Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Summary

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Abstract

La microscopía de superresolución (SRM) supera el límite de difracción de la microscopía óptica convencional, permitiendo la visualización a nanoescala de estructuras subcelulares. Sin embargo, la adopción generalizada de técnicas como la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED), la microscopía de localización fotoactivada (PALM) / microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de iluminación estructurada (SIM) puede verse obstaculizada por factores como alta fototoxicidad, preparación especializada de muestras o operación compleja. Aquí presentamos un protocolo completo que aprovecha una plataforma confocal de escaneo láser integrada con un detector multiplexado de superresolución. Este sistema, combinado con el procesamiento computacional, permite una transición sencilla entre imágenes confocales y de superresolución dentro del mismo flujo de trabajo. El protocolo ofrece un enfoque fácil de usar para imágenes rápidas, de alta resolución y baja fototoxicidad. El método detallado abarca capacidades de imagen multimodal, incluyendo fluorescencia multicolor, contraste diferencial de interferencia (DIC), reconstrucción tridimensional de pila Z, imagen con células vivas en time-lapse, mosaico de gran área y varios modos de superresolución ofrecidos por el detector de matriz multiplexada. Las comparaciones sistemáticas demuestran que los modos de superresolución alcanzan una resolución lateral de aproximadamente 120 nm, lo que representa una mejora de aproximadamente el doble respecto al límite de difracción de la microscopía convencional de campo amplio y una mejora significativa tanto en la resolución como en la relación señal-ruido (4-8 veces) en comparación con la operación confocal estándar en la misma plataforma. La discusión también aborda puntos clave de un modelo de gestión compartida de recursos esencial para apoyar el funcionamiento sostenible de esta tecnología. Esta guía integrada sirve como un recurso valioso tanto para investigadores nuevos como experimentados y para gestores de instalaciones que buscan adoptar y maximizar el potencial de esta forma accesible de imagen avanzada en la investigación en ciencias de la vida.

Introduction

La visualización de estructuras subcelulares dinámicas es fundamental para avanzar en la investigación en ciencias de la vida. Sin embargo, la resolución de la microscopía óptica tradicional está limitada por difracción a aproximadamente 200 nm lateralmente, lo que restringe su capacidad para resolver procesos subcelulares dinámicos. Para superar esta barrera, se han desarrollado diversas técnicas de superresolución. Sin embargo, técnicas como la microscopía STED, PALM/STORM y SIM suelen presentar barreras para la adopción generalizada en entornos multiusuario, incluyendo alta fototoxicidad, la necesidad de fluoróforos especializados o preparación de muestras, procedimientos complejos de alineación o procesamiento computacional^{intensivo 1,2,3}.

En este contexto, los sistemas de microscopio confocal equipados con un detector de matriz multiplexada ofrecen una alternativa atractiva al permitir la obtención de imágenes de superresolución mediante detección multipíxel y reasignación computacional, bajando significativamente el umbral^{técnico 4}. Este enfoque utiliza una matriz de detectores de fosfuro de arseniuro de galio (GaAsP) de 32 elementos para recoger más fotones de cada punto de barrido. Los algoritmos de deconvolución inteligente posteriores reasignan esta información, reduciendo efectivamente el volumen de detección. Este proceso alcanza resoluciones espaciales de aproximadamente 120 nm lateralmente y 350 nm axialmente, lo que representa una mejora de aproximadamente 2 veces respecto al límite de difracción de la microscopía de campo amplio y produce un aumento de 4-8 veces en la relación señal-ruido en comparación con el modo confocal estándar en el mismo^{instrumento 4,5,6}. Esta combinación única de resolución mejorada, calidad de señal superior y compatibilidad con etiquetas y protocolos fluorescentes comunes constituye su principal ventaja para una aplicación amplia.

En consecuencia, esta forma de microscopía de superresolución accesible ha encontrado una amplia aplicación en la investigación en ciencias de la vida, permitiendo estudios detallados de la morfología de orgánulos, dinámica del citoesqueleto, interacciones virus-huésped y colocalización molecular tanto en células fijas como^{vivas 7,8}. Su relativa suavidad la hace especialmente adecuada para observaciones en lapso de tiempo prolongadas de muestras vivas.

