Artículo de método

Aislamiento y cultivo de preadipocitos blancos y marrones a partir de embriones de ratón

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DOI:

10.3791/70101

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17 de abril de 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory Lille Neuroendocrinology, Lille Neuroscience & Cognition, University of Lille, Inserm, CHU Lille

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un enfoque novedoso, robusto y reproducible para aislar y cultivar preadipocitos blancos y marrones de embriones de ratón, estableciendo una poderosa estrategia in vitro para diseccionar los mecanismos celulares y moleculares que rigen el compromiso y diferenciación de la línea de adipocitos, y proporcionando un marco para investigar el impacto del desarrollo del tejido adiposo.

Resumen

El tejido adiposo desempeña un papel central en la homeostasis metabólica, y sus propiedades se moldean durante el desarrollo embrionario mediante la diferenciación de los adipocitos. Por tanto, los preadipocitos embrionarios representan un modelo relevante para estudiar eventos tempranos en la formación y especificación del linaje del tejido adiposo. Este artículo describe un protocolo reproducible para el aislamiento y diferenciación in vitro de preadipocitos blancos y marrones aislados de embriones de ratón en el día embrionario 15.5 (E15.5), una etapa de desarrollo en la que comienzan a formarse depósitos de adiposos. El método proporciona una orientación detallada para la microdisección tisular, la digestión enzimática, el cultivo primario y las condiciones de diferenciación específicas de la línea que apoyan la viabilidad celular y la maduración adipogénica. Los resultados representativos incluyen acumulación de gotas lipídicas y expresión de marcadores asociados al linaje, confirmando una diferenciación exitosa bajo condiciones definidas de cultivo. Con este enfoque, los preadipocitos embrionarios pueden dirigirse hacia destinos de adipocitos blancos o marrones, lo que permite análisis comparativos del momento del desarrollo, características de linaje y perfiles de expresión génica. Este protocolo ofrece una herramienta práctica y relevante para el desarrollo para investigar la formación del tejido adiposo y los mecanismos de programación perinatal en un entorno experimental controlado.

Introducción

El tejido adiposo desempeña un papel central en el mantenimiento de la homeostasis de todo el cuerpo al regular el almacenamiento de energía, la señalización endocrina y la termogénesis adaptativa, interactuando extensamente con órganos locales ydistantes 1,2,3. Se pueden distinguir dos tipos principales de tejido adiposo: el tejido adiposo blanco (WAT) y el tejido adiposo marrón (BAT), que difieren notablemente en linaje celular, función fisiológica, distribución anatómica y actividadmetabólica 4.

WAT constituye el reservorio de energía primario del organismo. Los adipocitos blancos están altamente especializados para el almacenamiento de lípidos y se caracterizan por la presencia de una única gota lipídica grande (LD) que ocupa la mayor parte del espaciocitoplasmático 5. En cambio, BAT está especializado en termogénesis sin escalofríos. Los adipocitos marrones contienen múltiples LDs pequeños y presentan una alta densidad mitocondrial 3,6. La capacidad termogénica de BAT depende de la Proteína de Desacoplamiento 1 (UCP1), una proteína interna de la membrana mitocondrial que facilita la fuga de protones a través de lamembrana 7. Al desacoplar la fosforilación oxidativa de la síntesis de ATP, UCP1 disipa el gradiente de protones en forma de calor, contribuyendo así al mantenimiento de la temperatura corporal8. Dadas sus diversas funciones, WAT y BAT han despertado un interés considerable no solo como reguladores clave y posibles objetivos terapéuticos en enfermedades metabólicas, sino también en biología del desarrollo y evolutiva, inmunología y envejecimiento, debido a sus complejas y de gran alcance interaccionessistémicas 9,10. La evidencia acumulada también indica que la programación metabólica fetal está estrechamente asociada con el desarrollo del tejido adiposo, ya que las perturbaciones en el entorno intrauterino pueden influir en el número, la distribución y la función de los adipocitos, predisponiendo así a los individuos a la obesidad y enfermedades metabólicas más adelante enla vida 11.

