescencia media durante toda la sesión en lugar de un periodo base restringido.
2. Correcto para artefactos de movimiento (Figura 4A).
   1. Utilizar un enfoque basado en regresión, aunque los métodos alternativos son adecuados (véase la Tabla 2)
   2. Señales Z-score ΔF/F usando la mediana para normalizar la magnitud de la señal entre regiones:
      
   3. Aplica regresión de lazo con regularización L1. El lazo (Operador de Menor Contracción Absoluta y Selección) realiza la selección automática de características reduciendo los coeficientes de predictores no informativos hacia cero.
      1. Realizar búsqueda en cuadrícula entre parámetros de regularización (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). La búsqueda en cuadrícula identifica el equilibrio óptimo entre la complejidad del modelo y el sobreajuste. Este paso puede automatizarse completamente utilizando rutinas de validación cruzada disponibles en bibliotecas estándar de aprendizaje automático (por ejemplo, scikit-learn en Python).
      2. Para la fotometría de doble color (nuestro enfoque recomendado), se utilizan todos los canales de control isosmítico disponibles de 415 nm en las 12 regiones de grabación como predictores (véase la Figura 4B–C y Resultados para la justificación). Para fotometría monocolor (GCaMP solo o RCaMP solo), restringe la matriz predictora solo a la señal isosmósica de la misma fibra que la señal de calcio que se está corregiendo.
      3. Selecciona el modelo que minimice el error cuadrático medio entre la señal predicha y la observada.
   4. Se resta el componente de movimiento previsto de la señal para obtener la actividad corregida.
3. Suaviza la señal usando un filtro Savitzky-Golay con una ventana de 725 ms.

Resultados

Para grabar simultáneamente desde hasta 12 regiones cerebrales de SBN, construimos una matriz multifibra personalizable siguiendo el protocolo anterior. Tras la recuperación de la cirugía, los ratones fueron registrados durante la interacción social (Figura 5). En todos los experimentos, se permitió que los ratones machos CD1 interactuaran con ratones Balb/c machos en su jaula de origen. Utilizamos ratones Vgat-Cre para expresar jRCaMP1b⁴⁰ en neuronas GABAérgicas de manera dependiente de Cre en 11 regiones cerebrales de SBN, GCaMP6f³⁹ en células no GABAérgicas de manera excluyente^{de Cre 45} en las mismas regiones cerebrales, y GRAB-DA1m³³ en el núcleo^{accumbens 42} (Tabla 1). La confirmación histológica de la segmentación de fibras puede encontrarse en nuestras publicaciones anteriores^42,43. Aquí, buscamos probar el rendimiento de diferentes métodos para la corrección de artefactos de movimiento. Específicamente, comparamos la eficacia de usar: (1) un filtro mediano solo; (2) Regresión de lazo con regularización L1 usando únicamente señales isosmísicas de la misma fibra (enfoque de predictor único)¹¹ y (3) Regresión de lazo usando señales isosmísicas de todas las fibras como predictores (enfoque multipredictor)^41,42 (Figura 4A). De manera crítica, los métodos basados en lazo corrigen la señal en bruto usando la señal fluorescente independiente de la actividad generada en respuesta al LED de frecuencia isosmósica (415 nm), mientras que el suavizado del filtro mediano no considera la señal independiente de la actividad.

