In Vivo Observación no invasiva de cambios dinámicos en el eje capilar, melanina y colágeno durante el ciclo del folículo piloso de ratones

Resumen

Este estudio presenta un método no invasivo in vivo que utiliza microscopía de generación de dos fotones y segundo armónico para monitorizar longitudinalmente la morfología del tallo capilar, la dinámica de la melanina y la densidad del colágeno dérmico a lo largo de todo el ciclo folicular piloso en ratones, proporcionando un marco metodológico sólido para la investigación terapéutica sobre la caída del cabello.

Resumen

Las evaluaciones tradicionales del ciclo del folículo piloso se basan en métodos histológicos invasivos, limitando la observación longitudinal continua. Se planteó la hipótesis de que la imagen óptica no invasiva, especialmente la fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF) y la generación de segundo armónico (SHG), pueden rastrear y cuantificar con precisión los cambios dinámicos in vivo en los tallos capilares, la melanina y el colágeno a lo largo de múltiples ciclos de folículos pilosos. Los tallos de pelo de ratones C57BL/6 fueron monitorizados in vivo durante las fases anagen, catágeno y telógeno mediante dermoscopía, fotografía y microscopía electrónica. Específicamente, se usó TPEF bajo excitación de 800 nm e imagen para cuantificar la dinámica de la melanina, mientras que SHG bajo excitación de 950 nm se empleó para observar cambios de colágeno interfolicular. Para garantizar la precisión, se validaron cruzadas las mediciones ópticas in vivo: la dinámica de la melanina se confirmó mediante fotografía cutánea para la apariencia general del tejido y tinción de hematoxilina y eosina (HE) para la expresión del bulbo piloso, mientras que los cambios en colágeno se validaron evaluando la densidad y orientación de las fibras mediante un sistema de imagen polarizadora de cristales líquidos en secciones teñidas con Sirius Red. Las observaciones de los hallazgos demostraron que durante la fase anágena, el diámetro del tallo del cabello y la producción de melanina aumentaron progresivamente, acompañados de una reducción significativa en la densidad de colágeno interfolicular. Durante las fases catágeno y telógeno, los niveles de melanina disminuyeron gradualmente y la densidad de colágeno se recuperó gradualmente hasta niveles basales. Este proyecto establece una metodología in vivo validada y no invasiva para evaluar la dinámica integral de los folículos pilosos, proporcionando un marco experimental sólido para la evaluación preclínica de agentes activos en tratamientos contra la caída del cabello.

Introducción

Los folículos pilosos de ratones C57BL/6 muestran sincronía y regularidad, lo que ofrece conveniencia experimental y los convierte en un modelo animal común para el estudio de enfermedades^{cutáneas 1,2}. Los folículos pilosos entran en la segunda fase telógena en la séptima semana después del nacimiento del ratón C57BL/^{6 3}. En ausencia de intervención artificial, esta fase telógena se mantendrá hasta la duodécima semana después del^{nacimiento 4}. Este periodo prolongado de telógeno es un punto temporal habitual en la investigación para sincronizar el ciclo de crecimiento del folículo^{piloso 5}. Tras la depilación artificial de los ratones, los folículos pilosos comienzan inmediatamente a entrar en la fase^{anágena 6}.

Tras entrar en la fase de crecimiento, las células madre en la región de la protuberancia proliferan y se diferencian en la vaina radicular externa, creciendo hacia abajo para aumentar la longitud del^{folículo 7}. La base del tallo capilar se extiende hacia arriba a medida que el folículo se^profundiza. Las células madre del bulbo se diferencian continuamente en el tallo del cabello y la vaina interna^{de la raíz 9}. La secreción de colágeno y melanina en la piel también cambia rápidamente durante la fase^{anágena 10}, desempeñando un papel importante en el desarrollo del folículo^{piloso 11,12}. En estudios relacionados con la caída del cabello, la secreción de melanina generalmente se evalúa mediante el color de la piel, lo que no permite una cuantificación precisa¹³. Hasta la fecha, la investigación sobre el colágeno se ha centrado predominantemente en el desarrollo y el envejecimiento más que en la dinámica cíclica de la cuantificación.

Actualmente, una limitación importante en la evaluación de ciclos de folículos pilosos y terapias regenerativas es la dependencia de los objetivos histológicos destructivos, lo que obliga a sacrificar diferentes cohortes de animales en momentos^{específicos 14}. Esto evita el seguimiento longitudinal continuo del mismo microambiente folicular a lo largo de varios ciclos. Además, las técnicas convencionales no invasivas como la dermatoscopia carecen de suficiente penetración tisular para visualizar los cambios foliculares^{profundos 15}, y la observación macroscópica no cuantifica con precisión la melanina, lo que dificulta la detección de la raíz del pelo club deficiente en melanina durante las fases de regresión tardía y^{reposo 16,17}. Mientras que diversas tecnologías ópticas han avanzado la observación longitudinal in vivo ^18,19, como la polarimetría de cristales líquidos para evaluar fibras de colágeno^20,21, la microscopía confocal cutánea para observar la^{pigmentación 22,24} y la tomografía de coherencia óptica para medir el grosor de la^piel 25,26,27 , la microscopía multifotónica ofrece una solución singularmente convincente. El uso combinado de fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEF) y generación de segundo armónico (SHG) ofrece ventajas claras: permite una sección óptica de alta resolución y sin etiquetas profundamente en la dermis, permitiendo la cuantificación simultánea in vivo de la autofluorescencia de melanina y la arquitectura de fibras de colágeno sin tintes exógenos^28,29. En este estudio, los autores plantean la hipótesis de que la imagen no invasiva de TPEF/SHG puede cuantificar dinámica y con precisión estos cambios estructurales con una precisión comparable a los estándares de oro histológicos invasivos. Al abordar este problema científico clave, este estudio pretende establecer un marco robusto y longitudinal de imagen in vivo para apoyar la evaluación no invasiva de agentes terapéuticos para la alopecia³⁰.

