Artículo de método

Evaluación colorimétrica de la actividad de la deiodinasa 1 en microsomas hepáticos humanos utilizando la reacción de Sandell-Kolthoff

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DOI:

10.3791/70104

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10 de abril de 2026

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1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método colorimétrico para evaluar de forma fiable la influencia de los compuestos químicos en la actividad de la Deiodinasa 1 (DIO1) en microsomas hepáticos humanos utilizando la reacción de Sandell-Kolthoff. Incluye criterios de aceptación predefinidos y métricas estadísticas de desempeño, y apoya los esfuerzos continuos para la inclusión en las directrices de pruebas de la OCDE.

Resumen

Este método permite identificar sustancias de prueba que inhiben la actividad de DIO1 y, por tanto, pueden interferir con la homeostasis de la hormona tiroidea. El protocolo presentado describe un método colorimétrico no radiactivo para evaluar los efectos de las sustancias de prueba sobre la actividad enzimática de la Deiodidinasa 1 (DIO1) en microsomas hepáticos humanos. El ensayo se basa en la reacción de Sandell-Kolthoff (SK), que cuantifica el yoduro liberado durante la desiodinación de la triiodotironina inversa (rT3) a diiodotironina (T2). El cerio amarillo (IV) se reduce a cerio incoloro (III) en presencia de yoduro, permitiendo la detección fotométrica a 415 nm. En este sistema estandarizado, la concentración de cerio (IV) se establece en 40 mM para mejorar la estabilidad y robustez de la señal bajo las condiciones descritas. Para garantizar la fiabilidad y reproducibilidad del ensayo, se incluye un sistema de control integral: 6-propil-2-tiouracilo (artículo de referencia), aurothioglucosa (control positivo), 1-tio-β-D-glucosa sal sódica (control negativo) y dimetilsulfóxido al 1% (control con disolvente). El protocolo incluye un ensayo de medición de rango para determinar concentraciones adecuadas en la prueba, estandarización de la actividad de liberación de yoduro específica por lote de microsomas y pruebas estructuradas de interferencia química en ausencia de microsomas, con una evaluación opcional de seguimiento sin ditiotreitol (DTT) para identificar artefactos dependientes de la DTT. El ensayo DIO1-SK es adecuado para cribado de rendimiento medio a alto y estudios de toxicología mecanicista. Su robustez, escalabilidad y aplicabilidad a microsomas humanos la convierten en una herramienta valiosa para investigar la alteración endocrina. Este protocolo apoya los esfuerzos de validación regulatoria.

Introducción

Los disruptores endocrinos (DE) son sustancias químicas que interfieren con la regulación hormonal y, en consecuencia, causan efectos adversos enhumanos 1,2. Las deiodinasas (DIO) son enzimas asociadas a membranas, siendo la selenocisteína un residuo clave en sus sitios activos. Esta familia enzimática comprende tres isoformas distintas (DIO1, DIO2 y DIO3), que modulan colectivamente las concentraciones de la hormona tiroidea circulante (TH) y regulan su disponibilidad tisular específica dentro de las células3. La tiroxina (T4), que actúa como prohormona, y la triiodotironina (T3), la forma activa, desempeñan papeles vitales en la regulación del gasto energético, el crecimiento, los procesos de desarrollo y la termorregulación en elcuerpo 4. Las isoformas DIO difieren en las características de su especificidad del sitio de desiodación, propiedades cinéticas y preferencias desustratos 3. DIO1 es la principal isoforma de la deiodinasa en el hígado adulto y muestra una fuerte afinidad por el sustrato por la triiodotironina inversa (rT3) y las iodotironinas sulfatadas, mientras que DIO2 utiliza preferentemente T4 y rT3, y DIO3 actúa principalmente sobre T4 y T3. Utilizar microsomas hepáticos humanos y rT3 como sustrato permite la detección selectiva de la actividad de DIO1, minimizando la interferencia de otras isoformas. Aunque las consecuencias precisas de la inhibición de DIO1 inducida por sustancias aún no se han esclarecido completamente, la evidencia de mutaciones genéticas humanas que afectan a DIO1 demuestra claramente que DIO1 puede alterar el sistema hormonaltiroideo 5. Como resultado, existe una necesidad crítica de métodos robustos y reproducibles para investigar la inhibición de DIO1.

El objetivo del método presentado es cuantificar la actividad de DIO1 in vitro utilizando un enfoque colorimétrico no radiactivo basado en la reacción de Sandell-Kolthoff (SK). DIO1 cataliza la conversión de rT3 inverso a T2, un proceso que da lugar a la liberación de iones yoduro. La reacción SK permite la detección sensible del yoduro liberado, lo que permite determinar la actividad de liberación de yoduro (IRA) como medida directa de la actividad de DIO1. Este ensayo permite la detección de efectos inhibitorios de sustancias de prueba sobre DIO1, apoyando la toxicología mecanicista, el cribado o la toma de decisiones regulatorias. Es especialmente relevante para investigar la inhibición de DIO1 como un evento molecular iniciador de vías adversas que conducen a la alteración tiroidea, según lo demuestran los esfuerzos internacionales de validación como los coordinados por EURL ECVAM 6,7. El método fue desarrollado originalmente en2012 8,9 y optimizadoaún más en 6,7 en respuesta a la creciente necesidad de ensayos in vitro robustos, reproducibles y escalables que puedan integrarse en baterías de prueba para el cribado endocrino, especialmente en el contexto del metabolismo de la hormona tiroidea. Recientemente, se publicó la aplicación de configuraciones analógicas basadas en SK para pantallas medias 10 a alto rendimiento, demostrando la amplia aplicabilidad del enfoque basado en SK.

Aunque el ensayo DIO1-SK mide indirectamente la actividad de DIO1 cuantificando IRA en lugar de productos TH, ofrece varias ventajas frente a técnicas alternativas. A diferencia de los métodos que dependen de sustratosradiomarcados 12 o de la cuantificación basada en espectrometría de masas de hormonas tiroideasagotadas o formadas 13, la reacción SK proporciona una lectura simple, escalable y rentable al medir la liberación de yoduro en 415 nm14. Aunque los métodos LC-MS/MS con extracción en fase sólida (SPE-LC-MS/MS) ofrecen alta especificidad y sensibilidad para cuantificar rT3 y T2, requieren instrumentación costosa y son menos adecuados para cribado de mayor rendimiento. En cambio, el ensayo DIO1-SK puede implementarse en entornos estándar de laboratorio y ha sido prevalidado para su uso con microsomas hepáticos humanos, demostrando alta reproducibilidad y predictividad 6,7. En un estudio comparativo, los resultados de la reacción SK, específicamente la liberación de yoduro, se compararon directamente con la cuantificación de metabolitos de la hormona tiroidea (rT3 y T2) utilizando SPE-LC-MS/MS 15. Los hallazgos revelaron una fuerte concordancia entre ambos enfoques en una variedad de sustancias de prueba y potencias de inhibición. Para todas las sustancias analizadas, los cambios en la actividad de liberación de yoduro (IRA) medidos por la reacción SK reflejaron de cerca las alteraciones en los niveles de rT3 y T2 determinadas por espectrometría de masas. Esto reforzó aún más la validez de la lectura SK como sustituto de la actividad DIO1. Estos análisis comparativos confirman que el ensayo SK ofrece una alternativa robusta y fiable a técnicas analíticas más complejas, y que la liberación de yoduro puede medirse con confianza para evaluar la inhibición de DIO1 in vitro.

Sin embargo, el método SK tiene ciertas limitaciones que deben considerarse: es susceptible a interferencias de sustancias que contienen yoduro libre como impureza, liberan yoduro de forma no enzimática o reaccionan con componentes del ensayo como el ditiotreitol (DTT). La DTT se incluye como cofactor reductor para mantener la competencia catalítica de la deiodinasa apoyando la regeneración de la selenocisteína en el sitio activo en su estado reducido durante la renovación. Dado que la DTT es un reductor fuerte, ciertas sustancias de prueba (o impurezas) pueden sufrir reacciones redox que pueden influir en la lectura colorimétrica y, en algunos casos, provocar artefactos de ensayo dependientes de la DTT no relacionados con la liberación enzimática de yoduro. Estas interferencias pueden dar lugar a resultados falsos negativos para la inhibición de DIO1, ya que el yoduro medido puede no originarse de la conversión enzimática de rT3. Así, aunque el ensayo SK es adecuado para el cribado rutinario y la mayoría de las sustancias de prueba, el LC-MS/MS podría usarse para confirmación siempre que se sospeche interferencia en el ensayo o para sustancias con propiedades químicas complejas.