Evaluamos la corrección de movimiento utilizando dos medidas diferentes: ruido absoluto de alta frecuencia y jitter. El ruido de alta frecuencia se definió como la desviación estándar de la primera derivada de la señal, que refleja la magnitud de las rápidas fluctuaciones de la señal. El jitter se definió como el coeficiente de variación de la derivada de la señal, que refleja la magnitud de la variabilidad de la señal de trama a trama respecto a la media de la derivada de la señal. Descubrimos que ambos enfoques basados en Lazo (predictor único y multipredictor) superaron sustancialmente al filtro mediano en términos de reducción tanto del ruido de alta frecuencia como del jitter, con la corrección multipredictor superando ligeramente la corrección de predictor único (Figura 4C–D; Ruido de alta frecuencia, n=414 para 23 señales en 18 sesiones de grabación: prueba de Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001; Pruebas U de Mann-Whitney post-hoc con corrección de Bonferroni: Regresión suavizada vs de un solo sitio ***p < 0,001, Regresión suavizada vs multisitio***p < 0,001, Regresión monositio vs Multi-sitio **p = 0,0073; Jitter: Test de Kruskal-Wallis, H = 495.6685, p < 0.001; pruebas U de Mann-Whitney post-hoc con corrección de Bonferroni: Regresión suavizada vs de sitio único ***p < 0,001, Regresión suavizada vs multisitio***p < 0,001, Regresión monositio vs multisitio ***p = 0,0006). Específicamente, el enfoque multipredictor (utilizando todas las isosmísticas de fibra) mostró beneficios para las señales de canal rojo (RCaMP): 5 de 12 señales rojas mostraron un ruido residual significativamente menor en comparación con la corrección con predictor único (n = 18 grabaciones/región). Para el jitter, BNST (prueba t, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (prueba t, t = 2,68, *p = 0,011), AH (prueba t, t = 2,66, *p = 0,012) y PAG (prueba U de Mann-Whitney, U = 279, ***p < 0,001) mostraron superioridad en múltiples predictores. Para ruido de alta frecuencia, BNST (prueba U de Mann-Whitney, U = 285, ***p < 0,001), POA (prueba U de Mann-Whitney, U = 292, ***p < 0,001), AH (prueba t, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (prueba t, t = 13,72, ***p < 0,001) y LHb (prueba t, t = 5,47, ***p < 0,001) mostraron superioridad multipredictora. Las señales de canal verde (GCaMP) no mostraron diferencias significativas entre los dos enfoques Lasso en las 12 regiones para métricas de jitter o ruido de alta frecuencia (todas p>0,05, para la lista completa de pruebas estadísticas véase Tabla 3). Esto sugiere que, para la fotometría de doble color, incorporar información isosmética cruzada mejora la corrección de movimiento para señales rojas, probablemente porque las isosmésticas de canal verde proporcionan información de movimiento más limpia. Estos datos demuestran que la corrección de artefactos de movimiento mediante métodos de regresión basados en isosbest supera ampliamente a los enfoques de filtrado simples, siendo la regresión multicanal una ventaja específica para grabaciones de doble color.

