Evaluación funcional de la barrera epitelial gingival del ratón utilizando trazadores fluorescentes

Summary

El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque estandarizado para evaluar cuantitativamente la integridad de la barrera epitelial gingival murina mediante la aplicación tópica de dextranos marcados con fluorescencia de diferentes tamaños moleculares sobre la superficie gingival in vivo, seguido de imágenes ex vivo mediante un sistema de microscopía de fotón único.

Abstract

La barrera epitelial gingival actúa como una defensa fundamental en la inmunidad oral y la homeostasis. Una barrera epitelial intacta impide eficazmente la penetración de sustancias nocivas desde el entorno oral, mientras que su alteración está estrechamente asociada con la patogénesis de condiciones como la periodontitis y el líquen plano oral. Aquí, establecimos un método tópico basado en la aplicación para evaluar la integridad de la barrera epitelial gingival en ratones. Primero, se aplicó tópicamente una mezcla de dextranos marcados con fluorescencia y diferentes pesos moleculares (40 o 70 kDa) en una carboximetilcelulosa sódica al 2% sobre la superficie gingival labial de la región molar. Tras un periodo de incubación de 30 minutos, el maxilar se disecó y fijó en un soporte personalizado para obtener imágenes inmediatas utilizando un sistema de microscopía de un solo fotón. Este enfoque permite la visualización y cuantificación de trazadores de diferentes tamaños a lo largo de las capas epiteliales, proporcionando una lectura funcional de la integridad de la barrera epitelial gingival aplicable a estudios de inflamación oral, cicatrización de heridas y modelización de enfermedades.

Introduction

La barrera epitelial gingival constituye una interfaz defensiva crítica en la cavidad oral, preservando la integridad tisular al regular selectivamente el transporte de sustancias mientras previene la invasión^{microbiana 1}. Compuesto por epitelio escamoso estratificado interconectado por complejos de unión estrecha, esta estructura dinámica controla con precisión la permeabilidad paracelular para restringir la penetración no selectiva de microorganismos, macromoléculas y^{solutos 2}. Múltiples factores pueden comprometer la integridad de la barrera gingival. La cavidad oral alberga la segunda comunidad microbiana más diversa del cuerpo humano, con más de 700 especies bacterianas que colonizan superficies dentales, grietas gingivales y mucosa^{oral 3,4}. Las células epiteliales que recubren los tejidos gingivales están expuestas de forma persistente a este denso entorno^{microbiano 5}.

Se ha demostrado que los factores de virulencia secretados por patógenos periodontales (por ejemplo, Porphyromonas gingivalis), incluidos los lipopolisacáridos, pueden alterar la función de la barrera epitelial, desencadenando así respuestas inflamatorias en los tejidos gingivales y provocando la progresión^{patológica 6,7}. Los mediadores inflamatorios y los factores mecánicos de estrés agravan aún más la disfunción de la barrera, aumentando la susceptibilidad a enfermedades^{orales 8}. Los probióticos orales pueden ayudar a prevenir la enfermedad periodontal promoviendo la estabilidad de la barrera epitelial gingiva. No obstante, las interacciones biológicas entre microorganismos y células epiteliales gingivales en la modulación de la función de barrera siguen siendo en gran medida sin esclarecer^. Por ello, el desarrollo de métodos fiables para evaluar la función de la barrera epitelial es de suma importancia.

La microscopía de escaneo láser de fotón único, reconocida por su alta resolución y su sistema de detección consolidado, ha demostrado ser especialmente valiosa para examinar muestras de tejido ex vivo ¹⁰. Las metodologías avanzadas de imagen mejoran significativamente la evaluación de las propiedades de la barrera gingiva. La naturaleza superficial de los tejidos gingivales, con células epiteliales situadas aproximadamente a 100 μm de la superficie, la hace ideal para este tipo de enfoques de imagen. Nuestra investigación ha establecido una técnica de evaluación ex vivo que utiliza dextranos marcados con fluorescencia de diferentes pesos moleculares como trazadores de permeabilidad paracelular. Combinado con microscopía láser de fotón único, este método permite cuantificar con precisión la función de la barrera epitelial gingiva, proporcionando información sobre los mecanismos de la enfermedad periodontal y posibles intervenciones terapéuticas.