Para investigar la biología del tejido adiposo, la disponibilidad de adipocitos maduros es esencial. Los sistemas de cultivo in vitro proporcionan un entorno controlado que permite evaluar factores específicos que influyen en la adipogénesis y la función de los adipocitos. Se han establecido varios protocolos para el aislamiento y diferenciación de adipocitos de ratones adultos o críasneonatales 12,13,14,15. Sin embargo, estos progenitores de adipocitos pueden diferir de las poblaciones celulares originales que dan lugar a tejidos adiposos durante el desarrollo. En ratones, los depósitos de BAT son los primeros en desarrollarse durante la embriogénesis, proporcionando a los recién nacidos una capacidad termogénica no tembladora, fundamental para la adaptación al frío postnatal. Se pueden detectar depósitos de adipocitos marrones en la región interescapular ya en el día embrionario 14.5 (E14.5)16. Los LDs comienzan a formarse en E15.5, y la expresión de UCP1 se inicia alrededor de E16.5. En el embrión de ratón, los preadipocitos de la WAT inguinal (iWAT) también están ya presentes en esta etapa16.

El protocolo descrito aquí se centra en los preadipocitos aislados en E15.5. Esta etapa corresponde al periodo embrionario durante el cual las células progenitoras inician la diferenciación in vivo 16, representando así a los progenitores primarios que dan lugar a WAT y BAT. En cambio, los progenitores adipogénicos aislados en etapas adulta o neonatal pueden ya haber sido influenciados por factores ambientales y es probable que muestren una plasticidad más restringida. Por lo tanto, utilizar progenitores embrionarios en E15.5 mejora la capacidad de recapitular fielmente el programa adipogénico in vivo, ya que estas células mantienen un alto grado de plasticidad del desarrollo y tienden a seguir trayectorias de diferenciación fisiológica. Este enfoque es de particular interés para cuestiones de biología del desarrollo, especialmente para investigar los efectos de factores ambientales en la diferenciación de preadipocitos durante el periodo perinatal, proporcionando un modelo valioso para estudiar cómo las exposiciones tempranas pueden influir en el desarrollo del tejido adiposo y los resultados metabólicos a largo plazo. Sin embargo, los usuarios deben ser cautelosos con esta especificidad en etapa: el método está optimizado para embriones de E15.5, y desviaciones en la edad embrionaria o en la precisión de disección pueden afectar al rendimiento o viabilidad celular. Además, la técnica de microdisección requiere práctica para evitar la contaminación con tejidos no adiposos, especialmente dado el pequeño tamaño de los depósitos embrionarios. Este protocolo resume todos los pasos y procedimientos para aislar, cultivar, amplificar y diferenciar preadipocitos embrionarios en adipocitos maduros marrones y blancos.

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Protocolo

Todos los procedimientos animales se realizaron conforme a la normativa local y bajo las directrices definidas por la Directiva del Consejo de la Unión Europea del 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) (APAFIS#2617-2015110517317420).

Todos los residuos biológicos y soluciones enzimáticas deben ser manipulados y eliminados conforme a las directrices y regulaciones institucionales de bioseguridad para materiales biopeligrosos. Específicamente:
- Residuos biológicos: recoger en contenedores aprobados para riesgos biológicos y eliminarlos mediante autoclav o según lo indique la oficina de bioseguridad de la institución.
- Soluciones enzimáticas: inactivan la actividad enzimática residual añadiendo un 10% de lejía durante 30 minutos y se disponen como residuo químico según la normativa local.
- Consumibles contaminados (puntas de pipeta, tubos, etc.): colocar en bolsas de biohazard y autoclave antes de su eliminación.
- Reactivos de fijación: se disponen como residuos químicos peligrosos en recipientes designados.

Siempre lleva el EPI adecuado al manipular residuos.

