Este protocolo describe un método de extracción ácido-disolvente en dos fases para aislar ácidos grasos de cadena corta a partir de muestras fecales de ratón de baja entrada sin derivación.
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Artículo de método
Extracción de ácidos grasos de cadena corta de heces de ratón usando un método ácido-disolvente bifásico
En este artículo
Resumen
Resumen
Este artículo describe un protocolo para extraer ácidos grasos de cadena corta (SCFA) de muestras fecales de ratón de baja entrada utilizando una estrategia de extracción ácido-disolvente en dos fases. El método está diseñado para entradas fecales individuales de aproximadamente 20–50 mg y emplea ácido clorhídrico diluido y acetato de etilo para permitir la separación de fases sin derivatización. El protocolo consiste en homogeneización fecal, acidificación, partición de disolventes orgánicos y centrifugación a baja temperatura, y puede realizarse utilizando equipos estándar de laboratorio comúnmente disponibles en laboratorios de investigación. Tras la extracción, los SCFA son adecuados para el análisis posterior mediante plataformas basadas en cromatografía de gases rutinaria. La ejecución exitosa del protocolo se indica por la detección de picos de SCFA claramente resueltos en tiempos característicos de retención por encima del ruido de fondo, como se demuestra en los principales SCFA fecales como acetato, propionato y butirato de muestras individuales de ratón. Este protocolo aborda un desafío procedimental común en estudios con animales pequeños al proporcionar un flujo de trabajo estandarizado para la extracción de SCFA fecal a partir de material de muestra limitado, manteniendo la compatibilidad con los flujos de trabajo analíticos rutinarios.
Introducción
Este protocolo se desarrolló para permitir la extracción de ácidos grasos de cadena corta (SCFAs) de muestras heces de ratón de baja entrada en un formato compatible con el análisis rutinario basado en cromatografía de gases (GC). Los SCFAs son ácidos grasos orgánicos volátiles con menos de seis átomos de carbono, incluyendo principalmente el ácido acético, el ácido propiónico y el ácido butírico, que son producidos por la microbiota intestinal mediante la fermentación de fibras dietéticas nodigeribles. Cuantificar estos metabolitos de ratones individuales es frecuentemente necesario en estudios con pequeños animales donde el material fecal es limitado, y las muestras están vinculadas a fenotipos conductuales, metabólicos o fisiológicos 2,3,4,5,6. Por tanto, es necesario un flujo de trabajo práctico y de baja entrada para apoyar diseños experimentales que dependan de mediciones SCFA por animal.
Los enfoques existentes para el análisis SCFA fecal presentan varias restricciones metodológicas. Cuantificar los SCFAs en muestras fecales sigue siendo analíticamente complicado debido a su volatilidad, baja abundancia y complejidad de las matricesbiológicas. Los flujos de trabajo estándar suelen requerir pasos de derivatización, grandes volúmenes de muestras y equipos especializados como manipulación automatizada de líquidos, plataformas de homogeneización especializadas o columnas de extracción en fasesólida 8, 9, 10, 11. Estos requisitos pueden limitar la accesibilidad y la escalabilidad, especialmente en estudios con ratones donde la producción fecal por animal es mínima y el muestreo longitudinal o específico de genotipo escomún 12,13,14. Como resultado, sigue existiendo una laguna metodológica para protocolos que permiten la extracción de SCFA de pequeñas insumos fecales sin derivación, manteniendo la compatibilidad con los flujos de trabajo estándar de cromatografía de gases.
El protocolo descrito aquí aborda esta brecha empleando una estrategia de extracción ácido-disolvente en dos fases utilizando ácido clorhídrico diluido y acetato de etilo. El flujo de trabajo consiste en homogeneización fecal, acidificación, partición de disolventes orgánicos y centrifugación a baja temperatura, y está diseñado para operar con pequeñas masas de entrada fecal. A diferencia de los flujos de trabajo basados en derivatización, que requieren pasos adicionales de modificación química o plataformas especializadas de preparación de muestras, este protocolo permite la extracción directa de SCFA en un formato compatible con el análisis rutinario basado en GC utilizando equipo estándarde laboratorio 2.
Este método está destinado a estudios que requieren la extracción de SCFA de cantidades limitadas de material fecal de ratón, especialmente cuando se necesitan mediciones individuales o cuando la disponibilidad de muestras limita el diseño experimental. Es adecuado para el análisis basado en GC de SCFAs comunes (C2–C6) en muestras fecales, pero no está diseñado para aplicaciones que requieran detección dependiente de la derivatización, cuantificación ultra-traza más allá de la sensibilidad a GC o evaluación de concentraciones sistémicas de SCFA.