Protocolo

Todos los métodos que implican el uso de sujetos vertebrados se realizaron cumpliendo con las directrices institucionales. Todos los procedimientos experimentales en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Centro de Investigación Experimental de la Academia China de Ciencias Médicas China (Código de Protocolo: ERCCACMS11-2210-03). Todos los materiales utilizados en este estudio están listados en la Tabla de Materiales.

Preparación animal y observación macroscópica
Los ratones machos C57BL/6, de 6 a 7 semanas y con un peso de 20 ± 2 g, fueron obtenidos de un proveedor comercial. Los ratones se dividieron en una cohorte de análisis histológico (n = 39) y una cohorte continua de imagen in vivo (n = 3). El vello dorsal de todos los ratones se depiló para sincronizar el ciclo del folículo piloso. El estado del crecimiento del cabello se examinó día sí uno y otro no, desde el día 2 hasta el día 26 tras la depilación. La parte trasera de los ratones de la cohorte de imágenes fue fotografiada día sí sí día por medio hasta el día 26 con una cámara. Se mantuvo una distancia focal fija de 15 cm y se aseguraron condiciones de iluminación ambiental estándar y consistentes en el laboratorio para documentar con precisión los cambios macroscópicos.

In vivo Imágenes TPEF y SHG
Las sesiones de imagen se realizaron en los días 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26 tras la depilación. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano. La pérdida total de conciencia se aseguraba observando la frecuencia respiratoria y probando el reflejo del pie con un suave pellizco en el dedo del pie. El ratón anestesiado fue fijado en el escenario de un microscopio de dos fotones. Para la imagen TPEF de melanina, el microscopio estaba equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25x (apertura numérica = 1,05), y la longitud de onda de excitación se ajustó a 800 nm. Se realizó un escaneo en pila z de la autofluorescencia de melanina, alcanzando una profundidad total de barrido de 45 μm. El tamaño del paso se estableció en 2 μm, la resolución de imagen en 1.024 × 1.024 píxeles y la velocidad de adquisición en 4 μs/píxel. Para la imagen SHG de fibras de colágeno, la longitud de onda de excitación se ajustó a 950 nm usando el mismo objetivo de inmersión en agua de 25x. Se inició un escaneo en pila z desde la superficie superior de la dermis hasta una profundidad total de 45 μm, manteniendo un tamaño de paso de 2 μm, una resolución de imagen de 1.024 × 1.024 píxeles y una velocidad de adquisición de 4 μs/píxel. Tras la sesión de imagen, el ratón fue cuidadosamente retirado de la etapa de microscopio, se suspendió el isoflurano y se colocó sobre una almohadilla térmica hasta recuperar completamente la conciencia antes de ser devuelto a la jaula de casa.

Recogida de tejidos y procesamiento histológico
Una cohorte distinta y separada de tres ratones del grupo histológico fue eutanasiada día sí y día alterno, desde el día 2 hasta el día 26, según las directrices institucionales, asegurando que ningún ratón se reutilizara para muestreos histológicos longitudinales. Se extirpó quirúrgicamente una muestra de tejido dorsal de 2 cm × 2 cm de espesor completo, centrada precisamente en la intersección de las líneas medias horizontales y verticales en la espalda de cada ratón. El tejido cutáneo extirpado se colocó plana sobre una tarjeta dura para evitar que los bordes se enroscaran y se sumergió inmediatamente en un tubo de ensayo que contenía un 4% de paraformaldehído. Los tejidos fijos se deshidrataron e incrustaron para preparar secciones de parafina de 6 μm de grosor. Antes de desencerar, las secciones de parafina se calentaron con un calentador de corredera durante 120 minutos. Las secciones se teñieron con hematoxilina y eosina (HE) y Sirius Red usando kits de tinción estándar según las instrucciones del fabricante. Las secciones se montaron con goma neutra y se observaron usando un microscopio invertido. Para la imagen polarizada por cristales líquidos, las secciones desenceradas y teñidas con Sirius Red fueron fotografiadas bajo un microscopio de luz polarizada. Se estableció un ángulo unificado del polarizador cruzando el polarizador y el analizador exactamente a 90° para lograr un fondo máximo oscuro (estado de extinción), y este ángulo específico se bloqueó consistentemente en todas las capturas de imagen posteriores.