Figura 1. Grabación de la Red de Comportamiento Social utilizando fotometría de fibra multisitio y bicolor. (A) Representación esquemática de cómo construir un arreglo multifibra. (B) Representación esquemática del flujo de trabajo quirúrgico. (C) Representación esquemática de experimentos de imagen de calcio a dos colores. (D) Ejemplo de usar una señal isoscómica para calcular una señal corregida por movimiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Imágenes de procedimientos clave para fabricación y cirugía. (A) Cable de parche fabricado listo para grabación. (B) Matriz multifibra colocada en un soporte estereotáctico personalizado con la broca de 0,25 mm x 5,5 mm situada sobre un orificio pasante de fibra. (C) Matriz multifibra con todos los agujeros pasantes de fibra despejados y tuercas hexagonales pegadas. (D) Cortar una fibra usando un grabador de fibra. (E) Matriz multifibra con todas las fibras pegadas con superpegamento y colocadas sobre un disco de pulido personalizado. (F) Vista ampliada de cómo alinear y atornillar el conector del cable de parche a la matriz multifibra. (G) Matriz multifibra completamente construida con clavillas pegadas en su lugar. (H) Ratón fijado a un marco estereotáctico con incisión en el cuero cabelludo hecha para exponer el cráneo. (I) Matriz multifibra fabricada acoplada a un manipulador estereotáctico para maniobrar la matriz multifibra durante la cirugía. (J) Vista ampliada de la matriz multifibra siendo bajada al cerebro. (K) Matriz multifibra completamente bajada y fijada al cráneo con cemento dental. (L) Matriz multifibra en un animal que está conectada de forma segura al parche antes de la grabación. (M) Vista alejada del animal en jaula con cable conectado antes y/o durante la grabación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Separación espectral. Ejemplos de trazas que demuestran una diafonía espectral mínima entre indicadores de calcio. Las señales GCaMP6f (azul) muestran una activación robusta durante la excitación de 470 nm pero una respuesta insignificante a la excitación de 560 nm. Las señales jRCaMP1b (rojas) presentan el patrón inverso con una fuerte activación desde 560 nm pero una respuesta mínima a una iluminación de 470 nm. (A) Simultáneamente grabó señales GCaMP6f y jRCaMP1b con iluminación de 470 nm. (B) Igual que (a), pero solo con iluminación de 560 nm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Comparación de diferentes métodos para el procesamiento de señales multifibra. (A) Esquema que representa la corrección de la señal de fotometría basada en regresión multisitio. Este enfoque implica pasos secuenciales de procesamiento en los que todas las señales isosmísicas disponibles de 415nm se mapean linealmente a cada señal dependiente del calcio. Los componentes del movimiento predicho se restan a esta señal para producir la lectura final de la actividad. señales ΔF/F con puntuación z de dos señales con fuerte presencia de artefactos de movimiento. (B) De arriba hacia abajo: señal isosmódica del mismo canal de fibra/imagen que representa artefactos de movimiento, señal RCaMP solo suavizada (izquierda) o GCaMP (derecha) (filtrada por mediana, verde), misma señal corregida por regresión de fibra/canal de imagen (cian), señal corregida por regresión multifibra (azul). (C) Izquierda: Puntuación media de ruido de alta frecuencia para cada señal grabada (n = 21 sesiones). El ruido de alta frecuencia se calcula como la desviación estándar de la primera derivada de cada señal. Se muestran las puntuaciones de ruido para 1) señal corregida por línea base pero no corregida (gris), 2) señal corregida y filtrada por mediana (rosa), 3) señal corregida por regresión de línea base y de fibra única con suavizado Savitsky-Golay (cian), y 4) señal corregida por regresión basal y multifibra con suavizado Savitsky-Golay (azul). Centro: Porcentaje medio de ruido eliminado usando solo suavizado, regresión de fibra única o multifibra, agregado en las 23 señales. El porcentaje de ruido eliminado se calcula como la fracción de ruido de alta frecuencia resultante de la corrección respecto al nivel general de ruido en la señal bruta corregida por línea base. Los datos se informan como media ± SEM (prueba de Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001; pruebas post-hoc de Mann-Whitney U con corrección de Bonferroni: Regresión suavizada vs de un solo sitio ***p < 0,001, Regresión suavizada vs multisitio***p < 0,001, Regresión monositio vs multisitio **p = 0,0073). Derecha: porcentaje de señales en las que el ruido de alta frecuencia es estadísticamente diferente tras una corrección basada en regresión de una sola fibra frente a multifibra, separadas por tipo de señal. Para cada una de las 23 señales, los niveles de ruido tras la corrección en un solo sitio se compararon con los niveles de ruido tras la corrección multi-sitio utilizando pruebas t independientes (si se distribuyen normalmente) o pruebas Mann-Whitney U (alternativa no paramétrica). Los segmentos azules indican señales donde la corrección multisitio resultó en un ruido significativamente menor que la corrección en un solo sitio (p < 0,05). Los segmentos grises indican señales sin diferencias significativas entre los métodos de corrección. Los segmentos cian indican señales donde la corrección en un solo sitio resultó en un ruido significativamente menor. E: Vgat- GCaMP6f. DA: AGARRA-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) Igual que (C) pero representando la variabilidad de cuadro a cuadro (jitter), calculada como la derivada del coeficiente de variación de cada señal (prueba de Kruskal-Wallis, H = 495,6685, p < 0,001; pruebas Mann-Whitney U post-hoc con corrección de Bonferroni: Regresión suavizada vs de un solo sitio ***p < 0,001, Regresión suavizada vs multisitio***p < 0,001, Un solo sitio vs multisitio ***p = 0,0006). Para la lista completa de pruebas estadísticas y resultados, consulte la Tabla 3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5. Exposición multisitio de fotometría de fibra a doble color. Señales representativas de varios tipos de indicadores registradas simultáneamente durante el comportamiento social (prueba de residente-intruso, época de entrada del intruso). Las trazas muestran GCaMP6f no normalizada y restada de la línea basal pero no corregida por artefactos de movimiento (neuronas Cre-negativas), jRCaMP1b (neuronas GABAérgicas Vgat-Cre+) y GRAB-DA1m (sensor de dopamina en núcleo accumbens) en los sitios de la red de comportamiento social en el mismo animal. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tabla 1. Coordenadas del virus y longitudes de fibra para cada región cerebral de la Red de Comportamiento Social Objetivo. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2. Comparación de métodos de corrección de artefactos de movimiento para fotometría de fibra multisitio. Principios subyacentes, casos de uso óptimos, ventajas y limitaciones de los siguientes métodos de corrección de artefactos de movimiento: regresión lineal simple, regresión Lasso con regularización L1 (usando enfoque multipredictor), modelado generativo bayesiano, escalado basado en frecuencia y mínimos cuadrados reponderados iterativamente. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3. Detalles y resultados de las pruebas estadísticas utilizadas en la Figura 4. Por favor, haz clic aquí para descargar esta tabla.

