Mediante imágenes en lapso de tiempo, se puede seguir el proceso completo de regeneración de los esferoides de Hydra . Este protocolo describe la generación de esferoides Hydra , analiza una variedad de estrategias de montaje y detalla cómo realizar imágenes en vivo a largo plazo utilizando microscopía confocal de disco giratorio así como microscopía de fluorescencia de lámina de luz.
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Artículo de método
Preparación e imagen en vivo de esferoides hidra en regeneración
En este artículo
Resumen
Resumen
Hydra es reconocida por su excepcional capacidad regenerativa. De forma notable, pequeños fragmentos regeneradores de tejido de Hidra , llamados esferoides de Hidra , pueden establecer un organizador de nuevo. Una vez establecida, este organizador dirige el tejido circundante para que se diferencie en las estructuras orales adecuadas. En cuestión de días, el esferoide puede convertirse en un pólipo pequeño pero completamente patrón. La escala temporal relativamente corta de este proceso permite la obtención continua de imágenes en lapso de tiempo de todo el proceso, ofreciendo una oportunidad única para estudiar la dinámica espaciotemporal de la regeneración. Aquí presentamos un flujo de trabajo detallado y mostramos resultados representativos para generar conjuntos de datos de time-lapse de esferoides de Hydra en regeneración. El protocolo incluye un procedimiento detallado para la generación de esferoides y directrices para seleccionar muestras óptimas para la imagen. Discutimos estrategias de montaje adecuadas para la imagen a largo plazo de muestras vivas y demostramos enfoques de imagen utilizando tanto microscopios confocales de disco giratorio como microscopios de lámina. Los principios descritos aquí son aplicables en términos generales a otros sistemas modelo en los que los procesos morfogenéticos dinámicos pueden estudiarse mediante imágenes a largo plazo.
Introducción
Hydra es un pequeño pólipo de agua dulce, conocido principalmente por su excepcional capacidad regenerativa. Los fragmentos de tejido extirpados del centro de su cuerpo se pliegan en una esferoide hueca compuesta por las dos capas epiteliales de la Hidra, el ectodermo y el endodermo. Durante la regeneración, estos esferoides de la Hidra establecen un organizador de novo1. En aproximadamente 3 días, el eje corporal se alarga y las células de las extremidades de la cabeza y del pie se diferencian. Debido a este plazo relativamente corto, todo el proceso regenerativo puede captu....
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Protocolo
Todos los procedimientos descritos se llevaron a cabo en cumplimiento de las directrices éticas de la normativa nacional suiza para la investigación animal. Antes de empezar el experimento, Hydra debe alimentarse normalmente, 3 veces por semana, durante al menos 2 semanas. La Hidra usada para los experimentos debería sersana 12, sin órganos sexuales y sin brotes. También debe evitarse la Hidra recién gemelada, que puede reconocerse por su menor longitud en comparación con las otras Hidras de la colonia.
1. Preparación de esferoides de Hyd....
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Resultados
Generamos con éxito conjuntos de datos de tiempo a largo plazo para la regeneración de esferoides de Hydra utilizando tanto microscopía confocal de disco giratorio (SDCM) como microscopía de fluorescencia de lámina de luz (LSFM). La regeneración ocurrió normalmente en ambos sistemas de imagen: los esferoides rompieron simetría, se alargaron y desarrollaron tentáculos y un pie en 3 días (Figura 5A, Figura 6A, Víd.......
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Discusión
Tanto SDCM como LSFM son muy adecuados para generar conjuntos de datos de tiempo a largo plazo de esferoides de Hydra en regeneración. Los principios ópticos en los que se basa cada técnica son distintos y, por tanto, ofrecen ventajas y limitaciones únicas (Tabla 2). Se prefiere SDCM cuando no se requiere una vista completa y de alta resolución de la muestra. Se pueden imaginar múltiples muestras en un solo experimento, lo que lo hace especialmente útil para pro.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.
Agradecimientos
Queremos agradecer a Laure Plantard del Centro de Imagen Avanzada y Microscopía de FMI por su valiosa aportación. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación Novartis.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 20×/0.8 Plan-Apochromat objective | Zeiss | 440640-9903-000 | Para microscopía confocal de disco rotatorio |
| 20x/1.0 W Plan-Apochromat water dipping objective | Zeiss | 421452-9700-000 | Usado como objetivo de detección en el Zeiss Lightsheet 7 |
| 3D-printed holder for FEP chamber mounting | Hecho a medida | ||
| 4-well glass bottom imaging plate (#1.5H) | Ibidi | 80427 | |
| Agarose | Carl Roth | 3810.4 | |
| Aluminium mold for FEP chamber | Hecho a medida | ||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Canned air | Durable | POWERCLEAN STANDARD 400 | |
| Cell culture plate (6 cm) | Thermo Fisher Scientific | 150288 | |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| FEP foil (127 μm thickness) | Adtech Polymer Engineering | ||
| FluoSpheres carboxylate-modified (0.2 μm, dark red) | Thermo Fisher Scientific | F8807 | |
| Glass capillary | Brand | 701904 | |
| Glass pasteur pipette (150 mm) | VWR | 612-1701 | |
| Hydra vulgaris | |||
| Imaging software | Visitron | VisiView | Para microscopía confocal de disco rotatorio |
| Inverted light microscope | Zeiss | Axio observer 7 | Para microscopía confocal de disco rotatorio |
| Light sheet microscope | Leica | Viventis Deep LS2 | |
| Light sheet microscope | Zeiss | Lightsheet 7 | |
| Low melting point Agarose | Thermo Fisher Scientific | R0801 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Microscalpel | pfm medical | 200300745 | |
| Pipette bulb | |||
| Piston rod transferpettor | Brand | 701932 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Safety Bunsen burner | INTEGRA Biosciences | FIREBOY plus | |
| sCMOS cameras | Photometrics | Prime 95B | Para microscopía confocal de disco rotatorio |
| Sodium bicarbonate | Fluka Analytical, Sigma-Aldrich | 71630 | |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Spinning disk confocal scanning unit (50 μm pinholes) | Yokogawa | CSU-W1 | Para microscopía confocal de disco rotatorio |
| Stereoscope | Leica | M80 | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | |
| Thermoformer | Yuyao Jintai Machine Factory | Jintai JT-18 | |
| Tissue culture dish (10 cm) | VWR | 734-2321 | |
| Tris-HCl buffer | Roche Diagnostics | 10812846001 |
Referencias
- Bode, P. M., Bode, H. R. Formation of pattern in regenerating tissue pieces of hydra attenuata: I. Head-body proportion regulation. Dev Biol. 78 (2), 484-496 (1980).
- Fütterer, C., Colombo, C., Jülicher, F., Ott, A. Morphogene....
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Reimpresiones y permisos