La integración de estos sistemas avanzados en las instalaciones centrales es crucial para democratizar el acceso, pero su funcionamiento sostenible y eficaz presenta desafíos claros. En las instalaciones centrales institucionales, como en la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, el rendimiento óptimo y el impacto dependen críticamente de tres pilares: (1) protocolos de imagen estandarizados y reproducibles, (2) mantenimiento rutinario riguroso y (3) un marco de gestión eficaz para el acceso compartido. Aunque existen recursos valiosos para aspectos específicos, como métodos de imagen para sistemas^{anteriores 9}o principios generales de gestión^{de instalaciones 10,11}, actualmente falta una guía completa que integre protocolos detallados y reproducibles para plataformas modernas de detectores de matriz multiplexada con un modelo probado de gestión de recursos compartidos. Este artículo de protocolo pretende salvar esta brecha.

El objetivo general es proporcionar una guía completa y paso a paso para implementar y utilizar eficazmente un sistema confocal con un detector de matriz multiplexada para obtener imágenes de superresolución dentro de un entorno de recursos compartidos. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; y los gestores de instalaciones que establecen u optimizan dicho servicio. Aquí, detallamos sistemáticamente la configuración del sistema, los protocolos de imagen multimodal (que cubren modos multicolor, 3D, células vivas, mosaico y superresolución) y un modelo de gestión compartida probado. Esta guía integrada sirve como recurso para maximizar el potencial y la accesibilidad de esta potente modalidad de imagen.

Protocol

Todos los experimentos que involucraron muestras biológicas se realizaron conforme a las directrices y regulaciones de las Instalaciones Centrales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang y fueron aprobados por el Comité de Bioseguridad Institucional (Certificado de Aprobación nº BSL20235710079).

NOTA: Todos los procedimientos que involucran cultivos celulares deben realizarse en condiciones estériles en un gabinete de seguridad biológica de Clase II, salvo que se especifique lo contrario. Este protocolo asume que el sistema de microscopio está instalado y las potencias láser están calibradas. Las especificaciones detalladas y los proveedores recomendados para reactivos clave, consumibles y equipos (por ejemplo, platos de imagen, vidrio de cubierta, medio de montaje) se listan en la Tabla de materiales.

1. Preparación de muestras

NOTA: La imagen super-resolución exitosa comienza con una preparación óptima de la muestra. El uso de placas de imagen de vidrio de alta calidad con 1,5 de espesor (0,17 mm) es esencial para igualar el collar corrector de los objetivos de inmersión en aceite de alto NA y evitar aberraciones esféricas. Todos los pasos de centrifugación deben realizarse a 300 × g durante 5 minutos, salvo que se indique lo contrario.