Expediente suplementario 1. Archivo de impresión 3D para conector de patchcable.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2. 3D archivo de impresión para conector de cable de parche sin agujeros pasantes.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 3. 3D archivo de impresión para accesorio de perforación estereotáxica.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 4. Plano personalizado del puck de pulido.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 5. 3D archivo de impresión para matriz de fotometría multisitio dirigida a 12 sitios SBN.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 6. 3D archivo de impresión para matriz de fotometría multisitio sin atravesar los sitios dirigidos.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 7. Archivo de configuración DAQ para software DAQ.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 8. Archivo de codificación visual para el sistema de fotometría.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Expediente suplementario 9. Código en Python usado en el Protocolo Step 4 y para comparaciones corregidas de artefactos de movimiento. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La fotometría de fibras es una técnica útil y rentable para registrar la actividad de calcio poblacional de regiones cerebrales profundas o tipos celulares específicos en el animal en movimiento^{libre 3}. Registrar simultáneamente desde múltiples regiones cerebrales permite al usuario comparar la dinámica entre regiones o proyecciones durante comportamientos naturalistas o preparaciones fijas con la^{cabeza 5,7,12}. Aquí detallamos métodos para grabar en dos colores desde hasta 12 regiones cerebrales a través de la "red social de comportamiento" subcortical del cerebro utilizando una matriz de fibra personalizada y un sistema de cámaras comercialmente disponible. A continuación, analizamos los pasos críticos para implementar este método, posibles modificaciones y estrategias de solución de problemas, así como su importancia y limitaciones en relación con los enfoques existentes.

El protocolo consta de tres fases principales. En primer lugar, la fabricación de matrices multifibra y cables de parche requiere taladrar piezas impresas en 3D personalizadas en coordenadas estereotácticas, seguidas de inserción, pulido y control de calidad de fibra para asegurar una eficiencia de transmisión de luz del ≥75%. La alineación precisa del taladro (tolerancia de ±0,03 mm) y un pulido exhaustivo son fundamentales. Las fallas más comunes incluyen baja eficiencia de transmisión de luz (<75%) y agujeros de fibra bloqueados. La baja eficiencia suele deberse a imperfecciones en las fibras durante el corte o a un pulido incorrecto. Las soluciones incluyen verificar que cada extremo de fibra esté intacto bajo microscopía de campo claro antes de la inserción (paso 1.1.6.2), volver a pulir usando la progresión completa de grano (6 μm → 0,01 μm, paso 1.1.6.1) y asegurar que la hoja del cuchillo de fibra esté afilada. Para mejorar el rendimiento, los laboratorios pueden implementar modificaciones en el flujo de trabajo, como plantillas personalizadas de corte de fibra utilizando etapas de traducción de precisión o sistemas de corte basados en láser (paso 1.2.4). Los fabricantes comerciales de impresión 3D con sistemas de alta precisión pueden reducir la necesidad de taladrado manual (pasos 1.1.3–1.1.4, paso 1.2.3), aunque la precisión dimensional puede variar entre lotes.

En segundo lugar, la implantación quirúrgica implica nivelación del cráneo (tolerancia de ±0,03 mm), inyecciones virales en 11–12 sitios y implantación de matriz multifibra seguida de fijación con cemento. La precisión del puntería se ve comprometida cuando el nivelado del cráneo supera la tolerancia. Esto puede mitigarse midiendo el tono en varios puntos anteroposteriores separados por 8,25 mm y midiendo el balanceo en posiciones laterales de ±2,0–2,5 mm, asegurando que las barras auriculares estabilicen completamente el cráneo. Las burbujas de aire en las micropipetas de inyección de virus impiden una entrega precisa y requieren reiniciar la preparación de la micropipeta (paso 2.9). Durante la implantación de matriz multifibra, evitar el contacto del cemento con las puntas de las fibras construyendo pirámides de cemento desde la superficie del cráneo hacia arriba (pasos 2.10.3–2.10.5) y permitir un tiempo de secado adecuado (≥15 min).