El ensayo DIO1-SK está actualmente en preparación para su inclusión como guía de prueba de la OCDE en un proyecto internacional PEPPER (plataforma público-privada para la validación de métodos de caracterización de disruptores endocrinos), lo que destaca su creciente importancia para aplicaciones regulatorias y la armonización internacional de estrategias de pruebas de disruptores endocrinos. El ensayo puede integrarse en baterías de pruebas in vitro integrales, apoyando tanto la evaluación de seguridad química como las investigaciones mecanicistas sobre la alteraciónendocrina 16. Cuando se combina con ensayos que abordan eventos clave adicionales a lo largo de la vía de resultados adversos de la tiroides, contribuye a una comprensión más completa de los mecanismos de alteración de las hormonas tiroideas.

Además, la escalabilidad y alta reproducibilidad del protocolo lo hacen muy adecuado para el cribado de rendimiento medio a alto. Esto es esencial para evaluar grandes cantidades de sustancias durante el desarrollo de fármacos y en entornos académicos, como se ha demostradorecientemente en 11. Los investigadores interesados en la inhibición de DIO1, ya sea para cribado, toxicología mecanicista o toma de decisiones regulatorias, se beneficiarán de un ensayo robusto, accesible y versátil. La validación de este método lo convertirá en una herramienta estándar para la investigación sobre la alteración del sistema hormonal tiroideo y para la evaluación de la seguridad química.

Protocolo

NOTA: Antes de realizar el ensayo principal, es esencial una serie de pasos preparatorios para garantizar la precisión, reproducibilidad y validez del ensayo DIO1-SK. Estas actividades de preensayo incluyen la fundición de placas filtrantes rellenas de resina por intercambio iónico, que son fundamentales para una separación eficaz y para minimizar la interferencia de fondo en la reacción SK. La reacción de Sandell-Kolthoff se estandariza regularmente utilizando curvas estándar de yoduro para monitorizar cambios sistemáticos y mantener la calidad del ensayo. Se mide la actividad de los microsomas hepáticos humanos para determinar la capacidad de liberación de yoduro específica por lote, asegurando un rendimiento enzimático consistente entre los experimentos. En conjunto, estos pasos proporcionan una base sólida para el posterior trabajo principal de ensayo y la evaluación de datos, apoyando la generación de resultados reproducibles e interpretables.