1. Preparación de muestras de células fijas para imágenes de superresolución multicolor (por ejemplo, células COS7)
   NOTA: Este protocolo describe la inmunotinción para microtúbulos (Alexa Fluor 568) y mitocondrias (Alexa Fluor 488), con contratinción nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), como se muestra en la Figura 1.
   1. Cultivar células de COS7 en el medio modificado Eagle (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ .
   2. Células de placa sobre placas de imagen de fondo de vidrio de 35 mm a una densidad de 1,0 × 10⁵ celdas por plato. Permite que las células se adhieran y crezcan hasta alcanzar una confluencia del 60-70% (normalmente 24 horas).
   3. Aspira el medio de cultivo y lava suavemente las células con solución salina fosfatada (PBS) previamente calentada (37°C). Fija las células añadiendo 1 mL de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS e incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
   4. Aspira la solución de PFA (trátala como residuos peligrosos). Lava las células tres veces con 2 mL de PBS, incubando durante 5 minutos por lavado con un suave mecimiento.
   5. Permeabilización y bloqueo: Incubar las células con 1 mL de tampón de permeabilización/bloqueo (0,1% v/v) Triton X-100, 1% (v/v) albúmina sérica bovina (BSA) en PBS) durante 30 minutos en RT.
   6. Incubación primaria de anticuerpos: Incubar células con una mezcla de anticuerpos primarios contra α-tubulina (monoclonal de ratón) y TOMM20 (policlonal de conejo) en un buffer de dilución de anticuerpos (1% BSA en PBS) a 4°C durante la noche (o 1-2 horas en RT). Utiliza 300 μL por plato para cubrir la superficie del cristal.
   7. Lavado: Aspira cuidadosamente la solución primaria de anticuerpos. Lava las células tres veces con 2 mL de PBS que contenga 0,05% Tween-20 (PBST), 5 minutos por lavado.
   8. Tinción secundaria de anticuerpos y nuclear: Preparar una mezcla de anticuerpos secundarios fluorescentes y DAPI en un tampón de dilución de anticuerpos (1% BSA/PBS), protegido de la luz.
      1. Usa IgG anti-ratón de burro conjugado a Alexa Fluor 568 (1:500) y IgG anti-conejo de burro conjugado a Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Incluir DAPI a una concentración final de 1 μg/mL para la tinción nuclear. Aplica 300 μL de esta mezcla a las células e incuba durante 1 hora en RT en la oscuridad.
   9. Lavado final: Aspira la solución de tinción y lava las células tres veces con 2 mL de PBS, 5 minutos por lavado.
   10. Aplica el medio de montaje: Aspira cuidadosamente el PBS del plato de imagen, dejando la muestra ligeramente húmeda. Aplica inmediatamente una pequeña gota (~20 μL) de medio de montaje endurecido anti-desvanecimiento (por ejemplo, ProLong Gold) directamente sobre la zona del fondo de vidrio.
   11. Cubrir y curar: Baja suavemente un vaso de tapa de alta precisión #1.5 sobre la gota, evitando burbujas. Deja que el soporte cure durante la noche en RT en la oscuridad, o durante 2-4 horas a 37°C si se requiere un curado más rápido.
2. Preparación de muestras de células vivas para imágenes en time-lapse (por ejemplo, células Hep3B expresando una etiqueta proteica fluorescente).
   NOTA: Este protocolo describe la imagen de células Hep3B que expresan de forma estable una proteína fluorescente (por ejemplo, EGFP) dirigida a mitocondrias.
   1. Cultivar células Hep3B en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con un 10% de FBS. Células de placa sobre platos de imagen de fondo de vidrio de 35 mm (1,5 cm de vidrio de cobertura) a una densidad de 0,8 × 10⁵celdas/plato. Permite que las células crezcan hasta aproximadamente un 70-80% de confluencia para una salud óptima y una densidad de imagen (normalmente 18-24 horas).
   2. Preparación para la imagen: El día de la imagen, sustituir suavemente el medio de cultivo estándar por 2 mL de medio de imagen preequilibrado (37°C, 5% CO₂ ) durante al menos 30 minutos, libre de fenol rojo y baja fluorescencia, suplementado con 10% FBS y, si es necesario, 25 mM de buffer HEPES para estabilización del pH fuera de una incubadora de_CO-2 . Esto minimiza la fluorescencia de fondo y mantiene el pH fisiológico durante la imagen.
      NOTA: Permita que el plato se aclimate en el escenario de microscopio precalentado dentro de la cámara ambiental durante al menos 30-45 minutos antes de comenzar la adquisición en time-lapse para asegurar la temperatura, el enfoque y la estabilidad de la salud celular.

2. Arranque, inicialización y alineación básica del sistema de microscopio

1. Encende la unidad principal del microscopio, el módulo de lanzamiento láser (que contiene láseres de estado sólido a 405, 488, 561 y 640 nm), la fuente de luz LED y el ordenador de control.
   1. Deja que los láseres se calienten y estabilicen durante al menos 15-20 minutos. Esto es fundamental para una potencia láser estable, especialmente para experimentos cuantitativos o de lapso de tiempo.
2. Lanza el software operativo del microscopio.
3. Desde la interfaz principal, selecciona 'Microscopio' > 'Inicializar' o sigue el asistente de inicio del software.
4. En el software, navega hasta el panel 'Adquisición'. En el menú desplegable de objetivos de objetivos, selecciona 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil ' o el objetivo correspondiente para tu experimento.
5. Aplica una gota de aceite de inmersión (índice de refracción = 1,518) directamente sobre la lente frontal del objetivo. Evita introducir burbujas.
6. Para la obtención de imágenes de células vivas, activa la cámara ambiental y el sistema de estabilización de enfoque activo (por ejemplo, 'Foco Definido' >) al menos 45-60 minutos antes de la imagen. Ajusta la temperatura a 37°C, CO₂ a 5% y humedad a >60%. Permite que el sistema se estabilice. Verifica la estabilidad usando los sensores de la recámara.
7. El sistema ya está listo para la carga de muestras y la configuración de parámetros de imagen.

