Artículo de método

Establecimiento de un modelo de inmunosupresión inducida por sepsis en ratones mediante la instilación intranasal de bacterias

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DOI:

10.3791/70150

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12 de junio de 2026

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1Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Burns and Combined Injury, Army Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Daping Hospital, Army Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para establecer un modelo de inmunosupresión de sepsis en ratón mediante la instillación intranasal de Klebsiella pneumoniae y validamos el modelo mediante diversos indicadores.

Resumen

La sepsis es una insuficiencia orgánica potencialmente mortal causada por la respuesta inapropiada del huésped a la infección. La neumonía es la causa principal de sepsis. Los modelos animales son herramientas importantes para estudiar la patogénesis de la sepsis y evaluar nuevas estrategias de tratamiento. Los modelos animales anteriores de sepsis carecían de vías naturales de infección, lo que dificultaba reflejar con precisión el proceso clínico de infección.

Este estudio introdujo un modelo de inmunosupresión de sepsis en ratones establecido por instillación intranasal de Klebsiella pneumoniae (KP) para simular la vía natural de infección respiratoria. Tras modelar con diferentes concentraciones de KP, se evaluó la inflamación del modelo a las 12 horas para los niveles de interleucina-6 de citocinas (IL-6), y el daño en órganos a las 24 horas se evaluó para los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), creatina quinasa (CK) y nitrógeno urea en sangre (BUN). La tasa de supervivencia del modelo se analizó tras 7 días. El porcentaje de linfocitos y glóbulos blancos, la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II) en monocitos y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de IL-10 y TGF-β1 en células T CD4+ se observaron para evaluar la inmunosupresión en ratones. Tras 7 días de modelado, se realizó una infección secundaria mediante la instillación intranasal de Pseudomonas aeruginosa (PA). Se evaluaron la carga bacteriana en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) 24 horas después de la infección secundaria y la tasa de mortalidad en un plazo de 14 días para evaluar más a fondo la inmunosupresión del modelo.

La instillación nasal de Klebsiella pneumoniae de alta concentración puede inducir eficazmente una inmunosupresión. Su propósito es simular la sepsis inducida por una vía natural de infección respiratoria y proporcionar un modelo estándar para la investigación sobre sepsis en animales.

Introducción

La sepsis es una insuficiencia orgánica potencialmente mortal que resulta de la respuesta inapropiada del huésped a la infección 1,2,3. Es una de las principales causas de muerte en las unidades de cuidados intensivos (UCI). A nivel mundial, hay 48,9 millones de casos de sepsis anuales, con 11 millones de muertesasociadas 4. A pesar de los avances recientes en la terapia antiinfecciosa y las tecnologías de soporte orgánico, la patogénesis de la sepsis sigue siendo incompletamente comprendida y faltan opciones específicas de tratamiento. Por ello, la sepsis se ha convertido en un foco y desafío clave en la investigación médicaclínica 4.

Los modelos animales desempeñan un papel insustituible en la investigación médica básica y traslacional, sirviendo como herramientas esenciales para investigar la patogénesis de la sepsis y evaluar nuevas estrategias terapéuticas. Al simular los procesos fisiopatológicos de la sepsis humana, estos modelos no solo facilitan la exploración de mecanismos clave como los trastornos inmunitarios y la disfunción orgánica, sino que también proporcionan una plataforma experimental para el cribado de fármacos y el desarrollo de estrategias de intervención. Entre los diversos modelos animales, los ratones son los más utilizados en la investigación sobre la sepsis debido a su bien definido trasfondo genético, su extensa investigación sobre su sistema inmunitario y su facilidad de manipulación.

Actualmente, existen varios modelos animales de sepsis basados en diferentes paradigmas, incluyendo modelos de endotoxinas, modelos de infusión bacteriana, modelos de ligadura y punción cecal (CLP) y modelos de peritonitis por stent de colon ascendente (CASP) 5. Sin embargo, estos modelos carecen de vías naturales de infección, lo que dificulta reflejar realmente el proceso clínico de infección. Los estudios han informado que la neumonía es la causa principal de sepsis en EstadosUnidos. Por tanto, establecer un modelo de sepsis en ratón que imite las vías naturales de infección, muestre características inmunosupresorias y sea fácil de operar con alta reproducibilidad es de gran importancia para la investigación profunda sobre los mecanismos inmunolatos de la sepsis y para evaluar posibles estrategias de intervención.

