Artículo de método

In Vitro Evaluación de los efectos potenciadores de moléculas de origen vegetal sobre biocidas convencionales

DOI:

10.3791/70172

⸱

8 de mayo de 2026

 ,  ,  , 
1LEPABE, ALiCE, Faculty of Engineering, University of Porto, 2DEQB-Department of Chemical and Biological Engineering, Faculty of Engineering, University of Porto, 3LAQV/REQUIMTE, BioSIM, Department of Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Porto, 4Department of Chemical Engineering, Faculty of Science and Technology, University of Coimbra

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo proporciona un marco sistemático para evaluar cómo los fitoquímicos pueden potenciar los efectos bactericidas de los biocidas tradicionales utilizando modelado de actividad bactericida y ensayos de interacción combinatoria, que buscan identificar mezclas sinérgicas que mejoren el control microbiano y reduzcan el uso global de biocidas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desarrollar enfoques innovadores y eficientes para potenciar la actividad antimicrobiana de los biocidas convencionales es una estrategia prometedora para mejorar el control microbiano con fines de desinfección sanitaria. En este contexto, describimos un protocolo detallado para evaluar los efectos potenciadores de los fitoquímicos de origen vegetal sobre los biocidas sintéticos. Estos productos de origen vegetal son candidatos atractivos como adyuvantes de biocida debido a su diversidad estructural, bioactividad y, a menudo, menor toxicidad. El flujo de trabajo aquí descrito permite determinar las concentraciones mínimas de bactericidas (MBC) y la generación sistemática tanto de curvas dosis-respuesta como de tiempo-respuesta para cada producto probado individualmente (biocidas y fitoquímicos) y para sus combinaciones duales o triples. Los datos resultantes permiten un modelado matemático avanzado, incluyendo la determinación del índice fraccional de concentración bactericida (FBCI) y la evaluación de las interacciones entre los productos probados respecto a efectos sinérgicos, aditivos o antagónicos utilizando el software Combenefit. En ese sentido, es posible identificar productos naturales prometedores como potenciadores de biocidas, optimizar la eficacia antimicrobiana y diseñar estrategias de desinfección más sostenibles y seguras que puedan reducir las concentraciones requeridas de biocidas sintéticos. Esto mejora el control microbiano y minimiza los riesgos ambientales y para la salud pública asociados al uso excesivo de biocidas.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las infecciones asociadas a la atención sanitaria (IAA) son uno de los desafíos de salud pública más críticos y preocupantes a nivelmundial. De forma alarmante, están fuertemente asociados con la propagación de microorganismos multirresistentes (MDR) y la persistencia de la carga biológica bacteriana en superficies hospitalarias, a menudo debido a prácticas de desinfección inapropiadaso ineficaces 2,3. Además, la contaminación cruzada entre pacientes, personal sanitario y equipos médicos amplifica aún más esteproblema 4,5. En Europa, por ejemplo, se estima que casi 80.000 pacientes hospitalizados sufren al menos un HAI en un día dado, lo que representa aproximadamente 16 millones de días hospitalarios adicionales cadaaño 2. La pandemia de COVID-19 ha complicado aún más este problema, contribuyendo a un aumento de las infecciones bacterianas por MDR debido al alto uso de agentes antimicrobianos/desinfectantes y al incremento dehospitalizaciones 6,7. El auge de bacterias resistentes a antibióticos, incluyendo Escherichia coli productora de β-lactamasa (ESBL) de espectro extendido y Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), ha provocado una creciente carga sanitaria y económica a nivel mundial. De hecho, estas cepas subrayan la urgencia de desarrollar soluciones innovadoras para la prevención y el control deinfecciones 1,8,9.