3. Imagen de fluorescencia multicolor

1. Coloca la muestra preparada en el escenario del microscopio. Levanta cuidadosamente el escenario hasta que el vaso de la tapa toque el aceite de inmersión.
2. En el software de adquisición, navega por la pestaña 'Adquisición' y selecciona Crear un nuevo experimento.
3. Añade múltiples pistas de imagen (canales) correspondientes a los fluoróforos utilizados. Para el ejemplo de la Figura 1, configure:
   1. Pista 1 (DAPI): Excitación 405 nm, detección 410-480 nm.
   2. Pista 2 (Alexa Fluor 488): Excitación 488 nm, detección 495-550 nm.
   3. Pista 3 (Alexa Fluor 568): Excitación 561 nm, detección 570-620 nm.
4. Para cada pista, se ajusta el diámetro del orificio estenopeico confocal a 1 Unidad de Aire (1 UA).
5. Optimizar la potencia láser y la ganancia del detector para cada canal utilizando el siguiente proceso iterativo:
   1. Selecciona el primer canal (por ejemplo, DAPI). Cambia a modo de escaneo 'en directo'.
   2. Ajusta la potencia inicial del láser a un valor bajo (por ejemplo, 0,1-0,5%). Ajusta la ganancia del detector a un nivel moderado dentro de su rango lineal (por ejemplo, 700 V para un PMT GaAsP).
   3. Aumenta gradualmente la potencia del láser hasta que las estructuras objetivo sean claramente visibles por encima del fondo en la imagen en vivo.
   4. Abre la pantalla de histogramas . Asegúrate de que no haya saturación de píxeles (el histograma no se acumule en el borde derecho). Reduce la potencia del láser si es necesario.
   5. Ajusta la ganancia del detector para conseguir una imagen brillante y de bajo ruido. Evita ganancias superiores a 850 V para evitar ruido excesivo.
   6. Repite los pasos 3.5.1-3.5.5 para todos los canales de fluorescencia restantes.
      NOTA: Equilibra la potencia del láser, la ganancia y el tiempo de permanencia del píxel para maximizar la relación señal-ruido minimizando el daño fotográfico. Para las células vivas, prioriza menor consumo y tiempos de permanencia más cortos.
6. Establece el formato de imagen (número de píxeles) y el tiempo de permanencia de píxeles.
   1. Establezca el tamaño del píxel para satisfacer el criterio de Nyquist: tamaño del píxel ≤(resolución / 2,3). Para la imagen confocal estándar (resolución lateral ~250 nm), fije el tamaño del píxel ≤108 nm.
   2. Utiliza el botón de muestreo 'Nyquist ' del software para calcular esto automáticamente si está disponible.
   3. Establece el tiempo de permanencia de los píxeles. Utiliza un tiempo de permanencia más largo (por ejemplo, 1,0-2,0 μs) para una mayor relación señal-ruido, o un tiempo de permanencia más corto (por ejemplo, 0,5-1,0 μs) para obtener imágenes más rápidas.
7. Asegúrate de que el modo 'Escaneo secuencial' esté seleccionado entre pistas para minimizar la diafonía.
8. Haz clic en 'Iniciar' para obtener una sola imagen. Guarda la imagen con los metadatos relevantes.