Klebsiella pneumoniae (KP) representa entre el 3% y el 8% de todas las infecciones bacterianashospitalarias 7,8,9. Esta bacteria puede entrar en el cuerpo a través de diversas puertas, incluyendo las vías respiratoria, gastrointestinal y urinaria, así como la piel, y las infecciones causadas por la KP tienen un pronóstico negativo, especialmente en pacientesinmunodeprimidos 7,10. Dado que la neumonía es la principal causa de sepsis y la KP es un patógeno respiratorio común asociado a malos resultados, la KP es un candidato ideal para establecer un modelo clínicamente relevante de sepsis.

Aunque se han establecido previamente una variedad de modelos animales de infección por KP, incluido el método intranasal, solo unos pocos estudios se han centrado en optimizar el modelo para inducir la inmunosupresión asociada a sepsis o en definir la concentración óptima de KP para el establecimiento del modelo. Esta carencia limita la utilidad de los modelos KP existentes para estudiar la disfunción inmunitaria inducida por sepsis.

Para responder a esta necesidad, establecimos un modelo de inmunosupresión inducida por sepsis en ratones mediante instillación intranasal de KP. En comparación con los modelos existentes, este modelo simula las vías naturales de las infecciones respiratorias. El modelo fue validado además para proporcionar un método para investigaciones posteriores.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos en este artículo fueron aprobados por el Comité de Bienestar y Ética de Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar (SCXK(PLA)20120031).

1. Animales experimentales

  1. Utiliza ratones C57BL/6 machos, de entre 8 y 10 semanas, con un peso de 23–28 g (Licencia Animal nº: SCXK (Xiang) 2019-0004). Aloja a los ratones en un entorno específico libre de patógenos (SPF) con acceso libre a comida y agua. Mantener las condiciones de alojamiento de la siguiente manera: temperatura ambiente de (24 ± 2ºC), humedad del 50%–55% y un ciclo claro-oscuro de 12 h/12 h.

2. Preparación bacteriana

  1. Usa una variedad adecuada. Aquí, utilice la cepa 43816 de la American Type Culture Collection (ATCC) de Klebsiella pneumoniae .
  2. Prepara un medio de cultivo adecuado (caldo Luria-Bertani [LB]).
  3. Prepara bacterias para la instillación.
    1. Elige una sola colonia y inócula en 5 mL de caldo, luego incuba durante la noche (12 h) en un shaker a 37 °C y 220 rpm.
    2. Transfiere el cultivo bacteriano nocturno a un caldo LB fresco y cultivo durante 3–4 horas hasta alcanzar la etapa de crecimiento de alta densidad (densidad óptica a 600 nm [OD600] ≈ 0,8).
    3. Después de diluir la solución bacteriana, toma 100 μL y añádelos al fondo del plato de cultivo que contiene el medio sólido de cultivo. Colócalo en una incubadora a 37 °C durante 12 horas, cuenta el número de colonias y obtén la concentración de KP a 2 × 109 UFC/mL, es decir,OD 600 ≈ 0,8.
    4. Ajusta la concentración de las bacterias usando una solución de NaCl al 0,9%. Prepara tres suspensiones bacterianas con concentraciones de 1 × 108 UFC/mL, 1 × 106 UFC/mL y 1 × 104 UFC/mL para su uso posterior.