Con esto en mente, los biocidas se convirtieron en herramientas cruciales para controlar la propagación de bacterias resistentes e infecciones, aplicándose extensamente para desinfectar superficies hospitalarias, esterilizar equipos, tratar sistemas de agua y prevenir la contaminación de dispositivos médicos10,11. A diferencia de los antibióticos, que actúan sobre objetivos microbianosespecíficos 12, los biocidas alteran múltiples estructuras celulares simultáneamente, incluyendo membranas, enzimas, ARN ribosomal y vías metabólicas 13,14,15. Inicialmente se pensó que esta acción de amplio espectro reduciría el riesgo de resistencia. Sin embargo, la evidencia muestra que los microorganismos pueden adaptarse a la exposición al biocida, lo que conduce a tolerancia, persistencia e incluso resistencia cruzada a losantibióticos 10,16. Por ejemplo, la exposición de Pseudomonas aeruginosa a cloruro de benzalconio seleccionada para variantes resistentes a ciprofloxacina y novobiocina mediante la sobreexpresión de bombas de eflujo17. De manera similar, se ha demostrado que el triclosán activa las bombas de eflujo en Stenotrophomonas maltophilia, mientras que la exposición a la clorhexidina se ha asociado con un aumento de la resistencia a los antibióticos en S. aureus18.

Además, se han implicado compuestos de amonio cuaternario (QACs), clorhexidina, diamidinas, acridinas y triclosánes como posibles causas de la selección y persistencia de la resistencia bacteriana a variosantibióticos 19,20. Se sabe que genes de resistencia como qacA/B y SMR confieren tolerancia a las QAC, y también se han reportado fallos clínicos como la bacteriemia vinculada a catéteres almacenados en soluciones contaminadas de QAC y la contaminación microbiana intrínseca deiodóforos 16,17,21. Estos hallazgos ponen de manifiesto la urgente necesidad de un uso optimizado del biocida, respaldado por estudios mecanicistas y estrategias racionales de desinfección.

Las biopelículas, que son comunidades bacterianas de alta densidad celular y bien estructuradas incrustadas en una matriz extracelular de polisacáridos, proteínas y ácidos nucleicos, suponen un obstáculo adicional y significativo para el control deinfecciones 22,23. Presentan una tolerancia notable a los antibióticos y biocidas, contribuyendo a la persistencia de infecciones en los pacientes. Además, las biopelículas también suelen asociarse con la contaminación persistente de dispositivos médicos, instrumentos quirúrgicos y superficieshospitalarias 24. A pesar de su importancia clínica, las biopelículas solo han sido reconocidas como principales contribuyentes a infecciones crónicas y resistencia antimicrobiana en las últimas décadas. Su resistencia es tal que incluso los agentes desinfectantes agresivos a menudo no logran erradicarlos, dejando atrás células persistentes capaces de resembrar la infección 20,25,26. Por lo tanto, encontrar estrategias efectivas de antibiofilm es crucial para controlar las IAA y reducir la carga de salud pública y económica de los patógenosMDR 27,28.

Como solución prometedora, los fitoquímicos, que son metabolitos secundarios producidos y extraídos de las plantas, representan un recurso en gran parte inexplorado para nuevos agentes antimicrobianos yantibiofilmes. Sin embargo, no se utiliza ningún fitoquímico como antibiótico, debido a su modesta actividad antimicrobiana en comparación con los antibióticos convencionales. Los fitoquímicos se clasifican rutinariamente como antimicrobianos basándose en pruebas de susceptibilidad que producen la concentración inhibitoria mínima (CMI) en el rango de 100 a 1000 μg/mL, valores mucho más altos que los de los antibióticosconvencionales 30,31. Es importante destacar que los fitoquímicos ya han demostrado actividad antibiofilm cuando se usan solos o como potenciadores de biocidas convencionales. Por ejemplo, la quercetina puede inhibir la producción de alginato, lo que lleva a una disminución de la adhesión durante el desarrollo de biofilm 32,33,34. Emodin inhibió el desarrollo de biopelículas por P. aeruginosa, E. coli y S. aureus mediante la disminución de la expresión de genes clave implicados en la formaciónde biofilms. Combinar fitoquímicos con biocidas convencionalmente usados pero cada vez menos efectivos, como agentes modificadores de la resistencia, representa una estrategia prometedora para mejorar la eficaciaantimicrobiana 36. Estas interacciones sinérgicas pueden interferir con los mecanismos de resistencia microbiana, reduciendo las concentraciones mínimas efectivas de biocidas necesarias para lograr una desinfecciónsatisfactoria 37. Este enfoque optimiza el rendimiento biocida, reduce la presión selectiva para el desarrollo de resistencia y disminuye los impactos ecológicos y toxicológicos asociados a la aplicación excesiva debiocidas 15,20. Los fitoquímicos son estructuralmente diversos 38,39,40, ampliamente disponibles 38,39,41, económicos 38,39,42, y a menudo menos tóxicos para humanos y el medio ambiente que los biocidas sintéticos 38,39. Son productos naturales que a menudo se derivan de fuentes vegetales renovables y, en algunos casos, se ha informado que presentan menor persistencia ambiental y perfiles de toxicidad reducidos en comparación con ciertos biocidassintéticos 43,44,45. Aunque su coste, disponibilidad y perfiles de toxicidad varían según el compuesto y el proceso de extracción, varios fitoquímicos han demostrado características favorables de seguridad y medioambientales en comparación con ciertos biocidasconvencionales 46,47.