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Protocolo
El Comité Permanente de Animales en Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, EE. UU., aprobó el protocolo animal anterior, diseñado para minimizar el número de animales utilizados. Este protocolo cumple con las directrices y regulaciones de los Institutos Nacionales de Salud. Este manuscrito fue elaborado según las directrices de ARRIVE. El diagrama de protocolos se muestra en la Figura 1, y los materiales requeridos se enumeran en la Tabla de Materiales.
Figura 1: Diagrama del protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
1. Recogida y preparación de muestras fecales
- Recoge muestras de heces frescas (~30 mg) en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mL. Registrar la masa fecal exacta de entrada para cada muestra para permitir una normalización precisa de las concentraciones de SCFA.
NOTA: Asegúrese de que la extracción incluya viales, guantes y pinzas limpios para cada muestra. Toda la cristalería e instrumentos deben ser autoclavados antes de su uso. Este protocolo ha sido validado para masas de entrada fecal de aproximadamente 20–50 mg por muestra, con ~30 mg como entrada representativa. Los volúmenes de extracción se mantienen constantes dentro de este rango. - Coloca y etiqueta el número necesario de viales de centrífuga correspondientes a las muestras.
- Preparar ácido clorhídrico diluido (0,5 M; pH 1–2) añadiendo lentamente HCl concentrado (12 M, grado de reactivo ACS) a agua ultrapura.
PRECAUCIÓN: HCl es corrosivo; Puede causar quemaduras graves en la piel, los ojos y las vías respiratorias. Peligroso de inhalar. - Descongelar muestras a temperatura ambiente durante 30–45 minutos, o hasta que se descongele completamente.
2. Homogeneización y acidificación de muestras
- Añadir 255 μL de la solución de 0,5 M HCl a cada vial de la centrífuga.
- Coge un vial nuevo y llénalo con etanol al 70% para limpiar pinzas. Limpia las pinzas mojándolas en el etanol y luego secándolas en una toalla de papel limpia.
PRECAUCIÓN: El etanol es inflamable y puede irritar la piel y los ojos; La inhalación de vapores puede causar mareos. - Prepara un baño de etanol para los morteros colocándolos en un recipiente y llenándolo con un 70% de etanol hasta que todos los morteros queden completamente sumergidos.
- Recupera la muestra correcta de la caja de muestras. Quita la tapa del vial y saca una muestra (~ 30 mg) de heces.
- Coloca las muestras fecales en los viales de la centrífuga correspondientes.
- Una vez que todas las muestras estén colocadas en los viales de centrifugadora correctos, retira un mortero del baño de etanol. Seca el mano con una toalla de papel limpia.
NOTA: Usa un mano de mano nuevo para cada muestra. - Utiliza los morteros para triturar y disolver correctamente las muestras de heces, véase la Figura 2. Tritura la muestra fecal hasta obtener una suspensión visualmente homogénea, sin fragmentos sólidos visibles.
Figura 2: Trituración de muestras fecales con un manodero. Las heces recién recogidas se molen para lograr una consistencia uniforme en el análisis SCFA. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
- Coloca los morteros usados en una caja vacía para lavarlos después.
- Haz vórtices de las muestras usando un mezclador de vórtice tipo pulso a velocidad máxima durante 10 s, con los tubos bien tapados.
NOTA: Asegúrese de que los viales de la centrífuga estén bien cubiertos para evitar que la mezcla se derrame.
3. Extracción y separación de fases SCFA
- Centrifugar las muestras a 16.000 × g durante 10 minutos a 4 °C, asegurando un correcto equilibrio de la centrifugadora.
- Tras arrancar la centrífuga, etiqueta los nuevos frascos correspondientes a las muestras. Retira las muestras de la centrífuga una vez completada la centrifugación.
- Ajustar la pipeta de 200 μL a 120 μL. Recoger cuidadosamente 120 μL del sobrenadante acuoso tras la centrifugación, evitando perturbaciones del pellet. Transfiere el sobrenadante a los frascos de centrífuga recién etiquetados y desecha el pellet.
- Añade una cantidad igual (120 μL) de acetato de etilo en los frascos recién etiquetados junto con el líquido sobrenadante. Repite esto para todas las muestras.