Dermoscopía in vivo y microscopía electrónica de los tallos capilares
Antes de arrancar, la zona dorsal del crecimiento del vello se evaluó in vivo mediante un dermatoscopio clínico con un aumento de 20 veces. La regeneración del cabello se cuantificó usando un sistema estándar de puntuación 0–3 basado en la emersión y densidad del tallo capilar (0 = sin pelo visible; 1 = aparición escasa de cabello; 2 = densidad moderada; 3 = denso y con cobertura completa del cabello). Para asegurar un muestreo imparcial, el área depilada dorsal de cada ratón se dividió visualmente en cuatro cuadrantes iguales. Se utilizó un generador de números aleatorios para seleccionar dos cuadrantes por ratón, y se arrancaron firmemente cinco filamentos de cabello recién crecidos de cada cuadrante seleccionado usando pinzas estériles. Los tallos de pelo arrancados se sumergieron inmediatamente y fijaron en glutaraldehído al 2,5% en un tampón fosfato de 0,1 M (pH 7,4) durante 4 horas a 4 °C para preservar la ultraestructura. Los tallos fijos del cabello se lavaron tres veces en un tampón fosfato de 0,1 M y se deshidrataron secuencialmente a través de una serie de etanol graduado (50%, 70%, 80%, 90% y 100%) durante 15 minutos en cada concentración, seguido de un secado en punto crítico usando_CO2 líquido. Los tallos secos del pelo se montaban horizontalmente sobre cinta de carbono conductora de doble cara unida a los muñones de aluminio. Las muestras fueron recubiertas con sputter con una capa de oro de 10 nm utilizando un recubrimiento de pulverización al vacío durante 60 segundos para evitar la carga electrónica. Las muestras recubiertas se insertaron en un microscopio electrónico de barrido y se observaron los tallos del cabello usando un voltaje acelerador de 5,0 kV. Los cambios morfológicos ultramicroscópicos se evaluaron sistemáticamente capturando imágenes a aumentos de 500x y 1.000x, documentando específicamente el diámetro del eje del cabello y la integridad y disposición estructural de las escamas cuticulares.

Análisis de datos y estadística
Los parámetros de imagen se midieron y cuantificaron utilizando software genérico de análisis de imágenes. Todos los análisis estadísticos y representaciones gráficas se realizaron utilizando software estándar de análisis estadístico. Para datos de monitorización continua in vivo obtenidos de los mismos animales en múltiples momentos temporales, se determinó la significación estadística mediante análisis de varianza por medidas repetidas (RM-ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni. Para los datos histológicos con muestras independientes de animales, se utilizó una ANOVA unidireccional ordinaria seguida de la prueba post-hoc de Tukey para evaluar diferencias estadísticas. Todos los resultados se expresaron como la media ± desviación estándar (DS). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en *p < 0,05, p < 0,01 y ***p < 0,001.

Resultados

Observación del pelo de ratón
Las observaciones fotográficas del crecimiento del vello murino se presentan en la Figura 1A. La aparición del vello a través de la superficie cutánea comenzó en el día 10, manteniendo el desarrollo continuo entre el día 12 y el día 16 (p < 0,05). La cobertura capilar se estabilizó posteriormente desde el día 18 hasta el día 26 (p > 0,05) (Figura 1B). Además, la...

Discusión

Se eligió el modelo de ratón C57BL/6 porque su segunda fase telógena dura de forma estable desde la semana 7 hasta la semana 12. Dado que la ventana de observación de 26 días se encuentra íntegramente dentro de esta fase estática, los profundos cambios dinámicos observados están explícitamente impulsados por la progresión del ciclo inducida por la depilación, excluyendo por completo las fluctuaciones naturales relacionadas con la edad. Cuando la depilación se realiza durante la fase teló...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
C57BL/6 mice,	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	SCXK (Jing) 2021-0006	Usado para modelos animales
Cámara digital DSLR	Canon	EOS 80D	Utilizado para tomar fotos del dorso de los ratones
Kit de tinción H&E	LtdSolarbio Science & Technology Co.	G1120	Usado para teñir secciones de tejido
Microscopio invertido	Olympus	BX51	Utilizado para tomar fotos
lsoflurano	RWD Life Science Co.	R510-22-16	Utilizado para anestesiar animales
Mai Tai DeepSee	SpectraPhysics	Mai Tai HP	Usado para TPEF e imagen in vivo de SHG
Dermatoscopio electrónico médico	China Chuanghong Medical Technology Co.	CH-DSIS-2000	Usado para imagen in vivo del color de la piel
Microscopio de luz polarizada	Olympus	BX51-P	Utilizado para la imagen de tinción de Sirius Red
Microscopio electrónico de barrido (SEM)	Hitachi High-Tech Corporation	SU8010	Para la observación de la ultraestructura de la fibra capilar
Kit de tinción Sirius Red	Solarbio	G1472	Para la tinción de fibras de colágeno
Máquina de anestesia para animales pequeños	RWD Life Science Co.	R500	Usado para anestesiar animales