Este protocolo tiene como objetivo evaluar el potencial de los fitoquímicos, tanto individualmente como en combinación con biocidas convencionales, para la desinfección sanitaria. En resumen, el protocolo evalúa las interacciones biocida-fitoquímica en amplios rangos de concentraciones. Los biocidas se probaron inicialmente entre 0,1 y 500 mg/L y los fitoquímicos entre 50 y 10.000 mg/L para determinar las concentraciones mínimas de bactericidas (CVB) (Tabla 1). Para combinaciones duales, se seleccionaron concentraciones subbactericidas de la siguiente manera: cloruro de benzalconio (BAC) a 0,1, 0,5 y 0,75 mg/L; ácido peracético (PAA) a 0,1, 0,3 y 0,5 mg/L; ácido salicílico (SAL) a 50, 100 y 250 mg/L; y eugenol (EUG) a 100, 250 y 750 mg/L (Tabla 1). Se realizaron combinaciones triples utilizando BAC (0,75 mg/L) o PAA (0,5 mg/L) combinados con SAL (100 o 250 mg/L) y EUG (250 o 750 mg/L) (Tabla 1). Se realizaron ensayos de respuesta temporal durante 1–90 minutos, seguidos de una evaluación de regeneración bacteriana de 24 horas. Las interacciones antimicrobianas se cuantifican usando el índice fraccional de concentración bactericida (FBCI) y se analizan con el software de Combenefit, mientras que la cinética de desinfección se modela usando los modelos de Chick-Watson y Weibull para caracterizar la dependencia de la concentración y la dinámica de inactivación.

La innovación radica en el diseño racional de interacciones estables duales y triples entre fitoquímicos y biocidas, optimizando la actividad de desinfección mientras minimizan la toxicidad y el impacto ambiental debido a la disminución del uso de biocidas convencionales. También se utilizaron enfoques matemáticos como el cálculo del FBCI y la evaluación de sinergias para cuantificar las interacciones fitoquímico-biocida en el control microbiano. Mientras que FBCI ofrece una interpretación categórica de la interacción (sinergia, antagonismo o indiferencia) en combinaciones específicas de concentraciones, Combenefit permite una evaluación más completa, basada en la superficie de respuesta, de los patrones de interacción en un rango de concentraciones más amplio. Esto permite la visualización y cuantificación de efectos de interacción dependientes de la concentración que pueden no ser capturados por los índices de un solopunto 48,49. Además, la cinética de desinfección se modela utilizandolos modelos 50 de Chick-Watson (para dosis-respuesta) y Weibull (para respuesta temporal). Estos modelos proporcionan modelado cinético de la inactivación microbiana, proporcionando parámetros cuantitativos que describen las tasas de desinfección y el comportamiento de la curva desupervivencia 50. Ayudan a caracterizar si la matanza sigue dinámicas logarítnicas o no lineales y permiten una interpretación más mecanicista de los efectos del tratamiento, que va más allá de la descripción deFBCI 51,52.

Este protocolo garantiza la identificación sistemática de combinaciones prometedoras de fitoquímicos-biocidas y el desarrollo de una estrategia eficiente y sostenible para la desinfección sanitaria. A diferencia de los ensayos clásicos de CIM o tablero de ajedrez, que proporcionan mediciones estáticas de los puntos finales, este protocolo integra modelado bactericida dinámico y análisis de interacción para capturar la magnitud y cinética de la potenciación. Aunque los ensayos clásicos de tablero de ajedrez proporcionan información valiosa sobre las interacciones inhibitorias basadas en los puntos finales de la CIM, se limitan a mediciones de crecimiento e índices de interacción individuales. El protocolo descrito aquí avanza más allá de este marco al cuantificar la actividad bactericida en lugar de la inhibición del crecimiento, evaluar el crecimiento posterior al tratamiento para evaluar efectos antimicrobianos sostenidos, evaluar combinaciones biocida-fitoquímico dual y triple, modelar la cinética de desinfección mediante enfoques de Chick-Watson y Weibull, y aplicar análisis de concentración-respuesta superficial usando Combenefit. Esta estrategia multidimensional permite una evaluación más robusta y predictiva de la potenciación biocida-fitoquímica.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: La metodología propuesta fue adaptada de la Norma Europea EN 127653.