El protocolo establecido en este estudio, que combina la administración localizada de trazadores a base de gel con imagen tridimensional ex vivo, está específicamente optimizado para abordar los desafíos únicos de evaluar la barrera epitelial gingiva. En primer lugar, los enfoques existentes de inyección intravenosa de trazadores (Tabla 1) no pueden evaluar con precisión la permeabilidad de los sitios epiteliales diminutos localizados a agentes^{externos 11}. En segundo lugar, los enfoques histológicos tradicionales requieren descalcificación y sección, que alteran la arquitectura tisular y son laboriosas y laboriosas y laboriosas ^12,13,14. En cambio, nuestro protocolo utiliza un gel altamente adhesivo para lograr una retención eficaz de trazadores en la compleja superficie local. Además, mediante una imagen 3D, asegura una cuantificación precisa y no destructiva de la profundidad y distribución de la penetración del trazador dentro del epitelio gingival, preservando así completamente la arquitectura espacial del tejido. En consecuencia, este método es especialmente adecuado para la evaluación espaciotemporal de alta resolución de la función de la barrera epitelial gingival dentro del entorno oral complejo y confinado.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Animal, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín, y cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Publicación NIH nº 85-23, revisada en 1996). Durante el proceso, los animales experimentales fueron tratados cuidadosamente para minimizar su dolor y malestar.

Los detalles de cada paso de trabajo para la evaluación de la permeabilidad in vivo en epitelios gingivais de ratón se describen a continuación (Figura 1A). Aquí proporcionamos un ejemplo de detección de la función de barrera epitelial tanto en modelos de periodontitis de ratón inducidos por ligadura como por Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). Todo el personal recibió formación integral en bienestar de animales de laboratorio y técnicas asépticas.