1. Trabajo de preensayo

  1. Preparación de tampones y reactivos
    1. Preparar todos los buffers y soluciones almacenadas con antelación, tal y como se describe en la Tabla 1. Guarda las alicuotas según se indique para garantizar la estabilidad y reproducibilidad.
    2. El día del ensayo, prepara la mezcla de sustrato fresca para cada plato de 96 pozos. Para una placa de 96 pozos, combine 5,75 mL de tampón HEPES/EDTA (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL de 1 M DTT descongelado y 10 μL de 6 mM rT3 (disuelto en DMSO). Mezcla suavemente y mantén la mezcla de sustrato sobre hielo hasta que la uses.
  2. Preparación de la referencia
    1. Preparar una solución de 10-1 M de 6-PTU de control de referencia en un disolvente adecuado (por ejemplo, DMSO) fresco el día de realizar el ensayo.
    2. Preparar una dilución 1:10 de este stock endiH 2O (RI-C8) para lograr una concentración de DMSO del 10% y preparar una serie de diluciones de este stock en un 10 % de DMSO endiH 2O, como se describe en la Tabla 2.
  3. Preparación del control positivo
    1. Prepara una solución de stock de 10-2 M de la ausotroglucosa control positivo en un disolvente adecuado (por ejemplo, DMSO) y guárdala hasta 6 meses a 4 °C.
    2. El día del ensayo, diluye el material a 10-3 M endiH 2O para lograr una concentración de DMSO del 10% de DMSO.
  4. Preparación del control negativo
    1. Prepara una solución de stock de 10-2 M de la sal sódica 1-Thio-β-D-glucosa de control fresca el día del ensayo.
    2. El día del ensayo, diluye el material a 10-3 M endiH 2O para lograr una concentración de DMSO del 10% de DMSO.
      NOTA: Siempre utilice las precauciones de seguridad adecuadas, especialmente al manipular productos químicos peligrosos como el arsenito sódico y el ácido sulfúrico. Todos los reactivos deben prepararse con agua desionizada y almacenarse según las recomendaciones del fabricante. La mezcla de sustrato, una vez preparada, y la alicuota DTT descongelada están pensadas para un solo uso el día del ensayo y no deben volver a congelarse.
  5. Colada de resina de intercambio iónico
    1. Utiliza un recipiente rectangular transparente adecuado para la preparación.
    2. Añade unos 250 g (o la cantidad deseada) de resina de intercambio iónico a un recipiente grande y lávalo. Lava añadiendo ácido acético al 10%; Deja reposar la suspensión de resina durante 10 minutos.
    3. Después de dejar que la suspensión se asiente durante 10 minutos, inclina ligeramente y aspira el sobrenadante. Lava al menos 5 veces en total o hasta que no se filtre más color en el disolvente.
    4. Tras el último paso de lavado, añade un 10% de ácido acético para que constituya aproximadamente el 50% del volumen total.
    5. Inclina el recipiente para que la resina se mueva hacia un lado y estabiliza el recipiente en posición inclinada. Espera ~10 minutos a que se separen las fases.
    6. Coloque una placa filtrante de 96 pozos sobre una placa de 96 pozos de profundidad y añada 100 μL de ácido acético al 10% en cada pozo de la placa filtrante de 96 pozos.
    7. Corta las puntas usadas para la colada de resina a una altura de ~1 cm para ensanchar la abertura en el extremo y funde 300 μL de resina de intercambio iónico en cada pozo de la placa filtrante de 96 pozos.
      NOTA: Las puntas utilizadas en nuestro trabajo tienen un volumen máximo de 1.200 μL y pueden conectarse a pipetas multicanal.
    8. Eluir el ácido acético centrifugándolo en una placa de pozo de 96 de profundidad con 100–200 × g en una centrífuga con un rotor basculante para placas microtituladas durante 1 minuto. Comprueba si la resina está distribuida de forma uniforme por toda la placa.
    9. Sella la placa con una lámina de plástico impermeable y guárdala a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
      NOTA: Se sabe que los componentes de resina de intercambio iónico pueden afectar la reacción SK si no se lavan correctamente. El sobrenadante eliminado puede usarse directamente en la reacción SK (usar 50 μL de muestra de sobrenadante, añadir 50 μL de cerio y, finalmente, 50 μL de solución de arsenita) y puede compararse con una muestra de ácido acético al 10% (control en blanco) para asegurar el lavado completo de los componentes.
  6. Estandarización de la reacción de Sandell-Kolthoff
    1. Preparar diluciones de yoduro de una fuente de yoduro correspondiente (por ejemplo, solución estándar de yoduro) con concentraciones recomendadas de 1.500, 1.000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 y 1 nM usando un patrón de yoduro correspondiente endiH 2O.
    2. Añadir 50 μL dediH 2Opuro como control y 50 μL de las diluciones de yoduro preparadas a una placa de 96 pozos en triplicado como se describe en el diseño de la Figura 1.
    3. Añadir 50 μL de solución de cerio de 40 mM a todos los pozos y comenzar la reacción añadiendo 50 μL de solución de arsenita de 25 mM a todos los pozos.
    4. Tan pronto como sea posible tras añadir la solución de arsenita, mide la absorción usando un lector de placas a 415 nm (±2 nm) registrando la densidad óptica (OD) cada minuto durante 21 minutos, así como la OD inicial.
    5. Evalúe los resultados tal y como se describe en la sección 4.
      NOTA: Normalmente, un antecedente deΔOD 21min > 0,3 en el controldiH 2O puro requerirá atención e investigación adicional de las causas subyacentes (por ejemplo, contaminación en el lote As o Ce, baja calidad del agua).
  7. Evaluación de la actividad de los microsomas
    1. Preparar la concentración más alta (RI-C8) del ítem de referencia (6-PTU) tal como se describe en el paso 1.2.
    2. Preparar las seis diluciones de microsomas como se describe en la Tabla 3 y la mezcla de sustratos según la Tabla 1.
    3. Añadir 10 μL de una dilución de disolvente al 10% (v/v) endiH 2O (por ejemplo, 10% de DMSO endiH 2O) y 10 μL de 10-2 M 6-PTU (RI-C8) en una placa de 96 pozos en triplicado, tal como se describe en el diseño de la placa de la Figura 2.
    4. Añadir 40 μL de diluciones de microsomas endiH 2O (resultando en 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 y 0 μg de proteína microsomal por pozo) a la placa de 96 pozos como se muestra en la disposición de la placa.
      NOTA: Los proveedores suelen proporcionar la concentración de proteína microsomal en stock. Si no es así, pueden emplearse métodos estándar de cuantificación de proteínas, aunque no los aplicamos en este estudio.
    5. Añade 50 μL de mezcla de sustrato recién preparada a cada pozo y sella la placa con una lámina de plástico impermeable.
    6. Colocar la placa de 96 pozos sobre un agitador en una incubadora (37 °C a 850 rpm) e incubar durante 2 horas.
    7. Tras el tiempo de incubación, coloca la placa sobre hielo para detener la reacción.
    8. Realiza el intercambio iónico de forma análoga al paso 2.2.
    9. Transfiere las cantidades adecuadas de muestra del pozo profundo obtenidas en el paso de intercambio iónico a una placa nueva de 96 pozos para medir las diluciones sin diluir (50 μL de muestra), 1:2 (25 μL de muestra + 25 μL de ácido acético al 10%) y 1:4 (12,5 μL de muestra + 37,5 μL de ácido acético al 10%), manteniendo la disposición de la placa sin cambios.
    10. Evalúa los resultados descritos en la sección 4 y determina el factor de dilución para las muestras en ácido acético al 10%, así como la concentración de proteína microsomal que aún conduce a los valores más altos posibles deΔOD 21min -BG en la reacción de Sandell-Kolthoff sin alcanzar la meseta de saturación.
      NOTA: Normalmente, una liberación de yoduro de21 minutos > 0,5 es fácilmente posible en las diluciones 1:4 o 1:2 de ácido acético de los 20 μg de proteína microsomal por muestra de pozo y suele variar alrededor de unΔOD 21 min de 1. No se recomienda concentraciones más altas de proteínas microsómicas, ya que aumentan la unión de fondo y inespecífica durante el ensayo. Se recomienda repetir la medición de una serie de dilución de 6 PTU utilizando la concentración de microsomas y el factor de dilución determinados para confirmar el resultado.
  8. Evaluación de solubilidad de los ítems de prueba
    1. Disolver el elemento de prueba a 100 mM o 200 mg/mL en un disolvente adecuado (por ejemplo, DMSO) a temperatura ambiente. Mezcla o haz un vórtice y comprueba la disolución visualmente (microscopio).
    2. Si no está disuelto, sonica hasta 5 minutos y vuelve a comprobarlo. Si aún no está disuelto, calienta a 37 °C hasta 60 minutos y vuelve a comprobarlo.
    3. Si es insoluble, diluye aún más o prepara un nuevo caldo a una concentración más baja y repite el procedimiento. Si el DMSO no es adecuado, prueba con agua o etanol como disolventes alternativos.
    4. Una vez disuelto, prepara una dilución 1:10 endiH 2O (disolvente al 10%) y repite la evaluación (mezcla, sonicación, calentamiento según sea necesario).
    5. Para simular las condiciones del ensayo, prepara una dilución del 1% del ítem de prueba en el tampón de ensayo y repite la comprobación de solubilidad.
  9. Preparación de ítems de prueba y localización de distancia
    1. Preparar la solución de stock de prueba en la concentración soluble más alta en un disolvente adecuado (preferiblemente DMSO), tal como se determina durante la evaluación de solubilidad en el paso 1.8.
    2. Para el ensayo de localización de distancia, prepare ocho diluciones de elementos de prueba mediante pasos consecutivos de dilución 1:10 (v/v) usando la solución original y un 10% de DMSO endiH 2O.
    3. Realizar el ensayo de localización de distancia para estimar el perfil de inhibición del ítem de prueba realizando los pasos descritos en la sección 2. Si el ítem de prueba muestra inhibición del ≥25% en cualquier concentración, ajusta el rango de concentración para las pruebas finales de ensayo para incluir al menos tres concentraciones en el rango lineal de inhibición y dos concentraciones por debajo del 10% IRA, si procede.
    4. Si el ítem de prueba muestra una inhibición del <25% en todas las concentraciones analizadas, reutiliza la misma serie de dilución para las pruebas finales. En este caso, el ensayo de localización de distancia puede contar como una de las tres pruebas independientes requeridas.
      NOTA: Realizar al menos dos, idealmente tres, experimentos independientes para cada ítem de prueba para garantizar la reproducibilidad y fiabilidad de los resultados. Si se elige otra dilución para cubrir mejor el rango de actividad, se permite una desviación respecto a la proporción de dilución 1:10. El corte del 25% en esta estrategia de pruebas (véanse los pasos 1.9.3 y 1.9.4) distingue los efectos de los ítems de prueba de los controles negativos, teniendo en cuenta la variabilidad de la actividad de referencia y proporcionando un margen de seguridad adicional. Este umbral garantiza una clasificación fiable de los perfiles inhibitorios.

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Figura 1: Disposición de placas para la curva estándar de yoduro. Esta figura muestra la disposición de placas de 96 pozos utilizada para generar la curva estándar de yoduro. Los pozos contienen diluciones en serie de yoduro que van desde 1 nM hasta 1.500 nM, así como controles solodiH 2O.  Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Disposición de placas para la titulación de proteínas microsomales y pruebas de artículos de referencia. Esta figura muestra la disposición de las placas de 96 pozos para la titulación de proteínas microsomales y la prueba de inhibidores de referencia (6-PTU). Las filas contienen cantidades crecientes de proteína microsomal por pozo, con y sin 6-PTU.  Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Realización del ensayo DIO1–SK