1. Preparación del cultivo

  1. Criopreservar las cepas bacterianas analizadas, Escherichia coli CECT 434 y Staphylococcus aureus CECT 976, almacenándolas en crioviales con glicerol al 30% (v/v) a -80 °C.
  2. Para la recuperación, cultiva bacterias en placas de agar de conteo de placas (PCA) y permite que crezcan durante 24 horas a 25 °C, incubando las placas.
  3. Preparar cultivos de las cepas estudiadas durante la noche inoculando una colonia bacteriana desde una placa estriada en caldo de soja tríptico (TSB) para alcanzar la fase de crecimiento exponencial (según la curva de calibración obtenida en los siguientes pasos), e incubar en una incubadora agitada a 100 rpm y 25 °C.
  4. Utilizando un espectrofotómetro, obtén una curva de calibración de las unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en función de la densidad óptica a 600 nm (OD600) para cada cepa bacteriana bajo las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente.
    1. Cultiva un cultivo bacteriano durante la noche en TSB a 25 °C con agitación (100 rpm).
    2. Preparar diluciones en serie de 10 veces del cultivo en solución salina estéril (0,85% p/v NaCl).
    3. Mide el OD600 de cada dilución usando un espectrofotómetro.
    4. Diluciones apropiadas en la placa en PCA. Incubar las placas a 25 °C durante 24 horas.
    5. Selecciona placas que presenten entre 10 y 100 colonias y determina los valores correspondientes de CFU/mL.
    6. Representar los valores de CFU/mL con las correspondientes lecturas de OD600 dentro del rango lineal (0,04–0,8).
    7. Realizar al menos dos ensayos independientes con al menos dos réplicas. Realizar un análisis de regresión lineal para obtener la ecuación de calibración.
    8. Utiliza la ecuación resultante para estimar las concentraciones bacterianas en experimentos posteriores.
  5. Centrifugar el inócula a 3772 x g durante 10 minutos y lavar una vez con suero tampón de fosfato (PBS) (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L de Na2HPO 4 y 0,24 g/L deKH 2PO4).
  6. Utilizando un espectrofotómetro, ajusta el OD600 del inócula en PBS a 1 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL.

2. Preparación y controles de soluciones moleculares

  1. Considere la selección, estudio y preparación de moléculas probadas de la siguiente manera: utilizar dos biocidas –BAC y PAA (15% (p/v)– y dos fitoquímicos –SAL y EUG 99%.
    NOTA: El BAC fue elegido en este estudio porque es un QAC ampliamente utilizado, eficaz contra bacterias mediante la ruptura demembranas 54,55. El ácido peracético es un desinfectante oxidante de amplio espectro, cada vez más utilizado para la esterilización de instrumentos médicos56,57. El ácido salicílico es un compuesto fenólico de interés porque exhibe actividad antibacteriana y antibiofilm e influye en la virulencia bacteriana y los mecanismos de resistencia a los antibióticos, sugiriendo posibles roles en la desinfección y el controlmicrobiano 58,59. El eugenol es un compuesto aromático terpenoide/fenólico natural con propiedades antimicrobianas reconocidas que puede actuar como una alternativa más segura y ecológica a los desinfectantessintéticos 60,61.
  2. Prepara el BAC y el PAA frescos en agua ultrapura.
  3. La EUG y la SAL disueltas se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO), asegurando que las células nunca estuvieran expuestas a una concentración de DMSO superior al 5%.
  4. Prepare las concentraciones analizadas de BAC, PAA, EUG y SAL, según la Tabla 1.
  5. Prepara las concentraciones probadas en tubos centrífugos de 15 mL ajustando los volúmenes de solución original y suspensión celular para obtener la concentración final de moléculas y densidad celular deseada.
  6. Para todos los ensayos posteriores, incluye dos controles negativos: (i) bacterias sin tratamiento y (ii) bacterias expuestas al 5% de DMSO (ya que esta es la concentración máxima de DMSO a la que las células están expuestas durante los ensayos).