En tercer lugar, la grabación y el procesamiento de datos implican la sincronización de la cámara mediante un sistema DAQ, la calibración de potencia de LED (0,1 mW de salida/fibra, 1,2 mW de salida/12 fibras) y el preprocesamiento de señales con controles isosmésticos. La cadena de corrección de movimiento introducida aquí utiliza regresión Lazo, que es muy adecuada para configuraciones predictoras multicanal porque reduce automáticamente los predictores poco informativos hacia cero, reteniendo solo aquellos que contribuyen de forma significativa a la corrección de artefactos. Esta propiedad lo hace especialmente ventajoso para la fotometría de doble color: al incluir señales isosmáticas de ambos canales rojo y verde como predictores, Lasso aprovecha selectivamente los canales que contienen información genuina de movimiento, lo que produce una reducción sustancialmente mejor del ruido en señales de canal rojo (RCaMP) en comparación con la corrección de la misma fibra (Figura 4C–D). Como Lasso identifica automáticamente los predictores más informativos, se recomienda encarecidamente usar todos los canales isosmíticos disponibles como entrada. Dicho esto, la regresión Lasso es uno de varios métodos de corrección válidos; las alternativas incluyen la modelización generativa^{bayesiana 46}, la escala basada en frecuencia⁴⁷ y los mínimos cuadrados reponderados iterativamente (IRLS⁾⁴⁸, todos los cuales probablemente producen una reducción comparable de artefactos, con la guía de implementación proporcionada en la Tabla 2. Una calidad persistente de señal pobre a pesar de un preprocesamiento optimizado probablemente indica problemas de hardware o quirúrgicos, y los pasos 1–2 deberían revisarse

Más allá de estas consideraciones procedimentales, la fotometría de doble color introduce desafíos técnicos adicionales relacionados con la separación espectral. Una consideración crítica en la fotometría bicolor es gestionar la superposición espectral entre indicadores de calcio verde y rojo. Aunque la eliminación completa de la diafonía espectral es un reto debido a la superposición de espectros de emisión de GCaMP y RCaMP, nuestro enfoque de multiplexación temporal con excitación LED entrelazada (470 nm para GCaMP, 560 nm para RCaMP, 415 nm isosmódica) y filtros de emisión paso de banda optimizados mitiga sustancialmente este problema. En la práctica, observamos una diafonía mínima: la estimulación de 470 nm provoca una actividad insignificante en el canal rojo, y viceversa para la estimulación de 560 nm en el canal verde (Figura 3). Los investigadores preocupados por la superposición espectral residual pueden optimizar aún más sus sistemas seleccionando filtros de emisión de paso de banda estrecha con máxima separación espectral basada en sus combinaciones específicas de indicadores.

En comparación con otros enfoques para registros neuronales a gran escala, la fotometría de fibra multisitio a dos colores a medida ofrece muchas ventajas significativas. En primer lugar, mientras que la fotometría^{de fibra única 1,2,3}, los registros extracelulares contemporáneos ^4,6 o los enfoques de imagen cortical^{de la superficie 8,9} están restringidos a una sola o a un conjunto espacialmente restringido de regiones cerebrales (por ejemplo, en la superficie cortical), el diseño personalizable de impresión 3D que compartimos aquí permite dirigir hasta 12 regiones cerebrales en cualquier parte del cerebro con fibras ópticas de 200 μm. En comparación, los herrolos multifibra comerciales ^5,7 solo soportan fibra óptica de 100 μm y están igualmente restringidos a un conjunto limitado de regiones cerebrales directamente ventrales a la matriz lineal de la férula. En cuanto a la orientación y el registro desde regiones cerebrales específicas, el principal equilibrio es entre el diámetro de la fibra y el campo de visión del sistema fotométrico. Las matrices multifibra impresas en 3D equipadas con fibras de 200 μm graban desde un área mayor en cada lugar en comparación con las herrolas multifibra disponibles comercialmente. En el protocolo actual, el campo de visión de la cámara del sistema de fotometría limita la grabación a 12 fibras ópticas a 200 μm. Esta limitación puede superarse reduciendo el diámetro de la fibra a 100 μm para hasta 60 fibras o construyendo un sistema de fotometría personalizado con un objetivo de cámara más grande.