1. Recolección de embriones de ratón

  1. Eutanasiar a los ratones embarazados (C57Bl/6J) de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales.
  2. Desinfecta la zona abdominal de ratones embarazados con etanol al 70% y realiza una incisión en la línea media para exponer el útero.
  3. Incisa la cavidad abdominal para extraer los sacos vitelinos que contienen los embriones en E15.5 y colócalos en una caja de agarosa que contenga PBS frío (4 °C).
  4. Retira la membrana externa de cada saco vitelino y la placenta, y corta el cordón umbilical de los embriones.
  5. Coloca los embriones en una nueva caja de agarosa que contiene 1x PBS frío.
    NOTA: Aunque las estructuras del sistema nervioso central que subyacen a la percepción consciente del dolor no están completamente desarrolladas en esta etapa gestacional, los nociceptores periféricos comienzan a formarse entre E13 y E15. De acuerdo con las directrices institucionales de cuidado animal, para minimizar posibles respuestas nociceptivas, recomendamos que los embriones sean sacrificados por decapitación antes de cualquier manipulación experimental.

2. Disección de tejidos adiposos embrionarios (Figura 1)

  1. Disección de BAT interescapular (Figura 1A)
    1. Corta un rectángulo de una placa de agarosa al 5% y coloca el embrión dentro de ella para inmovilizarlo. Llena el plato con PBS fría 1x. Coloque la caja de agarosa junto al embrión bajo un microscopio binocular.
    2. Retira la piel de la parte posterior del embrión.
    3. Disecciona el BAT interescapular usando pinzas finas y microtijeras.
    4. Separa cuidadosamente el BAT del tejido circundante (tejido conectivo y músculo) usando microtijeras para obtener una muestra de BAT de aproximadamente 4–6 mm x 2–3 mm.
    5. Coloque el BAT en un tubo de 2 mL que contiene 1 mL de glutamina F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Medium (DMEM/F-12) con 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (P/S).
  2. Disección de iWAT (Figura 1B)
    1. Coloca el embrión de lado (por un lado y luego por el otro) sobre la placa de agarosa.
    2. Disecciona el iWAT usando pinzas finas y microtijeras.
    3. Separa el iWAT del tejido circundante (tejido conectivo y piel) cuidadosamente hasta tener dos depósitos de aproximadamente 2–4 mm x 0,5–0,8 mm.
    4. Coloque las dos muestras de WAT en un tubo de 2 mL que contiene 1 mL de glutamina DMEM/F-12 fría con 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (P/S).
      NOTA: Todas las disecciones deben realizarse bajo un microscopio binocular en el entorno más estéril posible, utilizando herramientas previamente desinfectadas.

3. Digestión de tejidos adiposos

  1. Retira el DMEM/F12 con una pipeta y añade en los tubos 200 μL de glutamina DMEM/F12 con 100 U/mL p/s, albúmina sérica bovina al 0,2% (BSA), 0,5 U de colagénasa D y 0,5 U Dispase II.
  2. Corta los tejidos con microtijeras en los tubos para reducir los fragmentos de tejido lo máximo posible y ayuda al proceso digestivo pipeteando arriba y abajo 10 veces.
    NOTA: Las muestras completamente digeridas deben presentarse como una suspensión turbia sin grumos de tejido visibles.
  3. Incuba a 37 °C (en baño marea) durante 15 minutos.
  4. Detener la reacción añadiendo 600 μL de glutama DMEM fría/F-12 con 100 U/mL p/s, suero fetal bovino (FBS) al 20%. Resuspende de forma uniforme pipeteando arriba y abajo 10 veces.

4. Cultivo celular primario

NOTA: A partir de este paso, todos los procedimientos deben realizarse bajo estrictas condiciones estériles en un Gabinete de Seguridad Biológica (BSC) para evitar la contaminación. Lleva guantes estériles, bata de laboratorio y gafas de seguridad para mantener la esterilidad y protegerte frente a posibles peligros. Utiliza plásticos desechables estériles, técnica aséptica y asegúrate de que todos los reactivos y medios sean estériles. Evita el contacto con superficies no estériles para evitar contaminaciones.