3. Exposición bacteriana a biocidas o fitoquímicos

  1. Añade 1 mL de suspensión de celda a 1 mL de agua ultrapura y espera 2 minutos.
  2. Luego, añade 8 mL de biocida o solución fitoquímica (en agua ultrapura o DMSO al 5%) e incuba en una incubadora agitadora a 100 rpm y 25 °C, durante 30 minutos.
  3. Mezcla los compuestos con las células mediante vórtice.

4. Neutralización, dilución serial y chapado

  1. Realizar la neutralización de cada biocida o fitoquímico en cada concentración analizada utilizando el método de dilución-neutralización y el neutralizador universal: 30 g/L de polisorbatos 80, 30 g/L de saponina, 1 g/L de L-histidina, 3 g/L de lecitina y 5 g/L de tiosulfato sódico en un tampón fosfato de 0,0025 M.
  2. Añadir 1 mL de la muestra a neutralizar a 8 mL de neutralizador universal y 1 mL de aguaultrapura 53.
  3. Realizar una dilución en serie de diez veces añadiendo 100 μL de una dilución específica a 900 μL de solución salina estéril para obtener la dilución posterior (repita esto desde la dilución 10-1 hasta la dilución 10-7), y determina las células supervivientes en las muestras neutralizadas placando 10 μL de cada dilución sobre PCA, según el método de la placade gota 62.
  4. Incubar las placas a 25 °C sin agitar durante 24 horas para el recuento celular.
  5. Se contaron visualmente las UFC para placas que contenían más de 10 y menos de 100 colonias, y la concentración a la que se produce una reducción completa de la culturabilidad se registra como el MBC. Según la ecuación (1), se calcula la UFC/mL, donde n es el número de UFC contadas, SV es el volumen de muestra plateada (0,01 mL) y Dil es la dilución donde se contaron las UFC.
    CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
  6. Evalúa la reducción logarítmica, reducción logarítmica, según la Ecuación (2), donde X0 y X son la CFU/mL para la bacteria no tratada (control) y la bacteria tratada, respectivamente.
    Reducción logarítmica = log (X 0) - log (X) = log (X0/X) (2)

5. Evaluación de combinaciones duales y triples

  1. Aplicar la metodología descrita anteriormente para evaluar la actividad de todas las posibles combinaciones duales y triples de un biocida y uno fitoquímico (para combinaciones duales) o dos fitoquímicos (para combinaciones triples) para buscar posibles efectos de potenciación/sinérgicos.
  2. Consideremos la siguiente elección de concentraciones: para las combinaciones duales, las concentraciones analizadas para el BAC fueron 0,1, 0,5 y 0,75 mg/L; para la PAA eran 0,1, 0,3 y 0,5 mg/L; para SAL eran 50, 100 y 250 mg/L; y para la EUG fueron 100, 250 y 750 mg/L (Tabla 1). En cuanto a la combinación triple, la concentración de BAC fue de 0,75 mg/L; para la PAA era de 0,5 mg/L; para SAL eran 100 y 250 mg/L; y para la eugonografía fueron 250 y 750 mg/L (Tabla 1).
  3. Selecciona las concentraciones, eligiendo las evaluadas en el ensayo dosis-respuesta para moléculas individuales que resultaron en efectos no bactericidas.

6. Evaluación de la regeneración bacteriana

  1. Para evaluar la capacidad de regeneración bacteriana, permite que las células microbianas crezcan en medio líquido durante más de 24 horas, a 25 °C y 100 rpm, tras el tratamiento y la neutralización.
  2. Realizar dilución en serie diez veces, placado, incubación de las placas PCA y cuantificación de la CFU/mL utilizando las mismas técnicas y condiciones.