Finalmente, esta plataforma personalizable de fotometría de fibra multisitio de dos colores se ha utilizado para rastrear longitudinalmente la dinámica de la actividad neuronal de dos poblaciones neuronales genéticamente distintas en 11-12 regiones cerebrales. Utilizando una estrategia de exclusión Cre-in/Cre que expresa RCaMP dependiente de Cre y GCaMP excluyente de Cre en poblaciones de SBN en un ratón Vgat-cre, tanto la experiencia agresiva como la observación demostraron patrones compartidos de dinámicas de actividad a nivel de SBN durante futuras interacciones sociales^{defensivas 42}. Utilizando la misma estrategia viral en un ratón Esr1-cre para registrar neuronas que expresan y no expresan receptores alfa de estrógeno, se asociaron patrones de comportamiento social específicos por territorio con un reescalado rápido y sensible a las hormonas de un código de acción social a nivel SBN, aumentando la actividad asociada al comportamiento en el territorio^{de origen 43}. Estas diferencias específicas de territorio en comportamiento y codificación de redes requieren testosterona circulante en ratones machos. Aunque estos estudios utilizaron un enfoque viral y una única línea de Cre, futuros estudios pueden ampliar estos métodos con enfoques virales interseccionales, indicadores de calcio expresados genéticamente o reporteros fluorescentes de señalización neuromoduladora y neuropeptídica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Broca #76	Ciudad de la Broca	#76
Broca #78	Ciudad de la Broca	#78
Broca #92	Ciudad de la Broca	#92
0,01 & mu; Láminas de pulido de grano M	ThorLabs	LFCF2
Brocas de 0,25 mm x 5,5 mm	Ciudad de la Broca	Producto personalizado	Broca de 0,25 x 5,5 mm, contacté con la empresa para construir
1 & mu; Láminas de pulido de grano M	ThorLabs	LF1D
12 patchord ramificado de fibra	Lente dórica	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu; Fibra óptica m	ThorLabs	FT200UMT
3 & mu; Láminas de pulido de grano M	ThorLabs	LF3D
30 & mu; Láminas de pulido de grano M	ThorLabs	LF30D
6 & mu; Láminas de pulido de grano M	ThorLabs	LF6D
Sutura absorbible	Ethicon	J421H
Documentación de mínimos cuadrados penalizados adaptativos reponderados iterativamente	Google	N/A	https://code.google.com/archive/p/airpls/
Clavijas de acero aleado	McMaster-Carr	98381a983
Cámaras de comportamiento	Teledyne FLIR	Blackfly S
Bonsái	Fundación de Software Bonsai	Versión 2.9.0
Microscopio de campo brillante	Leica	ES2
Abrazaderas bulldog	FineScienceTools	18038-45
DAQ	Computación de Medición	DAQ serie USB-200 MC
Software DAQ	Computación de Medición	DAQami
Drill	Kopf Instruments	Modelo 1911 Stereotaxic Drill
Cuchillo de fibra	ThorLabs	XL411/CLVB
Sistema de fotometría de fibra	Neurofotometría	FP3002
Manual del sistema de fotometría de fibra	Neurofotometría	N/A	Manual del dispositivo de alojamiento de páginas web: https://neurophotometrics.com/documentation
Grabadora de fibra	ThorLabs	S90C
Decapador de fibra	ThorLabs	T10S13
Pinzas finas	FineScienceTools	11252-00
Tijeras finas	FineScienceTools	14084-08
Tornillos de transmisión G5	Sitio de Producción Open Ephys	OEPS-7105
Destornillador G5	Sitio de Producción Open Ephys	OEPS-7121
GCaMP6f	Laboratorio de Neuroingeniería Viral PNI	EF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Almohadilla térmica	Suministros médicos hábiles	HTP-1500
Sistema de calefacción	Kent Scientific	RT-0515
Isoflurano	Covetrus	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
Tuercas hexagonales de latón M0.6	MetricScrews.us	21614
Reactivos y herramientas de cemento metabond	Parkell	S380
Impresiones 3D de resina tipo ABS MicroFine	ProtoLabs	Producto personalizado	Ver Archivos de Código Suplementario 1-3, 5, 6
Inyector de nanolitros	Drummond Scientific Company	Nanoject II	Inyector de nanolitros
Láminas de cera Parrafin	Amcor	Película de laboratorio multiusos ParaFilm M
Pipetter	ThermoFisher Scientific	4641310N
Puck de pulido	Taller de Máquinas del Departamento de Física de la Universidad de Princeton	Producto personalizado	Véase Archivo de Códigos Suplementarios 4
Potómetro	ThorLabs	PM100D
Ungüento óptico Puralube	Dechra	P1490-1
Python	Fundación de Software Python	N/A
Tubo de plástico blando para parche	McMaster-Carr	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	Versión 1.25.0.52	Software de imagen que controla las cámaras de comportamiento
Marco estereotáctico	Kopf Instruments	Modelo 1900
Documentación de TMAC	N/A	N/A	Código TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Tubería para armazón estereotáctico	Saint-Gobain	E-3603
Vaporizador	Kent Scientific	Vaporizador VetFlo