4. Imagen por contraste de interferencia diferencial (DIC)

1. En la pestaña 'Acquisition' del software de adquisición, selecciona 'Añadir un nuevo canal ' y configúralo para la detección de luz transmitida.
2. Selecciona el detector de luz transmitida apropiado (a menudo llamado T-PMT (tubo fotomultiplicador de luz transmitida) o ESID (detector de interfaz de sistema externo) en el software).
3. Configuración del prisma DIC y polarizador:
   1. Desde el panel de control por hardware o la interfaz de software, selecciona el prisma DIC que coincida con tu objetivo (por ejemplo, 'DIC III' para un objetivo 63x).
   2. Inserta el prisma seleccionado en el camino de la luz.
4. Ajusta el polarizador y el control deslizante del DIC para un contraste óptimo:
   1. Gira el analizador (polarizador) hasta que el fondo en la imagen 'Live' parezca oscuro o muy tenue.
   2. Mientras observas la imagen en directo, ajusta lentamente la posición del deslizador del DIC en pequeños incrementos.
   3. Optimiza hasta que aparezcan características celulares (por ejemplo, membranas, núcleos) con un relieve distintivo en sombra y pseudo-tridimensional sobre un fondo gris neutro.
5. Ajusta la longitud de onda de iluminación para el DIC a un valor dentro del rango visible (por ejemplo, 488 nm o 546 nm).
6. Ajusta la intensidad de transmisión (potencia del láser o de la lámpara) y la ganancia del detector para el canal de luz transmitida para lograr una imagen clara sin saturación.
7. Adquiere la imagen DIC.

5. Adquisición de pila Z para reconstrucción tridimensional

NOTA: Antes de definir la pila Z, configure todos los parámetros de imagen (potencia láser, ganancia, orificio estenopeico, tamaño del píxel) en un único plano focal óptimo como se describe en la Sección 3. Esto garantiza ajustes consistentes en todas las secciones ópticas.

1. En la pestaña 'Adquisición', selecciona el modo 'Z-stack'.
2. Define el volumen de interés:
   1. Utilizando un escaneo en directo a alta velocidad, céntrate en la estructura superior de interés.
   2. Haz clic en 'Poner primero' (o 'Arriba').
   3. Céntrate cuidadosamente en la estructura más baja de interés.
   4. Haz clic en 'Poner al final' (o 'Abajo'). El software mostrará la profundidad total.
3. Establezca el tamaño del paso Z para satisfacer el criterio de muestreo de Nyquist en la dirección axial. (típicamente d_r/2.3, donde d_r es la resolución axial). Para un objetivo de aceite de 63x/1,4 NA, use 0,3-0,4 μm.
4. Alternativamente, utiliza el botón 'Óptimo' o 'Nyquist' del software para calcular automáticamente el tamaño del paso.
5. Configurar parámetros de imagen (potencia láser, ganancia, orificio = 1 UA) para cada canal según se describe en la Sección 3. Para señales débiles, considera aumentar ligeramente la potencia o ganancia del láser en comparación con una sola imagen 2D.
6. Comienza la adquisición para recoger toda la pila de imágenes.
   NOTA: Tiempo total de adquisición = (Tiempo de fotograma de una sola porción) × (Número de rebanadas)
   Planifica en consecuencia, especialmente para muestras vivas.
7. Reconstrucción y visualización 3D:
   1. Utiliza el módulo 'Processing' del software (por ejemplo, función de proyección 3D) o abre la pila de imágenes en software dedicado como ImageJ/Fiji.
   2. Genera proyecciones de máxima intensidad (MIP) para ver todas las señales enfocadas en una sola imagen 2D.
   3. Para una representación 3D real, aplica renderizado por volumen. Ajusta el brillo, la opacidad y la iluminación según sea necesario.
   4. Genera vistas ortogonales (secciones transversales XZ y YZ) para inspeccionar la extensión axial y el registro.