7. Interpretación de resultados combinatorios – Índice de Concentración Bactericida Fraccional (FBCI)

  1. Interpreta los resultados del análisis combinatorio de la siguiente manera:
    1. Para combinaciones duales, FBCI = FBC(A) + FBC(B), donde la concentración bactericida fraccionaria de A, FBC(A), es la razón entre la MBC de A en combinación dual y la MBC de A por sí sola (combinación MBCA/MBC A sola), y FBC(B) es la razón entre la MBC de B en combinación dual y la MBC de B por sí sola (combinación MBCB/MBC B sola) (Ecuación 3).
    2. Para combinaciones triples, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), donde FBC(A) es la razón entre el MBC de A en la combinación triple y el MBC de A solo (combinación MBCA/MBCA solo), FBC(B) es la razón entre el MBC de B en combinación triple y el MBC de B solo (combinación MBCB/MBC B solo), y FBC(C) es la razón entre el MBC de C en combinación triple y el MBC de C solo (combinación MBC C/MBC C solo) (Ecuación 4).
    3. Aplicando la clasificación propuesta por Fernandes et al.50, FBCI ≤ 0,5 corresponde a sinergismo, 0,5 < FBCI ≤ 1 indica aditividad, 1 < FBCI ≤ 4 se clasifica como indiferencia y FBCI > 4,00 se considera antagonismo.
      FBC(A) + FBC(B) = (combinación dual MBC/MBCA solo) + (combinación dual MBCB/MBC B solo) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (combinación triple MBC A/MBC A solo) + (combinación triple MBCB/MBC B solo) + (combinación triple MBCC/MBC C solo) (4)

8. Procedimiento para el ensayo de respuesta en tiempo

  1. Preparar los cultivos nocturnos de E. coli CECT 434 y S. aureus CECT 976 según las condiciones de crecimiento descritas anteriormente (sección 1).
  2. Añade 1 mL de suspensión de celda a 1 mL de agua ultrapura y espera 2 minutos. En este punto, añade 8 mL de solución biocida/fitoquímica (en agua ultrapura o DMSO al 5%) para alcanzar las concentraciones deseadas para cada molécula: 1/4 x MBC y MBC, y para la suspensión bacteriana (ajustando la OD), a 100 rpm y 25 °C. Mezcla las moléculas con las células mediante vórtice.
  3. Evalúa los siguientes tiempos de exposición: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 y 90 min.
  4. Como se describe en la sección 4, evalúe la actividad antimicrobiana calculando la reducción logarítmica (CFU/mL) como logarítmic (X/X0).
  5. Realizar la neutralización biocida o fitoquímica para cada par de concentraciones/tiempo probado utilizando el método de dilución-neutralización y el neutralizador universal, la dilución y el chapado en serie, como se describe anteriormente en la sección 4.

9. Análisis de datos combinatorios con el software Combenefit

  1. Abre el archivo proporcionado 'REPLICATE_TEMPLATE.xls', en https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ , para asegurar la estructura y el formato adecuados.
  2. Organiza tus datos en una matriz, según la Tabla Suplementaria 1, donde:
    1. Aumenta las concentraciones del producto A de arriba hacia abajo (de las filas más bajas a las más numeradas). Incluye al menos tres concentraciones diferentes para el producto A.
    2. Aumentar las concentraciones del producto B de izquierda a derecha (de la columna número más baja a la más alta): Incluir al menos tres concentraciones diferentes para el producto B.
    3. Representa la fila superior (producto A) de agente único B.
    4. Representa la primera columna (0 mg/L producto B) producto monoagente A.
    5. Representa la célula (0,0) como es el control sin tratar.
    6. Normalizar, para cada caso, los valores utilizados, usando la Ecuación (5), donde el treat_0h es el logaritmo (CFU/mL) para un tratamiento específico, inmediatamente después de la exposición (0h); treat_24h es el logaritmo (UFC/mL) para un tratamiento específico, 24 horas después de la exposición (regeneración); control_0h es el logaritmo (CFU/mL) para el control correspondiente (solo células o células expuestas al 5% de DMSO), inmediatamente después de la exposición (0 h); y control_24h es el logaritmo (CFU/mL) para el control correspondiente (solo células o células expuestas al 5% de DMSO), 24 horas después de la exposición (regeneración).
    7. Realizar, en todos los casos, la enumeración de UFC tras una incubación de 24 horas de muestras en placas sobre PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      NOTA: Incluye controles/condiciones no tratadas que definen la viabilidad del 100% y un control positivo que define la inhibición máxima (opcional); Usa solo valores numéricos, sin fórmulas; Utiliza el mismo número de filas y columnas entre réplicas; Usa '.' para decimales.
  3. Guarda el archivo como .xls o .xlsx.
  4. Crea un archivo de Excel para cada réplica, como se ha descrito antes y como en la Tabla Suplementaria 1, y añade todos los archivos en la misma carpeta.
  5. Abre el software Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, versión 2.021, disponible en https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
  6. Sube esa carpeta al Combenefit.
    1. Abre el software Combenefit
    2. Pulsa Select carpeta de proyecto y elige la carpeta correcta.
    3. Seleccionando el modelo de referencia: aditividad de Loewe que asume el mecanismo exacto para ambos productos; Bliss independiente que asume acción independiente, o HAS, que es un modelo conservador (compara la combinación con el mejor agente único). La mejor práctica consiste en ejecutar al menos dos modelos y elegir el mejor.
    4. En este caso, se seleccionó el modelo Bliss, dado el modo de acción de las moléculas probadas.
    5. Selecciona las salidas gráficas deseadas, sabiendo que debes seleccionar al menos una más para la distribución de Synergy.
    6. Análisis de Press Run (Figura suplementaria 1). Consejo: En la ventana Elegir guardar durante el análisis, selecciona Todo para guardar todas las salidas gráficas resultantes en la carpeta original.