  1. Placar las células sobre portaobjetos de pozo e incubarlas en condiciones estándar (37 °C, 5% CO2) durante 1 hora; para placas de 8 pozos, pon 200 μL/pozo. Tras la incubación, confirma que las células se han adherido moviendo suavemente la placa mientras observas bajo un microscopio.
    NOTA: En esta etapa, diferentes muestras de BAT o WAT pueden agruparse en un solo tubo para obtener cultivos homogeneizados en los distintos pozos (por ejemplo, para probar el efecto de un tratamiento en cultivos similares).
  2. Sustituye el medio por glutamina precalentada (37 °C) DMEM/F-12 con 100 U/mL de p/s, 10% FBS e incuba las células durante la noche a 37 °C, 5% CO2.
    NOTA: Al cambiar el medio, se eliminan las células muertas o no unidas y los fragmentos de tejido que no podían descomponerse, quedando solo las células adheridas.
  3. Tratamiento de diferenciación (72 h)
    1. Para la diferenciación de adipocitos marrones, cambie el medio usando glutamina precalentada (37 °C) dmem/f-12 con 100 U/mL p/s, 10 % FBS, 125 nM de indometacina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 nM triiodotironina (T3), 1 μM de rosiglitazona, 1 μM dexametasona y 850 nM de insulina, e incubar a 37 °C, 5% CO2 durante 72 horas.
    2. Para la diferenciación de adipocitos blancos, cambia el medio usando DMEM/F-12 glutamina precalentada con 100 U/mL p/s, 10% FBS, 0,5 mM IBMX, 1 μM dexametasona y 850 nM de insulina e incuba a 37 °C, 5% CO2 durante 72 horas.
  4. Tratamiento de mantenimiento (cada 48 horas)
    1. Cambia el medio usando glutamina dmem/f-12 precalentada (37 °C) CON 100 U/mL p/s, 10 % FBS, 1 nM T3, 1 μM Rosiglitazona y 850 nM de insulina. Renueva el medio cada 48 horas.
      NOTA: Todas las concentraciones listadas se refieren a las concentraciones finales de trabajo de los reactivos. Ajustar los volúmenes finales de medios de diferenciación y mantenimiento en función del número de pozos a tratar, utilizando 200 μL por pozo como volumen estándar para placas de 8 pozos.

5. Fijación e inmunotinción (Figura 2A)

  1. Aspira el medio y lava las células con PBS fría 1x.
  2. Fija las células 10 minutos con formaldehído frío al 4% en 1x PBS.
  3. Lava las células con 1 PBS durante 3 x 5 minutos.
  4. Permeabiliza las células con 0,1% de Tritón en 1x PBS durante 10 minutos.
  5. Lava las células con 1 PBS durante 3 x 5 minutos.
  6. Bloquea los sitios inespecíficos con suero de burro normal al 5% (NDS) en 1x PBS durante 1 hora a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: La elección de la especie para el suero bloqueador depende de la especie en la que se producen los anticuerpos secundarios.
  7. Incubar anticuerpos primarios diluidos en NDS al 5% en 1x PBS durante la noche a 4 °C.
    NOTA: No añadas anticuerpos primarios a uno de los pozos; esto servirá como control negativo.
  8. Lava las células con 1 PBS durante 2 x 5 minutos.
  9. Lava las células con NDS al 5% en 1x PBS durante 5 minutos.
  10. Incuba con los anticuerpos secundarios, DAPI y Bodipy durante 1 hora en la TR, protegiéndolos de la luz.
  11. Lava los pozos con 1 PBS durante 3 x 5 minutos.
  12. Mantén las células a 4 °C en la oscuridad hasta la adquisición de las imágenes.