1. Manejo de animales

1. Durante todo el estudio, los animales domésticos bajo condiciones estándar de patógenos específicos libres (SPF) con un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y proporcionan alimento y agua ad libitum.
2. Preparación y administración de anestésicos y trazadores
   1. Mantener condiciones estériles durante todo el protocolo y utilizar herramientas limpias con etanol al 75%.
   2. Utiliza ratones machos tipo salvaje (WT) C57BL/6J en el grupo adulto de 8-10 semanas para el experimento. Dividir los ratones en tres grupos: un grupo de control (no tratado) y dos grupos experimentales (modelos de periodontitis inducida por ligadura y P. gingivalis).
      NOTA: En el grupo, se deben seleccionar ratones con peso corporal y edad de una semana similares para reducir la influencia de la edad y el peso en la permeabilidad epitelial gingiva. Los modelos de periodontitis en ratones inducidos por ligadura y P. gingivalis representan modelos de periodontitis de uso común. Para protocolos de modelado detallados, consulte la literatura sobre los modelos de periodontitis^{murinosa 15} inducidos por ligadura y¹⁶ inducidos por P. gingival.
   3. Seleccionar trazadores fluorescentes con espectros no superpuestos, como el dextrano etiquetado como FITC (40 kDa; FD40) y dextrano marcado con rodamina B (70 kDa; RD70), para asegurar una detección de señales distinta usando filtros FITC y rodamina correspondientes.
   4. Diluye los trazadores. Para seguir este protocolo, mezcla FD40 (1 g/L) y RD70 (1 g/L) en un gel de carboximetilcelulosa al 2% y guárdalos a 4 °C.
   5. Inyecta intraperitonealmente un 1,25% de tribromoetanol (200 mg/kg de peso corporal, 15-17 μL/g de peso corporal) para anestesiar a los ratones.
      NOTA: Las soluciones de tribromoetanol son fotosensibles. El alcohol tert-amílico es un disolvente orgánico inflamable, volátil e irritante. Todos los procedimientos que impliquen preparación, manipulación y administración deben realizarse en una campana extractora química o en un área extremadamente bien ventilada, estrictamente alejada de cualquier fuente de encendido. El personal debe llevar el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluidos guantes, gafas antisalpicaduras químicas y bata de laboratorio. Eliminación de residuos: La solución de tribromoetanol de desechos, el alcohol tert-amílico y todos los suministros contaminados (por ejemplo, jeringuillas, puntas de pipeta, guantes) deben ser recogidos y eliminados como residuos químicos peligrosos, de acuerdo estrictamente con las normativas y protocolos de Salud y Seguridad Ambiental (EHS) de su institución para productos químicos inflamables y tóxicos.
3. Durante la anestesia, mantener la temperatura corporal central en 37 ± 0,5 °C usando una almohadilla térmica controlada por retroalimentación. Aplica pomada ocular de eritromicina para evitar el resecamiento corneal.
   NOTA: Proporciona el cuidado adecuado a todos los animales durante todo el estudio.
4. Tras los procedimientos quirúrgicos, asegúrate de que los animales estén alojados individualmente sobre sábanas blandas en una jaula de recuperación cálida y silenciosa hasta que estén completamente en marcha. Monitoriza a los animales dos veces al día durante 48 horas y reintroducilos en su jaula de casa solo tras una recuperación completa, según la postura, actividad y comportamiento alimenticio normal.
5. Mantenga la cavidad oral abierta con una mordaza bucal y aplique una mezcla de 5 μL a 50 μL de dos o más trazadores de permeabilidad paracelular con diferentes pesos moleculares tópicamente a la superficie gingival labial de la región molar (Figura 1B). Sal 30 minutos. Si el animal se traga la mezcla, aplícala.
6. Aislamiento del maxilar
   1. Tras 30 minutos de aplicación de trazadores de permeabilidad, fija los ratones sobre cartón, colocándolos en posición supina y cinta sus extremidades.
   2. Tras la fijación, abre la cavidad oral para aislar el maxilar. Retira suavemente los tejidos circundantes y enjuaga la muestra a fondo con PBS.
   3. Coloca el maxilar sobre una lámina de vidrio, con arcilla para modelar a ambos lados para facilitar el montaje seguro de una cubierta sobre la muestra.

2. Montaje de microscopio de un solo fotón

1. Coloca cuidadosamente el maxilar del ratón disecado sobre el soporte de muestras diseñado a medida, asegurando una colocación estable para la imagen.
2. Adquirir imágenes utilizando un microscopio vertical de un solo fotón equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25×/NA 1.0, enfocado en la región de soporte montada bajo el maxilar.
   NOTA: Las señales de fluorescencia deben ser visibles inmediatamente después de retirar el gel trazador.

3. Imagen maxilar

1. Comienza la imagen inmediatamente después de seleccionar la región de interés en la superficie bucal del segundo molar dentro del maxilar.
2. Adquirir imágenes en pila Z con un tamaño de paso de 1 μm, desde la superficie gingival del maxilar hasta una profundidad de 100-200 μm, para una reconstrucción tridimensional (3D).
3. Realizar imágenes en serie Z para evaluar la permeabilidad de la barrera epitelial en el maxilar. Configura los parámetros del software en el software referenciado de la siguiente manera:
   1. En el menú Archivo , crea una nueva carpeta y asigna un nombre descriptivo para el conjunto de datos.
   2. En la pestaña Adquisición , configura el formato XY a 512 × 512 con una resolución de 0,99 μm/píxel.
   3. Pon el factor de zoom a 1.
   4. Ajusta las longitudes de onda de excitación a 488 nm (FD40) y 561 nm (RD70), con ventanas de emisión de 500-550 nm y 570-620 nm, respectivamente.
      NOTA: Los valores de ganancia se establecieron en 50 (488 nm) y 60 (561 nm), respectivamente.
   5. Para la serie Z y la imagen 3D, selecciona el modo de adquisición ND. Ajusta el Z-step a 1 μm (ajusta según sea necesario).
4. Una vez configurados los parámetros, selecciona el modo Live para visualizar el área gingival tanto en canales de fluorescencia individuales como fusionados dentro de la ventana de imagen.
5. Haz clic en Ejecutar ahora para comenzar la adquisición tras la configuración de parámetros.