PRECAUCIÓN: El acetato de etilo es inflamable y puede irritar la piel, los ojos y el sistema respiratorio. Evita inhalar vapores y el contacto prolongado. - Lleva las muestras de nuevo a la centrífuga. Asegúrate de que la centrífuga esté bien equilibrada y que la tapa del rotor esté bien establecida. Centrifuga a 2.374 × g durante 20 minutos a 4 °C.
- Tras la centrifugación, recoge cuidadosamente 120 μL de la fase orgánica superior sin alterar la fase acuosa inferior. Transfiere el sobrenadante extraído que contiene SCFA a nuevos viales de centrifugadora etiquetados.
NOTA: El volumen recogido puede ser inferior a 120 μL. Si hay una emulsión en la interfaz, extender la centrifugación o enfriar las muestras sobre hielo hasta lograr una separación clara de fase. Las muestras en blanco procedurales procesadas en paralelo sin material fecal pueden incluirse como un paso opcional de control de calidad para evaluar los niveles de fondo de SCFAs introducidos por reactivos o manipulación. - Examina viales anteriores para asegurarte de que la capa inferior no se haya levantado accidentalmente.
NOTA: Los pasos que implican adición de ácido y manipulación de disolventes orgánicos deben realizarse rápidamente, manteniendo los tubos tapados siempre que sea posible, para minimizar las pérdidas por volatilización o evaporación.
4. Manejo y almacenamiento de extractos
- Localiza y etiqueta correctamente una caja de extracción, luego coloca las muestras extraídas en ella.
NOTA: Las muestras pueden pausar de forma segura tras la recogida de la fase orgánica almacenando los extractos a −20 °C durante hasta 24 horas en tubos fuertemente tapados, y luego transfirirse a −80 °C para un almacenamiento a largo plazo. - Coloca la caja en un congelador a -80 °C para esperar el análisis SCFA.
NOTA: Dado que tanto el acetato de etil como el SCFA son altamente volátiles, las muestras extraídas deben analizarse rápidamente tras su almacenamiento a −80 °C. El almacenamiento prolongado a largo plazo puede comprometer la integridad de la muestra.
5. Análisis de cromatografía de gases
- Analizar los SCFAs extraídos por GC utilizando una columna capilar de sílice fundida con una fase estacionaria de ácidos grasos libres a caudales de 30, 300 y 20 mL/min para hidrógeno, aire y nitrógeno, respectivamente. Inyecta una alícuota de 1 μL del extracto orgánico para su análisis.
- Para aplicaciones cuantitativas, incorporar estándares internos y procedimientos de calibración (por ejemplo, ácido 2-etilbutírico) como se describióanteriormente 2.
NOTA: Los ajustes específicos de cada instrumento se proporcionan en los métodos14 referenciados.
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Resultados
El protocolo anterior habrá dado aalícuotas extraídas de SCFA de 120 μL correspondientes al número de muestras fecales de las que se obtuvieron. La ejecución exitosa del protocolo de extracción se indica por la presencia de picos SCFA claramente resueltos en tiempos característicos de retención con intensidad de señal superior al ruido de fondo. Cuando se realiza según lo descrito, el protocolo produce perfiles SCFA fecales adecuados para la comparación cuantitativa posterior entre muest...
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Discusión
Este protocolo contiene varios pasos críticos que garantizan la extracción eficiente y reproducible de SCFAs a partir de muestras heces de ratón de pequeño volumen. El protocolo emplea un sistema de extracción ácido-disolvente en dos fases que utiliza volúmenes definidos de ácido clorhídrico diluido y acetato de etilo, adaptado a las propiedades fisicoquímicas de los SCFA como ácidos orgánicos débiles y de bajo peso molecular. La acidificación traslada los SCFA a su forma protonada, redu...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos mucho el apoyo financiero a este estudio proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud a través de R21AG065606 y R21AG08176 otorgado a Yiying Zhang, así como el apoyo de la Fundación Familiar Borten y la donación de la Familia Tang a Yiying Zhang.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Centrífuga | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Viales para centrífuga | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Porta tubos de microcentrífuga | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Acetato de etilo | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Morteros verdes | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, solución de stock); diluido a 0.5 M para uso |
| Pipeta de 1000 µL | USA Scientific | 7110-1000 | |
| Puntas de pipeta de 1000 µL | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Etanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, solución al 70% |
| Pipeta de 200 µL | USA Scientific | 7100-2200 | |
| Puntas de pipeta de 200 µL | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Pinzas | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