6. Imagen en lapso de tiempo para células vivas

1. Preparar las células vivas según lo descrito en la Sección 1.2. y montar el plato en el escenario de microscopio precalentado dentro de la cámara ambiental.
2. Dejar que la muestra se aclimate durante al menos 45-60 minutos según se describe en la Sección 2.6 para asegurar la estabilización.
3. Navega a un campo de visión con celdas sanas y bien espaciadas y adquiere una instantánea única de alta calidad usando parámetros optimizados según la Sección 3.5.
4. Activa el sistema de estabilización de enfoque activo (por ejemplo, Enfoque definido o similar). Esto no es negociable para experimentos a largo plazo que compensen la deriva térmica.
5. En la pestaña 'Adquisición', selecciona el modo 'Serie Temporal'.
6. Seleccione el modo de imagen adecuado en función del equilibrio requerido entre velocidad, resolución y fototoxicidad:
   1. Para máxima resolución espacial en procesos menos dinámicos, selecciona el modo 'SR' (SuperResolución).
   2. Para un equilibrio adecuado para la dinámica de muchos orgánulos, selecciona 'SR 2 Y ' o 'SR 4 Y ' (modos acelerados de superresolución).
   3. Para imágenes a muy alta velocidad sin superresolución, selecciona el modo 'Confocal' o 'Co 2 Y'.
7. Definir la línea temporal experimental: Establecer la duración total del experimento y el intervalo de tiempo (Δt) entre fotogramas consecutivos. (por ejemplo, 5-30 s para motilidad mitocondrial)
8. Optimizar los parámetros de imagen para minimizar el daño por foto:
   1. Empieza con la potencia láser más baja que proporcione una señal detectable.
   2. Ajustar la ganancia del detector dentro de su rango lineal (600-850 V) para lograr un nivel de señal funcional, prefiriendo el aumento de potencia sobre el láser.
   3. Utiliza la velocidad de escaneo más rápida (el tiempo de permanencia más corto de los píxeles) compatible con los requisitos de calidad de imagen.
9. Comienza la adquisición en time-lapse. Monitoriza los primeros fotogramas para asegurar la estabilidad del enfoque y la salud celular.

7. Imagen por escaneo de baldosas de gran área

1. En la pestaña 'Adquisición', selecciona el modo 'Escaneo de mosaicos'.
2. Define la Región de teselación usando uno de dos métodos:
   1. Basado en la disposición: Especifica el número de casillas en las direcciones X e Y (por ejemplo, 3 x 3).
   2. Basado en el retorno de la inversión: Dibuja manualmente un rectángulo sobre la imagen 'Live' para definir la región de interés. El software calculará automáticamente el número de casillas necesarias.
3. Configura la superposición entre casillas adyacentes al 10-15%.
   NOTA: Esta superposición proporciona suficiente información para que el algoritmo de unión del software cree una imagen compuesta sin interrupciones.
4. Configura los parámetros de imagen (potencia láser, ganancia, resolución) para una sola casilla como harías para una imagen estática.
   NOTA: Para áreas de mosaico muy grandes, considera usar un modo de escaneo más rápido (por ejemplo, 'Co 2 Y') para mantener el tiempo total de adquisición viable y minimizar el fotoblanqueo.
5. Empieza la adquisición de azulejos. El software adquirirá y coserá automáticamente las baldosas.
6. Tras la adquisición, inspecciona cuidadosamente la imagen bordada, especialmente en los límites de las baldosas, en busca de cualquier artefacto. Utiliza las herramientas manuales de ajuste de costuras del software si es necesario.