3. Infección por instillación intranasal (Figura 1)

  1. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% a una dosis de 2 μL/g (Figura 1A,B).
  2. Cuando el ratón muestra una conciencia reducida pero conserva el reflejo de deglución, aspira 50 μL de la suspensión bacteriana (o solución de NaCl al 0,9% como control) usando una micropipeta.
  3. Sujeta suavemente el cuello del ratón con el pulgar colocado en la parte delantera del mástil y agarra suavemente el cuerpo del ratón con el resto de los dedos. Inclina la cabeza del ratón hacia atrás (Figura 1C).
  4. Inyecte lentamente la suspensión bacteriana en las fosas nasales del ratón usando una pipeta (aproximadamente 5–10 μL por gota). Introduce una gota en una fosa nasale a la vez (Figura 1D).
  5. Después de observar que el ratón ha inhalado la suspensión, levántalo rápidamente hacia arriba y luego bájalo lentamente para promover la inhalación de la suspensión hacia los bronquios (Figura 1E,F).
  6. Repite los pasos anteriores, alternando las instillaciones en la otra fosa nasal hasta que el ratón haya inhalado completamente la suspensión bacteriana de 50 μL.
  7. Si el ratón tose, suspira o no puede inhalar la solución bacteriana durante la operación, permite que descanse y observe. Cuando la situación se estabilice, continúa con el paso de inhalación para asegurarte de que el ratón inhale toda la solución bacteriana (o 0,9% de NaCl).
  8. Fija el ratón en posición supina sobre una placa inclinada a 60°. Si la temperatura de la habitación es baja, usa un calefactor para ayudar al ratón a recuperarse. Vigila al ratón hasta que se recupere completamente de la anestesia, luego devuélvelo a su jaula con condiciones óptimas de temperatura, suficiente agua y comida.

4. Evaluación del modelo

NOTA: Se establecieron cuatro grupos de modelos murinos mediante el método de instillación intranasal mencionado: el grupo control (grupo A, inculcado con PBS), el grupo de concentración 1 × 10de 4 KP (grupo B), el grupo de concentración de 1 × 10de 6 KP (grupo C) y el grupo de concentración de 1 × 10 de8 KP (grupo D). El modelo fue evaluado utilizando los siguientes métodos:

  1. Evalúa los indicadores inflamatorios a 12 horas.
    1. A las 12 horas tras la instillación intranasal de KP, se recoja sangre (≥ 300 μL) mediante punción cardíaca (n = 5 por grupo). Separa el suero mediante centrifugación (1000 × g, 10 min) y úsalo para la detección de la citocina interleucina-6 (IL-6).
  2. Evaluación de daños orgánicos en 24 horas
    1. A las 24 horas de la instillación intranasal de KP, se utiliza el suero para la detección de indicadores bioquímicos (n = 5 por grupo). Entre estos indicadores, se utilizan alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) para evaluar el daño hepático, creatina quinasa (CK) para daño muscular y nitrógeno urea en sangre (BUN) para daño renal.
  3. Evaluación de los síntomas
    1. Monitoriza diariamente el peso corporal del ratón y observa el estado del pelo, el nivel de actividad y otros parámetros.
  4. Citocinas y células inmunitarias de 7 días
    1. A los 7 días post-modelado (n = 10 [A/B], n = 15 [C], n = 40 [D]), se recoge sangre periférica mediante punción cardíaca para análisis de citometría de flujo y así evaluar los porcentajes de linfocitos, la porcentaje de expresión del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II) en monocitos, la intensidad media de fluorescencia (MFI) de IL-10 y TGF-β1 en células T CD4+ .
    2. Procesamiento de tejidos
      1. Mezclar muestras de sangre (100 μL) con tampón de lisis de glóbulos rojos (300 μL) a una proporción de volumen de 1:3. Tras 15 minutos de lisis de eritrocitos a temperatura ambiente, centrifugar la mezcla a 400 × g durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
      2. Suspender el pellet en 200 μL de tampón de lisis de glóbulos rojos (relación de volumen = 1:2) e incubar durante 10 minutos para la lisis secundaria.
      3. Tras otra centrifugación a 400 × g durante 5 minutos, se retira el sobrenadante y se vuelve a suspender el pellet en 100 μL de tampón de tinción celular.
      4. Añadir 1 μL de cada anticuerpo de citometría de flujo a las muestras. Brevemente, añadir CD45 para la tinción linfocita; CD45, CD116, Ly6G, Ly6C y anticuerpos MHC-II para la detección de MHC-II; Anticuerpos CD45, CD3, CD4, CD8 y CD25 para la medición de IL-10 y TGF-β1. La proporción de dilución para cada anticuerpo mencionado anteriormente es de 1:100.
      5. Incuba todas las muestras a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad. Después, añadir 1 mL de tampón de tinción de celdas y centrifugar a 400 × g durante 5 minutos; Descarta el sobrenadante.
      6. Para la detección de linfocitos y MHC-II, resuspender 400 μL de tampón de tinción celular antes del análisis de citometría de flujo.
      7. Posteriormente, realizar procedimientos para la detección de IL-10 y TGF-β1 siguiendo los pasos 4.4.2.8–4.4.2.12:
      8. Añade 1 mL de buffer de fijación e incuba las muestras a 4ºC en la oscuridad durante 60 minutos.
      9. Después de añadir 1 mL de tampón permanente, centrifuga la mezcla a 400 × g durante 5 minutos y descarta el sobrenadante.
      10. Resuspende el pellet celular en 100 μL de tampón de perm, seguido de la adición de 1 μL de anticuerpos Foxp3, IL-10 y TGF-β1. Incuba las muestras a 4 °C durante 30 minutos en la oscuridad.
      11. Después, añade 1 mL de tampón permanente y centrifuga a 400 × g durante 5 minutos antes de retirar el sobrenadante.
      12. Finalmente, resuspende las células en 400 μL de tampón de tinción celular y detecta mediante citometría de flujo.
    3. Estrategia de gating
      1. Para detectar linfocitos, excluye los restos y dobletes en la gráfica FSC-A/FSC-H. Identificar el total de leucocitos como eventos CD45⁺. Limita los linfocitos en función de un nivel bajo de FSC/SSC dentro de la población CD45⁺.
      2. Para detectar MHC-II, primero se colocan leucocitos de compuerta en FSC-A/SSC-A para excluir los residuos, seguido de la selección de células CD45⁺. Identificar las células mieloides como CD11b⁺, excluyendo neutrófilos por negatividad de Ly6G. Defina los monocitos clásicos como células Ly6G⁻ Ly6Chi y evalúe la expresión de MHC-II dentro de esta población.
      3. Para detectar IL-10 y TGF-β1, excluir los escombros y dobletes de FSC-A/SSC-A y FSC-A/FSC-H. Identificar el total de células T como eventos CD45⁺CD3⁺. Dentro de la población CD4⁺CD8⁻, identificar los Tregs como células CD25⁺FOXP3⁺. Cuantifique las células TGF-β⁺ en el subconjunto Treg y evalúe la expresión de IL-10 en todas las células T CD4⁺. Configura todas las puertas positivas usando controles FMO.
  5. Recuento bacteriano en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) a las 24 horas después de la infección secundaria
    1. En el día 7 tras el establecimiento del modelo (n = 5 [A/B], n = 10 [C], n = 40 [D]), se somete al ratón a una instillación intranasal de 50 μL de Pseudomonas aeruginosa (PA) (a una concentración de 6,8 × 10UFC /mL) utilizando el método de instillación intranasal mencionado.
    2. A las 24 horas de la infección secundaria con PA, recoger 1,5 mL de líquido de lavado broncoalveolar (BALF). Diluir en serie el BALF, emplatarlo sobre un medio líquido LB e incubarlo en una incubadora a temperatura constante a 37 °C durante 24 horas antes de contar en colonias.
    3. Sigue estos pasos para la recogida de BALF.
      1. Anestesiar profundamente (2,5 μL/g 2% pentobarbital sódico) o eutanasiar (7,5 μL/g 2% pentobarbital sódico) humanamente y colócalo en posición supina con el cuello hiperextendido.
      2. Haz una incisión cervical en la línea media para exponer la tráquea. Inserta un catéter romo de 24-G en la tráquea justo más allá de la carina y insíjalo con una sutura.
      3. Inyecte y retira suavemente PBS estéril y helado (0,5 mL por cuocuo) usando una jeringuilla de 1 mL. Repite este ciclo de lavado 3–5 veces. Realiza este proceso 3 veces, resultando en un volumen total de lavado de 1,5 mL.
  6. Análisis de supervivencia
    1. Utilizar una cohorte separada de ratones para el análisis de supervivencia (n = 10 [A/B/C], n = 40 [D]).
    2. Registrar el estado de supervivencia de los ratones dentro de los 7 días posteriores a la infección.
    3. Tras la infección secundaria con PA, observa la tasa de mortalidad de los ratones desde el día 7 hasta el día 14.
    4. Tras la observación, se anestesian profundamente los ratones con isoflurano (5%) y se les eutanasia mediante una inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital sódico (150 mg/kg), con la muerte confirmada por luxación cervical.
  7. Análisis estadístico
    1. Realizar pruebas de normalidad y de homogeneidad de varianza sobre los datos cuantitativos.
    2. Para comparaciones entre grupos, se utiliza el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) si los datos están distribuidos normalmente y presentan varianza homogénea; de lo contrario, utiliza pruebas no paramétricas.
    3. Realizar análisis de supervivencia utilizando el método Kaplan-Meier. Utiliza los modelos de efectos mixtos para probar diferencias en los cambios de peso corporal entre grupos en distintos momentos. Consideremos un valor p ≤ 0,05 estadísticamente significativo.