10. Aplicación de los modelos Chick-Watson y Weibull a datos de dosis y respuesta temporal

  1. Prepara tus datos formateando el conjunto de datos en Excel o CSV antes de importarlos: para dosis-respuesta, la columna A corresponde a la dosis (concentración, mg/L) y la columna B corresponde al logarítmic (X/X₀); Para los datos de respuesta en tiempo, la columna A corresponde al tiempo (minutos) y la columna B corresponde al logarítmic (X/X₀).
  2. Guarda tu archivo en '.csv' o copia y pega directamente en Prism.
  3. Open GraphPad Prism (versión utilizada: 9.0 para Windows 11; La Jolla, California, EE. UU.).
  4. En Tabla y gráfico nuevos, selecciona XY, y en tabla de datos, selecciona Introducir o importar datos en una tabla nueva (Figura suplementaria 2).
  5. En Opciones, para X, selecciona Número; para Y, selecciona Introducir valores replicados en subcolumnas lado a lado y pulsa Crear (Figura suplementaria 2).
  6. Introduce los datos de dosis/tiempo en X y registra los datos de supervivencia en Y.
  7. Ve a Analizar, Regresión no lineal (ajuste de curva), selecciona los conjuntos de datos que quieres analizar y pulsa OK (Figura suplementaria 2).
  8. Selecciona Nuevo y luego Crear nueva ecuación.
  9. En Ecuación, para Tipo de Ecuación, elige Ecuación Explícita: Y = una función de X y los parámetros; para el Nombre, escriba Modelo Chick-Watson/Modelo Weibull; y en la definición escribe Y = -a*x^(n)*30 Modelo de Chick-Watson (Figura Suplementaria 3) y Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b) para el Modelo de Weibull (Figura Suplementaria 4).
    NOTA: El modelo de Chick-Watson se expresa mediante la Ecuación 6, donde X0 y X son la CFU/mL para las bacterias no tratadas (control) y las bacterias tratadas, C es la concentración (dosis), kdis es el coeficiente de tasa de inactivación, C es la concentración (dosis), n es el exponente de concentración y t es el tiempo de exposición (en este caso, 30 min)50. Se aplicó el modelo de Chick-Watson para observar la dosis-respuesta y caracterizar la relación entre la concentración de desinfectante y la reducción microbiana.
    log (X/X₀) = -k dis · Cⁿ · t (6)
    NOTA: El modelo de Weibull se expresa mediante la Ecuación 7, donde X0 y X son la CFU/mL para las bacterias no tratadas (control) y las bacterias tratadas, t es el tiempo, α es el parámetro de escala (tiempo característico) y β es el parámetro de forma50. El modelo de Weibull se aplicó para observar la respuesta temporal y caracterizar la forma de las curvas de supervivencia. El parámetro de escala representa el tiempo característico de inactivación, mientras que el parámetro de forma describe desviaciones respecto al comportamiento log-lineal (β = 1 log-lineal; β < 1 cola; β > un hombro).
    log (X/X 0) = -1/2,303 (t/α)^β (7)
  10. En Roles para Valores Iniciales, elige 0 como Valor Inicial para cada parámetro y (Valor Inicial, a ajustar) como la Regla (Figura Suplementaria 5).
  11. Mantén el resto de la configuración como predeterminada y pulsa OK.
  12. Ejecuta el ajuste e inspecciona los parámetros estimados.