6. Crioconservación de preadipocitos

NOTA: Es posible detener el cultivo y congelar las células antes o después del proceso de diferenciación para almacenarlas y reutilizarlas en cultivos celulares posteriores.

  1. Prepara medio congelante: 50% FBS, 40% DMEM/F-12 glutamina con 100 U/mL p/s, 10% Dimetil Sulfóxido (DMSO).
    PRECAUCIÓN: El DMSO es un químico peligroso. Es un irritante para la piel y los ojos, puede facilitar la absorción de otras sustancias tóxicas a través de la piel y puede causar daño si se inhala o ingiere. Siempre maneja DMSO dentro del BSC para minimizar la exposición y la contaminación. Lleva el equipo de protección individual (EPI) adecuado (guantes estériles, bata de laboratorio y gafas de seguridad para evitar el contacto). Evita el contacto con la piel. En caso de contacto, lávate inmediatamente con mucha agua. Guarda el DMSO en un recipiente herméticamente sellado dentro del BSC cuando no se use y asegúrate de que la eliminación adecuada siga los protocolos de seguridad del laboratorio.
  2. Lava las células con PBS precalentado (37 °C) 1x.
  3. Añade tripsina precalentada (37 °C) al 0,05% para desprender químicamente las células e incubar 5 minutos a 37 °C, 5% de CO2. Comprueba visualmente si hay desprendimiento celular bajo el microscopio.
  4. Detén la reacción añadiendo 3 veces el volumen de glutamina precalentada (37 °C) DE DMEM/F-12 con 100 U/mL p/s, 10 % FBS. Suspende de forma uniforme.
  5. Centrifugar 7 minutos a RT, 300 × g y descartar el sobrenadante.
  6. Resuspende las células en 10 mL de medio congelante. Centrifugar 7 minutos a RT, 300 × g y descartar el sobrenadante, quedando aproximadamente 3 mL.
    NOTA: Mide el volumen exacto para calcular el número total de células tras el conteo.
  7. Diluye un pequeño volumen 1:2 con azul de Tripán y cuenta las células vivas usando una cámara de Neubauer.
  8. Ajusta el volumen con medio congelante para obtener 5 × 104 – 1 × 105 celdas/vial (volumen final: 1 mL/vial).
  9. Transfiere los viales a un recipiente congelante (tasa de refrigeración: -1 °C/min) y guárdalos a -80 °C durante la noche.
  10. Transfiere a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Este protocolo permite una viabilidad superior al 90% tras el descongelamiento.
  11. Descongela las células cuando sea necesario descongelando rápidamente el vial en un baño maria a 37 °C.
  12. Transfiere el contenido del vial a 4 mL de glutamina precalentada (37 °C) DMEM/F-12 con 100 U/mL p/s, 10% FBS. Resuspende de forma uniforme pipeteando suavemente arriba y abajo 10 veces. Incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO2.
  13. Sustituye el medio por DMEM/F-12 glutamina fresca con 100 U/mL p/s, 10 % FBS y renueva cada 48 horas.
    NOTA: Es fundamental realizar este cambio de medio para eliminar restos de DMSO, ya que una exposición prolongada puede comprometer la viabilidad, diferenciación y función celular. Asegura la sustitución completa del medio para evitar efectos citotóxicos.
  14. Procede con experimentos o células de paso cuando alcancen el 80% de confluencia.

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Resultados

Como se ilustra en la Figura 1, los depósitos intactos de BAT e iWAT pueden aislarse eficientemente de embriones en E15.5. Aunque el BAT es fácilmente detectable en embriones de E15.5, la detección del iWAT puede requerir entrenamiento. En ambos casos, es esencial microdiseccionar todo el tejido circundante tras una disección rugosa para evitar cultivar otros tipos celulares.

Las etapas iniciales de digestión y cultivo de preadipo...