  1. Incubación de microsomas con el ítem de prueba
    1. Preparar el elemento de referencia tal como se describe en el paso 1.2, así como el control positivo y negativo, tal como se describe en los pasos 1.3 y 1.4. Prepara los ítems de prueba con concentraciones adecuadas siguiendo el protocolo descrito en los pasos 1.8 y 1.9.
    2. Preparar la mezcla de sustrato según la Tabla 1 y preparar una suspensión de microsomas en la concentración proteica predefinida según el paso 1.7, diluyendo una solución microsoma cuidadosamente descongelada y aliquotada endiH 2O. Mantenga la suspensión de microsomas sobre hielo hasta que sea necesaria para la incubación.
    3. Siguiendo la disposición de placas mostrada en la Figura 3 y la Figura 4 (si se evalúan más de dos elementos de prueba simultáneamente), se añaden 10 μL de concentraciones de elementos de referencia, control positivo y negativo, control de disolventes (disolvente del 10% (v/v) endiH 2O) y concentraciones de elementos de prueba a los pozos.
    4. Añade 40 μL de la suspensión de microsomas a todos los pozos. Añade 50 μL de la mezcla de sustrato recién preparada a las muestras.
    5. Sellar la placa con una lámina de plástico impermeable y colocarla sobre un agitador en una incubadora (37 °C a 850 rpm) durante 2 horas; Coloca la placa tras la incubación sobre hielo para detener la reacción.
    6. Coloca la placa sobre hielo después de la incubación para detener la reacción.
      NOTA: La placa puede almacenarse sobre hielo hasta la medición para preservar la integridad de la muestra. La primera plancha de ensayo contiene ocho concentraciones del elemento de referencia, mientras que cada placa adicional el mismo día contiene solo la mayor concentración del elemento de referencia, dejando más espacio para elementos adicionales de prueba si es necesario.
  2. Separación mediante placas filtrantes de 96 pozos rellenas con resina de intercambio iónico
    1. Coloca una placa filtrante preparada rellena de resina de intercambio iónico y 96 pozos, tal como se prepara en el paso 1.5, sobre una placa de pozo de 96 pozos de profundidad y añade 150 μL de ácido acético al 10% a cada pozo de la placa filtrante de 96 pozos rellena con resina de intercambio iónico para humedecer la resina en las columnas.
    2. Eluir el ácido acético centrifugándolo en la placa usada de 96 pozos de profundidad con 100–200 × g en una centrífuga con rotor basculante para placas de microtitulación durante 1 minuto.
    3. Sustituye la placa usada de 96 de profundidad por una nueva de 96 de profundidad.
    4. Añade 133 μL de ácido acético al 10% a cada pozo de la placa incubada de 96 pozos del paso 2.1.6 y agita brevemente la placa para mezclar las soluciones.
    5. Transfiere 175 μL de las muestras preparadas en el paso anterior a la placa filtrante de 96 pozos rellena de resina de intercambio iónico, manteniendo la disposición inicial de la placa.
    6. Pasar las muestras a través de la resina y hacia la placa del pozo de 96 de profundidad centrifugando (100–200 × g) en una centrífuga con un rotor abatible para placas microtituladas durante 1 minuto. Retira la placa filtrante de 96 pozos rellena de resina intercambiante iónica.
      NOTA: La placa del pozo de 96 de profundidad con muestras puede sellarse con una lámina de plástico impermeable y almacenarse a 4 °C durante al menos 3 meses. Esto permite mediciones adicionales en caso de errores manuales/técnicos o cambios en el factor de dilución en la reacción o medición de Sandell-Kolthoff en los días siguientes.
  3. Reacción Sandell-Kolthoff
    1. Dependiendo del factor de dilución determinado de las muestras en ácido acético al 10% para el lote de microsomas utilizado (véase el paso 1.7), añadir 50 μL de la muestra sin diluir o adecuadamente diluida a una nueva placa de 96 pozos.
    2. Añadir 50 μL de solución de cerio de 40 mM (preparada según lo descrito en la Tabla 1) a todos los pozos y comenzar la reacción añadiendo 50 μL de solución de arsenita de 25 mM (preparada según lo descrito en la Tabla 1) a todos los pozos.
    3. Tan pronto como sea posible tras añadir la solución de arsenita, mide la absorción usando un lector de placas a 415 nm (±2 nm) registrando la densidad óptica (OD) cada minuto durante 21 minutos, así como la OD inicial.

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Figura 3: Disposición de placas para ensayos paralelos de dos elementos de prueba. Disposición de placas de 96 pozos para probar dos elementos de prueba en triplicado a través de múltiples concentraciones, junto con réplicas de controles negativos, positivos, solventes y el elemento de referencia. Se usó como la primera placa de ensayo del día. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Disposición de placas para pruebas paralelas de tres elementos de prueba. Disposición de placas de 96 pozos para probar tres elementos de prueba en triplicado a través de múltiples concentraciones, con réplicas de controles negativo, positivo y disolvente. El elemento de referencia se incluye solo en su concentración más alta, ya que se prueba completamente en la primera plancha (véase la Figura 3). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Pruebas de interferencias (microsomas ± y ± TDT)

  1. Preparar la concentración más alta (RI C8) del elemento de referencia (6 PTU) según lo descrito en el paso 1.2 y preparar la solución y diluciones del stock del artículo de prueba (incluida la concentración máxima del artículo de prueba).
  2. Prepara la suspensión de microsomas a la concentración definida por pozo (véase el paso 1.7) diluyendo microsomas cuidadosamente descongelados y alistados endiH 2O. Mantén la suspensión de microsomas sobre hielo hasta su uso.
  3. Prepara dos mezclas de sustratos: la mezcla estándar con TDT como se describe en la Tabla 1, y una mezcla de sustrato idéntica sin DTT (omitir solo la DTT).
  4. Dispensar en los pozos designados de una placa de 96 pozos según la Figura 5: 10 μL de RI C8, 10 μL de DMSO al 10% (v/v) endiH 2O (control con disolvente) y 10 μL de cada dilución del elemento de prueba.
  5. Añadir 40 μL de suspensión de microsomas a pozos designados "con microsomas" y 40 μL dediH 2O a pozos designados "sin microsomas", según la Figura 5.
  6. Sobre hielo, añade 50 μL de mezcla de sustrato con DTT a los pozos designados "con DTT" y 50 μL de la mezcla de sustrato sin DTT a los pozos designados "sin DTT" (Figura 5).
  7. Sella la placa con una lámina de plástico impermeable e incuba en un agitador en una incubadora (37 °C, 850 rpm) durante 2 horas.
  8. Tras la incubación, coloca la placa sobre hielo para detener la reacción.
  9. Realizar la separación por intercambio iónico y cuantificación de yoduro mediante la reacción SK como se describe en los pasos 2.2 y 2.3, y evaluar los resultados según la Sección 4.
    NOTA: Esta configuración de placa única (Figura 5) evalúa la mayor concentración de elementos de prueba en paralelo con sin microsomas y con frente a sin DTT para distinguir la actividad enzimática de DIO1 de los artefactos de ensayo. Un aumento del IRA del ≥20% en pozos sin microsomas indica interferencia SK (liberación/lectura de yoduro independiente de DIO1), y la sustancia se clasifica como "no aplicable en el ensayo SK de DIO1" y se excluye del análisis. Las diferencias entre condiciones con TDT y sin TDT ayudan a identificar la liberación de yoduro dependiente de la DTT como un mecanismo de interferencia adicional.

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Figura 5: Disposición de placas para pruebas de interferencia. Esta figura muestra la disposición de placas de 96 pozos para pruebas de interferencia, donde se prueban los ítems de prueba, el elemento de referencia y el control de disolventes tanto con como sin microsomas en presencia de TDT, así como sin microsomas y sin la presencia de DTT. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Evaluación de datos

  1. Evaluación de la actividad de DIO1
    1. Determinar los valoresΔOD 21min mediante la resta de los valores de 21 min de todas las muestras respecto a los valores medidos iniciales (0 min):
      figure-protocol-6
    2. Determina los valores ΔOD-BG restando la media de los valoresΔOD 21min de los controles inhibidos 10 3 M 6-PTU (RI) de los valores ΔOD21min de todas las muestras:
      figure-protocol-7
    3. Normalizar los valores del elemento de prueba a los valores de control del disolvente respectivos mediante la división de los valores deΔOD 21min-BG TI de prueba por la media de los valoresΔOD 21min -BG SC del control del disolvente (SC) correspondiente, generando valores de actividad de liberación de yoduro (IRA) en %.
      figure-protocol-8
    4. Grafica los valores IRA de las diferentes concentraciones de los ítems de prueba en un paquete de software estadístico, con los valores IRA en el eje y (lineal) y las concentraciones de los ítems de prueba en el eje x (logarítmico).
    5. Utiliza un algoritmo de ajuste de curvas para visualizar una relación concentración-respuesta (por ejemplo, "[Inhibidor] frente a respuesta -- pendiente variable (cuatro parámetros)" en el software estadístico elegido. "Arriba" representa la respuesta máxima, "Abajo" representa la respuesta más baja, y "HillSlope" describe la pendiente de la curva:
      figure-protocol-9
    6. Determinar el IC50 del ítem de referencia y, si corresponde, del ítem de prueba.
    7. Calcular el coeficiente de varianza (CV) de la estimación log IC50 del elemento de referencia en %:
      figure-protocol-10
    8. Calcula el IRA del control negativo normalizado al control del disolvente en %:
      figure-protocol-11
    9. Calcule la IRA del control positivo normalizado al control del disolvente en %:
      figure-protocol-12
    10. Calcula el factor z':
      figure-protocol-13
    11. Para comprobar la validez del experimento, compare los valores calculados con los criterios de aceptación de la Tabla 4.
      NOTA: Se deben cumplir todos los criterios para obtener una prueba válida.
    12. Clasificar los ítems de la prueba como inhibidores completos, parciales o no inhibidores basándose en su inhibición máxima y valores deIC 50 , como se resume en la Tabla 5.