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Resultados

A las 12 horas de la instillación intranasal, el nivel sérico de IL-6 en el grupo 1 × 108 KP aumentó significativamente (p < 0,0001, n = 5) (Figura 2A). A las 24 horas de la instillación intranasal, los niveles séricos de ALT (p < 0,01, n = 5) (Figura 2B), AST (p < 0,01, n = 5) (Figura 2C), CK (p < 0,01, n = 5) (Figura 2D) y BUN (p < 0,001, n = 5) (

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Discusión

La sepsis es un síndrome clínico complejo, y el estado inmunosupresor característico durante su etapa avanzada es un factor clave que conduce a la muerte del paciente12,13. Por ello, los modelos preclínicos que simulan con precisión la fisiopatología de la inmunosupresión inducida por sepsis son cruciales para una exploración profunda de sus mecanismos y el desarrollo de nuevas terapias. En este estudio, establecimos y validamos ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no haber conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82222038 y 81970259), los Jóvenes Talentos Sobresalientes de Biotecnología de Defensa Nacional (2023-JCJQ-ZQ-001 y 01-SWKJYCJJ06) y el Fondo Científico Chongqing para Jóvenes Académicos Distinguidos (CSTB2022NSCQ-JQX0017).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Biochemical incubatorYSEISHH-150LIncubación bacteriana
C57BL/6J ratonesVital River Laboratories8-10 semanas, macho
CD116bBioLegend101257Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
CD25BD bioscience740447Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
CD3BioLegend100203Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
CD4BioLegend100544Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
CD45BioLegend103116Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
CD8BioLegend100752Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
Buffer de tinción celular BioLegend420201
Agitador de temperatura constanteHonourHNY-100BCultivo bacteriano
Citómetro de flujoBeckman CoulterCytoFLEXAnálisis de citomecía de flujo
Centrífuga de alta velocidadBeckman CoulterAIIEGRA
IDEXX catalizador unoIDEXXCatalyst OneAnálisis bioquímico
IL-10BioLegend505026Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
Jeringuilla de insulina WEGO1mLRecolección de sangre
Klebsiella pneumoniae ATCC 43816biobw.orgbio-81659
LB Broth (polvo)SolarbioL1010Medio de cultivo líquido LB
LB Broth (polvo)SolarbioL1015Placa de agar LB
LY6CBioLegend128010Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
Ly6GBioLegend127606Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
MHC-IIBioLegend107622Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
MicropipetaEppendorfP100
Buffer de lisis de glóbulos rojosSolarbioR1010
EspectrofotómetroEppendorfEppendorf6131Medición de densidad óptica
Software estadísticoGraphPad SoftwareGraphpad Prism10.0
Puntas de pipeta estériles y libres de enzimasBiosharp200μL
Buffer diluyente TFBD Pharmingen51-90008101
Buffer TF fix/permBD Pharmingen51-90008100
Buffer TF perm/washBD Pharmingen51-90008102
TGF-β1BioLegend141406Anticuerpos de flujo (Anti-Mouse)
Lector de microplacas multimodo Varioskan LUXThermo ScientificVarioskan LUX 

Referencias

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