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Discusión

El cultivo de preadipocitos ha sido ampliamente descrito en diversos contextos experimentales. Sin embargo, los protocolos existentes dependen predominantemente de tejidos adultos o fibroblastos embrionarios, y actualmente no existen métodos estandarizados para aislar y cultivar preadipocitos embrionarios directamente de tejidos adiposos en desarrollo. Estudiar estas células es especialmente importante, ya que representan las poblaciones auténticas de preadipocitos que residen en su micr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Agradecemos a Christian Duhem por sus consejos. Agradecemos el apoyo del Instituto Nacional de Salud e Investigación Médica de Francia (INSERM). El M.C-M contó con el apoyo del ANR-23-CE13-0044. El M.A contó con el apoyo del Instituto Europeo de Genómica para la Diabetes (EGID, ANR-10-LABX-0046), el Centro Nacional de Medicina de Precisión en la Diabetes (PreciDIAB, ANR-18-IBHU-0001) y el Consejo Regional de Hauts-de-France (22005973). La Figura 2 fue creada en BioRender. Mayeuf-Louchart, A. (2026) https://BioRender.com/3pbzif1. SB contó con el apoyo de la subvención ANR-24-CHBS-0002.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3,5,3'-triiodotironinaSigma709719T3
3-isobutil-1-metilxantina  SigmaI7018IBMX
AgaroseSigmaA0169
AlcoholVWR1.59010.0500
Anticuerpo anti-UCP1AbcamAB10983
Microscopio binocularLeica  MZ9.5
Gabinete de seguridad biológicaTermo Científica51022482BSC, HeraSafe KS Clase II Armario de Seguridad
BodipyInvitrogenD3922Excitación/Emisión 493/504 nm
Albúmina sérica bovinaEuromedex04-100-812-CBSA
CentrifugadoraEppendorf5430 R
AbrazaderasFST (Alemania de acero inoxidable)
Colagenasa DSigma11088882001
CriotubosSarstedt72.379
Placas de cultivo (8 pozos)Ibidi 80826
Placas de cultivo (12 pozos)Compañero de CorningCLS3513Placa de poliestireno, fondo plano, estéril
DexametasonaSigmaD2915
Dispasa IISigma4942078001
DMEM/F12Gibco31331Glutamina añadida
DMSOSigmaD2438
Anticuerpo anti-conejo de burroInvitrogenA32795Alexa Fluo Plus 647
Eppendorfs 1,5 mLEppendorf15625367
FBSGibcoA5256701
Formaldehído 37 %Termo Científica119690010
Contenedor congeladorTermo Científica  5100-0001
Hoechst InvitrogenH3570
IncubadoraTermo Científica50116048Incubadora de CO2 Heracell 150i
IndometacinaSigmaI7378
InsulinaSigmaI9278
  microscopio invertido equipado con un microscopio 10 y veces; Objetivo e iluminación halógenaCarl Zeiss Axio Vert.A1
Ratones C57BL/6JRío Charles
MicrotijerasFST (Alemania de acero inoxidable)
NDSSigmaD9663
Cámara de NeubauerTermo Científica10195580
PBS 10xGibco14200
PBS 1xGibco14190
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122
Placas de PetriSarstedt83.3902
Placas qPCRTermo CientíficaAB-0600
sonda qPCR para Fabp4Termo Científica4331182TaqMan ensaya, Mm00445878_m1
Sonda qPCR para PpargTermo Científica4331182TaqMan ensaya, Mm00440940_m1
Sonda qPCR para Ucp-1Termo Científica4331182TaqMan ensaya, Mm01244861_m1
Kit de transcripción inversa & nbsp;Termo Científica4368813Kit de ADNc de alta capacidad
Kit de extracción de ARNOmega Bio-TekR6934-02E.Z.N.A. Kit Total de ARN II
RosiglitazonaSigmaR2408
Triton X-100Termo CientíficaA16046
Trippan BlueSigmaT8154
Tripsina-EDTAGibco25300054
Baños MaríaGrantSAP12 Capacidad de 12 L

Referencias

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