Resultados

La Figura 6 ofrece una visión general del flujo de trabajo del ensayo DIO1-SK y los pasos clave de estandarización necesarios para establecer con éxito el método en un laboratorio. El flujo de trabajo (Figura 6A) resume las fases secuenciales del ensayo, incluyendo el uso de microsomas hepáticos humanos, la incubación con ítems de prueba y controles, la extracción de yoduro mediante separación por intercambio iónico y la cuantificación colorimétrica de yoduro mediante la reacción de Sandell–Kolthoff (SK). La Figura 6B destaca la estrategia de estandarización que sustenta un rendimiento robusto y resultados válidos, incluyendo (i) estandarización de la reacción SK, (ii) pruebas de actividad microsoma específicas por lote, (iii) evaluación de solubilidad y pruebas de interferencia, (iv) un ensayo de medición de rangos y (v) ajuste de las concentraciones de los ítems de prueba basándose en la primera ejecución válida del ensayo.

Un elemento central de esta estrategia es la prueba de actividad microsomal específica para cada lote, ya que los lotes de microsomas hepáticos humanos pueden diferir sustancialmente en su actividad de desiodinación de rT3, lo que requiere determinar una concentración enzimática adecuada para cada nuevo lote antes de los análisis rutinarios de sustancias.

Esta estrategia de pruebas por etapas es fundamental para su implementación: solo después de verificar el rendimiento base del ensayo (controles, comportamiento de reacción SK y actividad microsomática) y las condiciones del ensayo estandarizadas, se puede esperar que el análisis de sustancias produzca perfiles de inhibición válidos e interpretables.

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Figura 6: Flujo de trabajo y pasos de estandarización del ensayo SK DIO1. (A) El flujo de trabajo ilustra el uso de microsomas hepáticos humanos, la configuración de la placa de 96 pozos, la incubación con elementos de prueba y controles, la extracción de yoduro y la cuantificación colorimétrica mediante la reacción SK. Cada paso se representa secuencialmente para resaltar las fases principales del ensayo. (B) Los pasos de estandarización incluyen la estandarización de la reacción de Sandell-Kolthoff, pruebas de actividad microsomática específica por lote, evaluación de solubilidad e interferencia, medición de distancias y ajuste de concentraciones de ítems de prueba basadas en la primera ejecución válida del ensayo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Basándose en el flujo de trabajo y el marco de estandarización mostrado en la Figura 6, la Figura 7 ilustra cómo los laboratorios determinan una concentración adecuada de proteínas microsomales (y dilución post-intercambio iónico) para lograr un rango dinámico suficiente manteniendo una respuesta sigmoidal de inhibición para el inhibidor de referencia. En la Figura 7A, la ΔOD21min-BG aumenta con el aumento de la proteína microsomal y depende de la dilución post-intercambio iónico (sin diluir, 1:2, 1:4). La dilución que produce la mayor ΔOD21min-BG manteniendo una respuesta sigmoidal se selecciona para experimentos posteriores (ejemplo mostrado: dilución 1:2). En la Figura 7B, se comparan las curvas de inhibición de 6-PTU entre cantidades de proteínas microsomales para identificar la concentración proteica más baja que aún produce una curva sigmoidal (ejemplo mostrado: 5 μg de proteína/pozo), equilibrando así la sensibilidad con el fondo.

Es importante destacar que este paso de optimización debe ser realizado por cada laboratorio al implementar el método, ya que la concentración proteica requerida depende de la actividad del lote de microsomas utilizado, lo que requiere una estandarización específica de la concentración enzimática por lote.

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Figura 7: Actividad e inhibición microsomal por 6-PTU. (A) El gráfico muestra el aumento de la actividad a medida que la señal de Sandell-Kolthoff corregida por fondo (BG) (ΔOD21 min n-BG) con cantidades crecientes de proteína microsomal por pozo (log10[μg proteína/pozo]), analizada en diluciones no diluidas, 1:2 y 1:4. La mayor dilución con el valorΔOD 21 min–BG más alto, así como con forma sigmoidal, se utilizará para futuros experimentos. En este caso, es la dilución 1:2. (B) Curva concentración-respuesta del inhibidor de referencia 6-propil-2-tiouracilo (6-PTU) que muestra la actividad de liberación de yoduro (IRA en %) graficada contra log10[concentración (M)] a diferentes cargas microsomales de proteínas (5, 7,5 y 10 μg/pozo). Los valores de IRA se normalizan al control del disolvente. Los puntos de datos de ambos gráficos representan la media ± DE de tres réplicas técnicas (pozos) por condición de una prueba representativa de actividad microsómica. Las curvas se ajustaron mediante regresión no lineal utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros ("pendiente variable") (inhibidor vs. respuesta). La menor concentración de proteína con curva sigmoidal se utilizará en futuros experimentos; En este caso, 5 μg/pozo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Una vez completados los pasos de flujo de trabajo y estandarización (Figura 6) y se ha establecido una concentración adecuada de proteína microsomal para el lote seleccionado de microsomas (Figura 7), se establecen los parámetros principales del ensayo para proceder con el análisis rutinario de sustancias. En esta etapa, los ítems de prueba pueden evaluarse junto con el conjunto de controles de placas (elemento de referencia, control de disolventes y controles positivo/negativo) en el formato de placa estandarizado, lo que permite una normalización robusta e interpretación consistente de los perfiles de inhibición.

La Figura 8 demuestra la discriminación del ensayo basada en el comportamiento concentración-respuesta en la actividad de liberación de yoduro (IRA). El inhibidor de referencia 6-PTU (Figura 8A) muestra una disminución dependiente de la concentración en IRA, proporcionando el perfil de inhibición sigmoidal esperado, tal como se espera para la verificación del rendimiento del ensayo. El ácido tánico (Figura 8B) muestra un perfil inhibitorio comparable al inhibidor de referencia (inhibición máxima > 90%) bajo las condiciones mostradas. Las tres concentraciones más altas de la sustancia testóloga mostraron valores negativos de IRA. Los valores IRA <0 % no reflejan una 'liberación negativa de yoduro' biológicamente significativa, sino que surgen del procedimiento de cálculo (resta de fondo y normalización al control del disolvente), lo que puede propagar pequeñas fluctuaciones en el control del disolvente en valores normalizados negativos. Por lo tanto, los valores de IRA por debajo del 0% se consideran equivalentes al 0% (línea base) para la interpretación del resultado. El dibutilftalato (Figura 8C) no presenta inhibición (inhibición máxima inferior al 25%) en todo el rango de concentraciones probado, lo que representa un perfil no inhibidor. En conjunto, estos perfiles ilustran que el ensayo puede diferenciar comportamientos inhibitorios de no inhibitorios bajo condiciones estandarizadas. El sistema de prueba también puede identificar inhibidores parciales, que muestran niveles máximos de inhibición entre el 25% y el 90% (datos no mostrados). Más detalles sobre cómo se categorizan se pueden encontrar en la Tabla 5.