8. Imagen de superresolución usando el detector de matriz multiplexada

1. En la pestaña 'Adquisición', navega al selector de modos, haz clic en 'Smart Setup' y selecciona el modo 'Airyscan'. Luego elige 'SuperResolución' como modo de funcionamiento para el detector de matriz multiplexada.
2. Elige el modo de adquisición específico según las prioridades experimentales:
   1. Modo 'SR': Para la mayor resolución espacial posible (~120 nm lateral). Úsalo para muestras fijas.
   2. Modo 'SR 2 Y': Proporciona un equilibrio entre resolución y velocidad.
   3. Modo 'SR 4 Y': Modo super-resolución más rápido (hasta ~25 fps de velocidad de línea, teóricamente), optimizado para imagen de células vivas para minimizar la dosis de luz.
   4. Modo 'Co 2 Y': Ofrece velocidad de imagen similar a la confocal con una mejor relación señal-ruido cuando no se requiere superresolución.
      NOTA: Los valores de resolución (por ejemplo, 120 nm) son especificaciones del sistema bajo condiciones^{ideales 12}. La resolución real depende de la preparación de la muestra, la relación señal-ruido y el procesamiento correcto.
3. Configura los parámetros de imagen (potencia láser, ganancia del detector).
   1. Para la imagen de livecell, comienza con menor potencia láser que en modo confocal para reducir el daño fotográfico.
   2. Para muestras tenues y fijas, puede ser necesario mayor potencia y/o ganancia láser para lograr una relación señal-ruido suficiente.
   3. Encuentra la potencia mínima del láser que produzca una imagen limpia y de alto contraste en modo 'Live'.
4. Ajusta el tamaño del píxel y el tiempo de permanencia.
   1. Para capturar la resolución mejorada, se ajusta el tamaño del píxel para que cumpla el criterio de Nyquist: tamaño del píxel ≤(resolución deseada / 2,3). Para el modo SR (objetivo 120 nm), ajusta el tamaño del píxel ≤~52 nm.
   2. Utiliza el botón 'Óptimo' o 'Nyquist' del software para calcularlo automáticamente si está disponible.
5. Adquiere la imagen. Los datos en bruto contienen señales multiplexadas y aún no están superresueltos.
6. Procesa los datos adquiridos para lograr superresolución:
   1. Accede al módulo de procesamiento del software.
   2. Selecciona el conjunto de datos y elige la función 'SuperResolution Processing'.
   3. Empieza con la configuración 'Auto'. Para datos de lowSNR, ajusta manualmente 'Strength' y 'Noise Filter' para mejorar la nitidez sin introducir artefactos.
   4. (Opcional) Para la máxima fidelidad, especialmente en pilas 3D, aplica un paso adicional de deconvolución conjunta (jDCV).
   5. Ejecutar el procesamiento. Compara vistas procesadas y no procesadas para verificar la mejora de los detalles reales.
7. (Opcional) Para una comparación cuantitativa de la relación señal-ruido (SNR) entre modos:
   1. Adquiere imágenes de la misma muestra en diferentes modos.
   2. En el software de análisis, se define una región de interés (ROI) en una estructura uniforme y se mide la intensidad media de la señal.
   3. Definir un ROI de fondo y medir la desviación estándar de la intensidad de fondo.
   4. Calcular SNR = (señal media) / (desviación estándar del fondo).
8. (Opcional) Para la medición empírica de resolución del sistema usando perlas fluorescentes:
   1. Prepara una muestra de perlas fluorescentes de 100 nm.
   2. Adquiere un Zstack de una cuenta aislada en modo SR con muestreo de Nyquist.
   3. Procesa la pila con superresolución y (opcionalmente) jDCV.
   4. Utiliza la herramienta 'PSF Measurement ' del software para ajustar una Gaussiana 3D y registra el ancho completo a valores de mitad de máximo (FWHM).

Results

Imagen de fluorescencia multicolor
Se realizó la imagen de fluorescencia multicolor de células COS7 fijas como se describe en la Sección 3. Se usaron anticuerpos contra α-tubulina (microtúbulos) y TOMM20 (mitocondrias) con contratinción nuclear DAPI. Como se muestra en la Figura 1, los núcleos (azul), mitocondrias (verde, Alexa Fluor 488) y microtúbulos (rojo, Alexa Fluor 568) estaban claramente delineados con alta especificidad y una dia...