4. Medición de permeabilidad

1. Divide la intensidad de fluorescencia de FD40 y RD70 en diferentes canales. No se requiere resta de antecedentes; fusiona las secciones del eje Z. Luego, utiliza el software ImageJ para calcular la intensidad de fluorescencia y así evaluar la permeabilidad e indicar la función de la barrera epitelial.
   1. Haz clic en Archivo y selecciona Abrir para abrir la imagen del maxilar tomada bajo el microscopio de fotón único.
   2. Ve al menú Imagen y cambia el tipo de imagen a formato de 8 bits para el análisis.
      NOTA: Las imágenes capturadas por microscopios de fluorescencia y sistemas confocales suelen estar en formato RGB y no pueden usarse directamente para la medición de la intensidad de fluorescencia. Deben dividirse en canales individuales o se deben importar imágenes monocromas directamente.
   3. Abre el menú Analizar , elige Establecer medidas y marca Área, Media e IntDen. Confirma haciendo clic en OK.
   4. Selecciona el canal a analizar y ajusta el umbral: Ir a Imagen | Ajustar | Umbral. El sistema aplicará automáticamente un valor y algoritmo por defecto, normalmente usando el rojo para indicar regiones seleccionadas.
      NOTA: Como las imágenes fluorescentes suelen tener fondos negros, selecciona también la opción Fondo oscuro .
   5. Establecer parámetros de medición: Ve a Analizar y selecciona Establecer Medidas. En el cuadro de diálogo, marca Valor gris medio y Límite hasta el umbral. Por último, haz clic en OK.
      NOTA: Se recomienda comprobar la etiqueta de visualización para que el nombre de la imagen aparezca en la tabla de resultados, facilitando así la identificación del grupo experimental.
   6. Realizar mediciones: Selecciona la herramienta de Selecciones a mano alzada . Utiliza el cursor para trazar manual y con precisión el contorno de la región de la señal fluorescente en el lado del tejido gingival. Haz clic en Analizar | Mide. Aparecerá la tabla de resultados, donde IntDen representa la intensidad de fluorescencia.
2. Copia los resultados a una hoja de cálculo para cálculos e importalos para hacer gráficos.
3. Cálculo de la intensidad relativa de fluorescencia: Primero, calcular la intensidad media de fluorescencia del grupo control. Luego, se divide el valor de intensidad de fluorescencia de cada grupo experimental entre la media del grupo de control para obtener la intensidad relativa de fluorescencia.

Results

Según el protocolo estandarizado, el maxilar del ratón que contenía los tejidos gingivales se montaba en un soporte diseñado a medida (Figura 1C). El examen microscópico reveló señales de fluorescencia verde (FD40) y roja (FD70) en la encía, demostrando la permeación de los trazadores a través de la barrera epitelial. Tras identificar la región de interés bajo el cristalino ocular, se adquirieron imágenes utilizando el software. En el grupo de control, ambos...

Discussion

El epitelio gingival actúa como una barrera física esencial contra la invasión bacteriana, mientras que los microorganismos orales muestran una doble capacidad regulatoria, ya sea al alterar la integridad de la barrera con factores de virulencia o a promover su mantenimiento. Estas interacciones biológicas determinan en última instancia la homeostasis tisular o la progresión de la enfermedad^17,18. Partiendo de esta base, desarrol...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Bejinghuabo Company	NZW28
carboxymethylcellulose	MREDA	M049898
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
ImageJ software	National Institutes of Health
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
NIS-Elements AR Image Software	Nikon
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+	Nikon
Tissue scissors	Bejinghuabo Company	M286-05