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Figura 8: El comportamiento dosis-respuesta del ensayo DIO1–SK distingue a los inhibidores de los no inhibidores. Las curvas dosis-respuesta muestran la actividad de liberación de yoduro (IRA en %) representada en función de la concentración de log10 (M) para (A) el inhibidor de referencia 6-PTU, (B) un inhibidor representativo (ácido tánico) y (C) un no inhibidor representativo (ftalato de dibutil). Los valores de IRA se calcularon tras la resta de fondo y se normalizaron al control del disolvente. Los símbolos representan la media ± DS (n = 3) de un experimento independiente, cada uno realizado con tres réplicas técnicas (pozos) por concentración. Las curvas se ajustaron mediante regresión no lineal utilizando un modelo logístico de cuatro parámetros ("pendiente variable") (inhibidor vs. respuesta). Los valores de IRA por debajo del 0% se consideran equivalentes al 0% (línea base) para la interpretación de resultados. Estos datos demuestran que el ensayo proporciona un perfil de inhibición sigmoidal para el inhibidor de referencia y puede confirmar si una curva concentración-respuesta es inhibitoria o no bajo condiciones estandarizadas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

En una ejecución válida del ensayo, los controles con disolventes (SC) muestran una separación clarade la señal ΔOD 21 minutos respecto a la condición de referencia totalmente inhibida (6-PTU, RI-C8). En un conjunto de datos de ejemplo (10 tiradas independientes), cada placa incluía n = 9 réplicas técnicas para SC y la referencia totalmente inhibida (6-PTU a 10−3 M). En las placas, los valores medios de SC ΔOD21min de placas oscilaron entre 1,383 y 1,819 (media ± DS: 1,565 ± 0,114), mientras que los valores medios de ΔODde placa en 21min para la condición inhibida de 6-PTU oscilaron entre 0,258 y 0,771 (media ± DE: 0,473 ± 0,087). El cálculo de ΔOD en este ensayo se basa en la diferencia entre OD0min yOD 21min, y la validez del ensayo suele estar respaldada por un umbral de factor z de >0,5.

A lo largo de 10 pruebas independientes, la 6-PTU produjo una curva sigmoidal de concentración-respuesta con valores de IC50 que oscilan entre 1,20E-06 M y 5,02E-06 M (media ± DE: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). Los criterios de aceptación para los valores de IC50 en el rango de referencia de 1.00E-06 a 1.00E-05 se basan en datos de estudios de validación previos. Sin embargo, los valores de IC50 se ven significativamente afectados por el lote específico de microsomas utilizado y pueden mostrar una variabilidad considerable. No obstante, se espera que estas variaciones se mantengan dentro del mismo orden de magnitud.

La calidad del ensayo puede resumirse usando el factor z′, que refleja tanto la ventana de señal como la variabilidad de los controles. En el conjunto de datos descrito, seis curvas de referencia se asociaron con factores z′ que oscilaban entre 0,544 y 0,774 (media ± DS: 0,658 ± 0,062), consistente con el objetivo de aceptación comúnmente utilizado de z′ > 0,5.

En la práctica, las etapas subóptimas pueden identificarse por desviaciones en el fondo del ensayo y/o por no cumplir con criterios de aceptación predefinidos. Por ejemplo, se indica un alto fondo en la reacción de Sandell-Kolthoff cuando el blank diH₂O puro muestra ΔOD > 0,3, lo que justifica la investigación (por ejemplo, contaminación por reactivos o problemas de calidad del agua). Estos aumentos de fondo pueden reducir el rango dinámico del ensayo y elevar la variabilidad del control, contribuyendo así a criterios de aceptación fallidos, incluyendo un factor z′ por debajo de 0,5. Los pozos que presentan artefactos técnicos evidentes (por ejemplo, precipitación o decoloración anormal) se excluyen como valores atípicos de la evaluación. También se excluyen los valores atípicos determinados mediante pruebas de diagramas de caja. Si no se cumplen los criterios de aceptación tras eliminar los valores atípicos, la ejecución del ensayo se considera no válida y debe repetirse.

Reactivo/BufferInformación sobre la preparación
Solución ácida de amonio y cerio (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)Añade 6,32 g de (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O y 125 mL de diH2O a un matraz volumétrico de 250 mL. Añade 125 mL 1 M H2SO4 para alcanzar un volumen final de 250 mL. Guárdalos a temperatura ambiente hasta 6 meses.
DTT (Alícuotas de 1 M)Una alicuota preparada o suministrada de 1 M de TDT en H2O como 0,5 mL de alicuotas en tubos microcentrífugas de 1,5 mL y almacenada a -20°C durante hasta 6 meses.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) tampón (pH 7,0)Utilizando un matraz volumétrico de 250 mL, añade 12,5 mL de solución de 1 M HEPES, 201 mg de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) y llena hasta 250 mL con diH2O. Conservar a 4°C hasta 3 meses.
Solución rT3 ("tubos de mezcla de sustratos")Disuelve rT3 en DMSO hasta una concentración final de 6 mM, alicuota en porciones de 10 μL en tubos centrífugos de 15 mL y guárdalos a -20°C durante hasta 6 meses.
Solución de arsenito sódico (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)Añade 0,81 g de NaAsO2, 11,7 g de NaCl y 125 mL de diH2O a un matraz volumétrico de 250 mL. Añade 125 mL 1 M H2SO4 para alcanzar un volumen final de 250 mL. Guárdalos a temperatura ambiente hasta 6 meses.

Tabla 1: Preparación de tampones y reactivos. Esta tabla detalla los pasos de preparación e instrucciones de almacenamiento para todos los tampones y soluciones stock utilizados en el ensayo DIO1 SK, incluyendo el tampón HEPES/EDTA, DTT, solución rT3, solución ácida de amonio cerio y solución de arsenita sódica.

Nombre de la dilución del elemento de referenciaConcentración de dilución de elementos de referencia [M]10% DMSO [μL]Elemento de referenciaConcentración final del elemento de referencia en el ensayo [M]
RI-C81.00E-0245050 μL de solución de stock de referencia 10-1 M1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 μL de RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 μL de RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 μL de RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 μL de RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 μL de RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 μL de RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 μL de RI-C21.00E-08

Tabla 2: Preparación de las diluciones de elementos de referencia. Esta tabla resume la preparación de las diluciones en serie para el elemento de referencia (6-PTU), incluyendo concentraciones, volúmenes de DMSO y concentraciones finales utilizadas en el ensayo.

Microsoma por pozo [μg]diH2O [μL]Dilución de microsomas [μL]Concentración final de enzimas en el ensayo [μg/mL]
2078020 μL de solución de microsoma de 20 mg/mL200
10400400 μL de 20 μg de microsoma por dilución de pozo100
5400400 μL de 10 μg de microsoma por dilución de pozo50
2.5400400 μL de 5 μg de microsoma por dilución de pozo25
1.25400400 μL de 2,5 μg de microsoma por dilución de pozo12.5
0.68400400 μL de 1,25 μg de microsoma por dilución de pozo6.8

Tabla 3: Preparación de diluciones de microsomas. Esta tabla proporciona el esquema de dilución para la proteína microsomal por pozo, incluyendo los volúmenes requeridos de diH₂O y solución de microsoma para alcanzar las concentraciones finales de proteínas microsomales para el ensayo.

Criterios de aceptaciónValor de corte sugerido
Numérico
IC50 del punto de referencia [M]1*10-05 - 1*10-06
CV del log IC50 estimación del elemento de referencia [%]< 3
Control negativo IRA [%]80 - 120
Control positivo IRA [%]20 <
Z'-Factor> 0,5
Binario
Forma del elemento de referencia (¿sigmoidal?)Sí
La curva final concentración-respuesta del ítem de referencia está compuesta por un mínimo de seis concentraciones a partir de tres réplicasSí
La curva final concentración-respuesta del ítem de prueba está compuesta por un mínimo de seis concentraciones a partir de tres réplicasSí

Tabla 4: Criterios de aceptación para el ensayo DIO1 SK. Esta tabla enumera los criterios de aceptación para la validez del ensayo, como el rango de IC₅₀, el coeficiente de variación, los valores IRA para controles, el factor z y los requisitos para curvas concentración-respuesta. Las ventanas de aceptación se derivaron de estudios de validación DIO1-SK previamentereportados 6, incluyendo una evaluación de reproducibilidad basada en cinco ejecuciones independientes que informaron la ventana de referencia IC₅₀. En un conjunto de datos de ejemplo de 10 ejecuciones independientes, el rendimiento en el factor z osciló entre 0,544 y 0,774 (media ± DS: 0,658 ± 0,062), apoyando el umbral de aceptación z′ utilizado aquí.