Discussion

El protocolo integrado presentado aquí proporciona una hoja de ruta completa para implementar las capacidades avanzadas de imagen de un sistema moderno de microscopio confocal equipado con un detector de superresolución multiplexada, dentro de un marco sostenible de recursos compartidos. Esta sección sintetiza los aspectos críticos del método, su implementación práctica y su posición en el campo de la bioimagen. La ejecución exitosa de este protocolo depende de varios pasos clave. Primer...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Celdas COS7	ATCC (o similar)	CRL-1651	Línea celular de fibroblastos renales de mono verde africano. Utilizado para la preparación de muestras de células fijas para imágenes multicolor de superresolución
IgG anti-ratón Donkey, conjugado Alexa Fluor 568	Invitrogen (o similar)	A10037	Anticuerpo secundario para la tinción de microtúbulos. Usado a 1:500 de dilución
Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM), glucosa alta	Gibco (o similar)	11965092	Medio de cultivo estándar para células COS7, complementado con un 10% de FBS.
Suero fetal bovino (FBS), inactivado por calor	Gibco (o similar)	10082147	Suplemento sérico usado al 10% (v/v) en todos los medios de cultivo celular.
Plato de imagen con fondo de vidrio (35 mm, µ-Dish, #1.5 capa de polímero, 0,17 mm de grosor)	ibidi (o similar)	81156	Sustrato para el placado celular y la imagen. Crítico para la compatibilidad con objetivos de inmersión en aceite de alto NA.
Procesamiento de imágenes y software de análisis (módulos ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (azul)	Se utiliza para reconstrucción 3D, procesamiento de superresolución (por ejemplo, procesamiento Airyscan), medición de PSF y análisis SNR.
ImageJ / Fiji	Código abierto	N/A	Se utiliza para reconstrucción 3D adicional, generación de vistas ortogonales y análisis general de imágenes.
Aceite de inmersión (Índice de refracción = 1,518)	Carl Zeiss (o similar)	444960-0000-000	Para usar con objetivos de inmersión en aceite (por ejemplo, 63x/1,4 NA).
Sistema de microscopio confocal de barrido láser con detector de matriz multiplex (por ejemplo, ZEISS LSM 900 con Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	La principal plataforma de imagen utilizada para todos los modos confocales y de superresolución descritos en el protocolo.
Medio Esencial Mínimo (MEM) con Earle' s Sales	Gibco (o similar)	11095080	Medio de cultivo estándar para células Hep3B, suplementado con un 10% de FBS.
Anticuerpo monoclonal anti-alfa-tubulina para ratón (Clone DM1A)	Sigma-Aldrich (o similar)	T6199	Anticuerpo primario para marcar microtúbulos. Usado a 1:500 de dilución
Paraformaldehído (PFA), 4% en PBS	Jinpan  (o similar)	TBS5083	Fijador para las células. Úsalo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Maneja con las precauciones adecuadas.
Medio de imagen libre de fenol rojo	Gibco (o similar)	21063029	Medio de baja autofluorescencia utilizado para la obtención de imágenes de células vivas. Preequilibrado con 5% de CO2 a 37&º; C antes de su uso.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1X, pH 7,4	CellWorld (o similar)	C0162-311	Se usan como tampón de lavado y dilución durante todo el protocolo.
Montaje antifade dorado ProLong	Invitrogen (o similar)	P36930	Medio de montaje endurecido para preservar la fluorescencia en muestras fijas.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (o similar)	T8787	Usado al 0,1% (v/v) para permeabilización celular
Preadolescente-20	Sigma-Aldrich (o similar)	P9416	Se usa al 0,05% (v/v) en PBS (PBST) para los pasos de lavado tras incubaciones de anticuerpos.
Albúmina sérica bovina (BSA), fracción V	Sigma-Aldrich (o similar)	A7906	Se usa al 1% (p/v) en PBS para bloquear y como componente del buffer de dilución de anticuerpos.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma-Aldrich (o similar)	D9542	Contratinción nuclear. Usado a una concentración final de 1 y micro; g/mL.
IgG anticonejo de burro, conjugado Alexa Fluor 488	Invitrogen (o similar)	A21206	Anticuerpo secundario para la tinción mitocondrial. Usado a 1:500 de dilución
Microesferas fluorescentes (Beads), 100 nm de diámetro	Invitrogen (por ejemplo, TetraSpeck™) o similares	T7279	Utilizado para la medición empírica del sistema' s función de dispersión puntual (PSF) y resolución.
Células Hep3B que expresan de forma estable EGFP-mitocondrias	IMMOCELL	IM-H367	Línea celular de hepatoma humana diseñada para expresar EGFP de forma estable dirigida a la matriz mitocondrial. Utilizado para imágenes en time-lapse de células vivas.
Solución de tampón HEPES, 1 M	Gibco (o similar)	15630080	Utilizado a una concentración final de 25 mM en medio de imagen para estabilización del pH durante imágenes en vivo fuera de una incubadora de CO2.
Cubierta de alta precisión (#1,5, 0,17 mm de espesor)	Marienfeld (o similar)	107052	Se usa para montar muestras fijas.
Software operativo para microscopios (por ejemplo, edición azul ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (azul)	Utilizado para control del sistema, adquisición de imágenes y procesamiento básico.
Lente objetivo: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Objetivo principal utilizado para imágenes de alta resolución.
Anticuerpo policlonal anti-TOMM20 Rabbit	Abcam (o similar)	ab186735	Anticuerpo primario para marcar mitocondrias. Usado con dilución 1:1000 y no bsp;