Categoría (por eficacia)Subcategoría (por potencia)Actividad inhibidoraUmbral
Categoría 1: inhibidor totalR: Inhibidor completo potenteInhibe completamente la actividad de DIO1 a una concentración comparable al ítem de referencia 6-PTUInhibición máxima. mayor 90% y IC50 en o por debajo del rango superior de IC50 de 6-PTU
B: Inhibidor total débilInhibe completamente la actividad de DIO1 a concentraciones más altas que el ítem de referencia 6-PTUInhibición máxima, mayor 90% y IC50 por encima del rango superior de IC50 de 6-PTU
Categoría 2: inhibidor parcial-Sin inhibición completa, pero sí mayor que el control negativo y el disolventeInhibición máxima entre el 25% y el 90%
Categoría 3: no inhibitor-No inhibe DIO1 (igual que el control negativo y el disolvente)Inhibición máxima por debajo del 25%

Tabla 5: Clasificación de los elementos de prueba según la potencia y eficacia de la inhibición de DIO1. Los ítems de la prueba se clasifican en tres grupos de eficacia (completo, parcial o no inhibidor) según su máxima inhibición de la actividad de DIO1. Los inhibidores completos se subcategorizan además por potencia, dependiendo de su IC₅₀ en relación con el ítem de referencia 6-PTU.

Discusión

El ensayo DIO1-SK ofrece una alternativa no radiactiva, rentable y escalable a los métodos tradicionales para evaluar la actividad de DIO1, como los ensayos radiomarcados o la espectrometría de masas. Su prevalidación para microsomas hepáticos humanos y su fuerte concordancia con las mediciones SPE-LC-MS/MS de los niveles de hormonas tiroideas confirman su fiabilidad y relevancia regulatoria, como refleja su inclusión en el plan de trabajo de la OCDE para la guía de pruebas. La simplicidad de la reacción Sandell-Kolthoff (SK) hace que el ensayo sea accesible para laboratorios sin instrumentación avanzada.

En el protocolo actual, varios aspectos prácticos se especificaron con mayor detalle en comparación con los procedimientos DIO1-SK previamente publicados para apoyar aún más la robustez y reproducibilidad en un formato rutinario de 96 pozos. Estas aclaraciones se centran en la lógica del concepto de control (controles de disolvente, negativo y positivo), la decisión de usar placas de resina de intercambio iónico recién preparadas en lugar de reutilizar placas previamente fundidas, y las condiciones de reacción SK que mejoran la robustez en el manejo en mediciones de placas multipozo, manteniendo la interpretación biológica consistente con el trabajo previode estandarización 6,7.

A pesar de sus fortalezas, deben abordarse varios pasos críticos para cuantificar con precisión el yoduro liberado durante la conversión mediada por DIO1 de rT3 a T2. Esto se consigue mediante la reacción de Sandell-Kolthoff, que requiere un timing preciso y un manejo consistente de los reactivos para garantizar la reproducibilidad. La reacción SK es un proceso catalítico rápido en el que el yoduro acelera la reducción del cerio amarillo (IV) a cerio incoloro (III) mediante el arsenito; La velocidad de cambio de color es directamente proporcional a la concentración de yoduro. Dado que la reacción avanza rápidamente una vez añadida la solución de arsénico, es esencial que la medición se inicie sin demora. En un formato de placa de 96 pozos, la adición lenta o inconsistente de la solución de arsénico puede introducir una variabilidad significativa entre pozos. Por ello, se recomienda encarecidamente el uso de una pipeta multicanal o un dispensador automatizado para asegurar una adición uniforme y rápida de reactivos en todos los pozos.

Para maximizar la comparabilidad entre pozos y placas, el orden de adición de reactivos en la reacción SK debe mantenerse consistente con el flujo de trabajo descrito: el cerio está presente como sustrato cromogénico, y la reacción se inicia mediante la adición de arsenita, que define el tiempo de inicio y, por tanto, requiere una dispensación rápida y sincronizada. Las órdenes alternativas de adición de reactivos no se evaluaron en esta configuración; por tanto, no se recomienda cambiar el orden al reproducir el protocolo. Además, la concentración de cerio puede influir en las características prácticas de rendimiento de la lectura SK (por ejemplo, ventana de señal y robustez). Mientras que 25 mM de cerio se definió como condición estándar validada durante la estandarización de ensayos anteriores, concentraciones más altas como 40 mM demostraron aumentar la ventana de señal y el factor z′ sin afectar los valores de IC50 ni la interpretación biológica, como ya se describió en trabajosprevios 6. En este protocolo, se utiliza 40 mM de cerio para asegurar una complejación completa y rápida de yoduro bajo las condiciones del ensayo y para mejorar la robustez y la estabilidad de la señal en mediciones rutinarias basadas en placas. Los criterios de aceptación (por ejemplo, factor z, valoresIC 50 del inhibidor de referencia) se basan en el rendimiento histórico observado en estudios de validación previos y están destinados a ser una comprobación rutinaria del rendimiento del ensayo.

El uso de microsomas hepáticos humanos introduce variabilidad biológica, haciendo esencial la estandarización de la actividad de liberación de yoduro específica por lote de microsomas. Es necesaria una preparación cuidadosa de placas filtrantes rellenas de resina de intercambio iónico para evitar una distribución desigual de la resina a lo largo de la placa filtrante y asegurar la separación completa del yoduro de sustancias potencialmente interferentes. En cuanto al flujo de trabajo de resina, se eligieron placas filtrantes recién coladas con resina de intercambio iónico para minimizar el riesgo potencial de variabilidad adicional derivada de la saturación de resina, la acumulación de yoduro o proteínas, y la posible pérdida de eficiencia de unión al reutilizarla. Técnicamente es factible reutilizar resina y placas filtrantes, aunque podría conllevar algunos riesgos que no se evaluaron sistemáticamente en este estudio. Puede introducir deriva de lote a lote si la capacidad de unión de resina se reduce o si los componentes residuales de la matriz permanecen en el lecho de resina tras las tiradas previas. Para los laboratorios que consideran el reciclaje, una recomendación pragmática es validar el rendimiento de la resina tras la reutilización (por ejemplo, monitorizando el comportamiento de fondo y de curvas estándar y asegurando una captura consistente de yoduro) y suspender la reutilización si se observa un aumento del fondo, una reducción del rango dinámico o una separación inconsistente. Se recomienda utilizar placas filtrantes rellenas de resina para un solo uso, ya que este protocolo ha sido desarrollado específicamente a partir de esa metodología.

Además, la solubilidad de cada elemento de prueba debe determinarse en un vehículo adecuado, ya que la concentración máxima testada está limitada por la solubilidad (normalmente hasta 1 mM con 1% de DMSO). Dado que todos los compuestos de ensayo se aplican en DMSO como disolvente, el control del disolvente define la actividad base de DIO1 bajo condiciones relevantes para el ensayo y sirve como la condición de referencia más adecuada para la normalización y comparación. En contraste, la sal sódica 1-tio-β-D-glucosa se incluyó como control negativo porque es estructuralmente similar a la aurothioglucosa control positiva (ATG), pero químicamente inerte respecto a la desiodinación de iodotironina y no interfiere con los sistemas redox microsomales ni con la actividad catalítica de DIO1. Su inclusión ayuda a distinguir los verdaderos efectos específicos de DIO1 de los efectos no específicos relacionados con la adición, el manejo o las interacciones de la matriz de ensayos. No se utilizó un control de no tratamiento/no vehículo como condición de referencia principal porque no reflejaría el entorno real de ensayo en el que la DMSO está presente en todos los pozos tratados con compuestos; Por lo tanto, el control del disolvente es la referencia relevante para la interpretación del ensayo.

La resolución de problemas se centra en identificar interferencias en la reacción de SK. Las sustancias que contienen yodo, quelantes o fuertemente oxidantes pueden afectar artificialmente la lectura colorimétrica 14,17,18. Para abordar esto, el protocolo incluye pruebas de interferencia sin microsomas. Además, el uso de ditiotreitol (DTT) como cofactor también puede provocar la liberación de yoduro no enzimático de ciertas sustancias test. En tales casos, se recomiendan métodos ortogonales como SPE-LC-MS/MS para confirmar la inhibición de DIO1. La interferencia inespecífica mediante efectos generales de desnaturalización (por ejemplo, tensioactivos) puede generar falsos positivos, por lo que una estrategia general para identificar los que golpean con frecuencia, utilizando herramientas in silico o enfoques de prueba integrados, puede ser valiosa.

El ensayo tiene varias limitaciones. Es susceptible a interferencias de sustancias de prueba que reaccionan con componentes del ensayo o liberan yoduro independientemente de la actividad de DIO1. El ensayo no distingue entre la inhibición específica de DIO1 e interferencia inespecífica con la función enzimática o la integridad estructural. Para mejorar la especificidad, la inhibición de enzimas microsomales adicionales puede analizarse en paralelo, y comparar potencias inhibitorias entre diferentes ensayos enzimáticos puede aportar más evidencia.

Otra estrategia para identificar posibles artefactos es incluir pruebas de integridad o viabilidad, como las que se realizan comúnmente en ensayos in vitro basados en células, para definir la concentración máxima de prueba. Aunque falta una prueba directa de integridad para el ensayo DIO1-SK, su uso dentro de una batería de prueba in vitro permite la integración de datos de citotoxicidad de otros ensayos celulares para informar la selección de concentraciones. Si no se dispone de dicha información cruzada, la concentración superior en el ensayo DIO1-SK está limitada por la solubilidad, que puede no reflejar exposiciones relevantes in vivo. Sin embargo, los enfoques toxicocinéticos pueden utilizarse para definir e interpretar mejor las concentraciones de pruebas in vitro.

El ensayo DIO1-SK es especialmente valioso en el cribado toxicológico y en estudios mecanicistas de alteraciones endocrinas. Aborda un evento clave en la homeostasis de la hormona tiroidea y puede integrarse en baterías de pruebas in vitro. Su robustez, reproducibilidad y adaptabilidad a diferentes entornos de laboratorio y necesidades de rendimiento la convierten en una herramienta valiosa para la evaluación de la seguridad química y la validación regulatoria. El ensayo proporciona una medida in vitro robusta de la inhibición de DIO1 bajo condiciones estandarizadas y apoya la clasificación de sustancias de prueba en relación con un inhibidor de referencia bien caracterizado (6-PTU). Sin embargo, los datos in vivo sobre la inhibición de DIO1 son escasos, y la correlación directa entre los resultados de inhibición in vitro de DIO1 y los efectos in vivo no es actualmente aplicable para estimar la predictividad in vivo. Por tanto, los resultados de los ensayos deben interpretarse como evidencia mecanicista de interferencia con un evento clave en el metabolismo de la hormona tiroidea e integrarse con líneas adicionales de evidencia (por ejemplo, otros ensayos de MoA tiroideo y mediciones ortogonales cuando sea necesario). Es importante destacar que el ensayo DIO1–SK ha sido evaluado en múltiples estudios orientados a la validación (optimización/estandarización, evaluación predictiva y análisis de robustez/precisión)6,7,15, y a medida que el método avanza hacia la implementación de la OCDE, el presente artículo proporciona un nivel de detalle procedimental paso a paso destinado a facilitar la transferencia e implementación consistente entre laboratorios adicionales.

Divulgaciones

Los autores K.S., N.H, D.F.-W. y R.L. son empleados de BASF SE, una empresa química que podría utilizar el ensayo DIO1 para desarrollar y registrar productos comerciales en el futuro.

Agradecimientos

Los autores quieren agradecer al Dr. Andreas Weber por su trabajo durante la creación inicial del ensayo DIO1-SK.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-Tio-β-D-glucosa sal sódicaSigma-AldrichT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-triiodotironina (rT3) Santa Cruz BiotecnologíaSC-209692CAS 5817-39-0
6-propil-2-tiouracilo (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
Ácido acéticoThermo Fisher9526-33CAS 64-19-7
Balance analíticoNANACapaz de pesar con precisión hasta 30 g con 0,1 mg de legibilidad
Óxido de arsénico sódico (NaAsO2)Thermo Fisher041533.APCAS 7784-46-5
Placas de ensayo (formato de 96 pozos)MerckZ707902-108EApor ejemplo, placas de cultivo de tejidos, placa de 96 pozos, fondo plano, poliestireno, 0,34 cm2, estéril, 108/cs, TPP
Aurothioglucosa (ATG)Sigma-AldrichA0606-5MGCAS 12192-57-3
Tubos de centrifugadora 15 y 50  mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EApor ejemplo, tubos de centrifugadora TPP, volúmenes 15 y 50 mL, polipropileno y nbsp;
Centrífuga con rotor abatible para placas de microtitulaciónNANADebería ser lo suficientemente alta para caber una placa de pozo de 96 de profundidad con una placa filtrante de 96 pozos encima (al menos unos 6 cm de alto).
Sulfato de amonio de cerio (IV) (Ce(NH4)4(SO4)4)Sigma-Aldrich22269-100G-FCAS 10378-47-9
Incubadora de CO2NANAcapaz de mantener temperaturas de 37°C; C, 5% de CO2 y ≥ 90% de humedad
Placas de pozo profundo (formato de 96 pozos)Supelco575653-Upor ejemplo, SPE 96-Deep Square Well Collection Plate, volumen de pozo 2 mL, polipropileno
Dimetilsulfóxido (DMSO)AppliChemA3672.0250CAS 67-68-5
Ditiotreitol (TDT)Sigma-AldrichD9779-1GCAS 3483-12-3
Ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) y nbsp;Sigma-AldrichAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Placas de filtro (formato de 96 pozos)MerckWHA77002810por ejemplo, Micro-Placas, 96-pozos, poliestireno transparente, 800 y micro; L, unión de ADN, Whatman
Selladores de placas herméticos al gasThermo Fisher232698por ejemplo, cinta de sellado, poliéster, estéril, cinta de sellado, poliéster, estéril, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
Microsomas hepáticos humanosBiovitX008070por ejemplo, INVITROCYP 150-Microsomas hepáticos humanos agrupados por donantes
Yoduro (estándar de CI)Supelco41271-100MLpor ejemplo, estándar de yoduro para CI, 1000 mg/L en agua, Sigma-Aldrich
Resina de intercambio iónico como la Dowex 50WX2Roth334.4CAS 12612-37-2; Malla 100-200
Tubos microcentrífugas 1.5  mLMerckEP0030120086-1PAKpor ejemplo, Eppendorf & reg; Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, volumen 1,5 mL, naturales
Dispensador multicanal capaz de entregar entre 50 y 300 y 300 Mbps; & micro; L por pasoNANANA
Pipeta multicanal capaz de entregar de 10 a 100 a 100 nbsp; & micro; L por pasoNANANA
Medidor de pH con electrodo y buffers de calibraciónNANAcapaz de leer +/- 0,1 unidades de pH
Fotómetro para medición de absorbanciaTecan Trading AGNApor ejemplo, Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Pipetas capaces de entregar de 1 a 10  & micro; LNANANA
Pipetas capaces de entregar entre 10 y 100 nbsp; & micro; LNANANA
Pipetas capaces de entregar entre 100 y 1000   & micro; L NANANA
Pipetas para volúmenes superioresNANApipetas serológicas, por ejemplo, 10, 25, 50 mL
Agitador de platosThermo FisherNApor ejemplo, placa de microtitulación Thermo Scientific H+P monoshake vortexer, controlada directamente
Pipeta repetidoraNANANA
Cloruro de sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9888-25GCAS: 7647-14-5, por ejemplo, cloruro de sodio, reactivo ACS, etc; 99.0 %
Software de estadísticaNANACapaz de realizar análisis de regresión que refleje características del ensayo y capaz de calcular concentraciones inhibitorias, por ejemplo, GraphPad Prims 8, GraphPad
Ácido sulfúrico (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Matraz volumétricoNANAcertificado con volumen definido

Referencias

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