11. Replicación biológica

  1. Realizar, para todos los ensayos, al menos dos experimentos independientes con al menos dos réplicas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio evaluó la actividad bactericida de los cuatro compuestos analizados — BAC, PAA, SAL y EUG — frente a E. coli CECT 434 y S. aureus CECT 976. Como se muestra en las Figuras 1 y 2, BAC, PAA, SAL y EUG mostraron un aparente efecto dependiente de la concentración sobre la culturabilidad. La Tabla 2 presenta los valores de MBC para las moléculas probadas tras la exposición y 24 horas des...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo presentado en este estudio proporciona un marco integrado para evaluar la actividad bactericida de dos biocidas comúnmente usados – BAC y PAA – y dos fitoquímicos prometedores – EUG y SAL – individualmente y en combinación (combinaciones duales y triples), frente a E. coli y S. aureus. Varios pasos dentro de este protocolo son especialmente críticos para garantizar la reproducibilidad y la interpretación precisa de las interacciones antimicrobianas. Estos incluyen la estanda...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni conflictos de interés en la redacción de este artículo y que no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por: Project InnovAntiBiofilm (ref. 101157363) financiado por la Comisión Europea (Horizon-Widera 2023- Access-02/Horizon-CSA); Proyectos MultAntiBiofilm (ref. COMPETE2030-FEDER00852000; Nº 17121) y HCAI_Disinfect (ref. COMPETE2030-FEDER-00752300; Nº 16360) financiado a través del Programa Operativo de Factores de Competitividad - COMPETE, y fondos nacionales de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FCT); LEPABE, UID/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/00511/2025) y UID/PRR/00511/2025 (https://doi.org/10.54499/UID/PRR/00511/2025) y ALiCE, LA/P/0045/2020 (https://doi.org/10.54499/LA/P/0045/2020), financiados por fondos nacionales a través de la FCT/MCTES (PIDDAC; Lisboa, Portugal). La beca doctoral de Mariana Sousa (2023.00337.BD; https://doi.org/10.54499/2023.00337.BD) es proporcionada por el FCT.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cloruro de benzalconio  Merck, España8.14363.0100Biocidio
Mega Star 600R centrifugadaVWR, EE. UU.VWR Mega Star 600R-
Combenefit - Versión 2.021Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, Reino Unido-Software para la evaluación de sinergismos
CuvettesVWR, AlemaniaVWRI634-0678Cuvetas de 1,5 mL para ajuste óptico de densidad
Agua destilada--Para la preparación de medios
Dimetilsulfóxido (DMSO)VWR, Francia23500.322Disolvente orgánico
Bucles de inoculación desechablesVWR, ItaliaVWRI612-935710 & mu; Bucles de inoculación en L
Tubos EppendorfVWR, ChinaVWRI525-1164Tubos de bloqueo de caja fuerte eppendorf de 1,5 mL  
Escherichia coliColección de Cultura de Tipo Español (CECT)434Cepa de referencia utilizada en este estudio
EtanolVWR, Francia83813.36Para la desfección de la obra, el material y las manos
Eugenol 99%Sigma-Aldrich, EE. UU.163333Fitoquímicos
Tubos FalconVWR, EE. UU.VWRI525-1085Tubos de halcón de 15 mL
Tubos FalconVWR, BélgicaVWRI525-1109Tubos Falcon de 50 mL
GraphPad Prism 9.0 para Windows 11La Jolla, California, EE. UU.-Software para análisis matemático y estadístico
LecitinaAlfa Aesar, AlemaniaQ04A010-
L-histidinaMerck, EE. UU.1.04351.0025-
Incubadora orbitalVWR, EE. UU.VWR 5000I Agitador incubador 230V-
Ácido peracético 15%AppliChem, Alemania143495-1211Biocidio
Placas de PetriVWR, ItaliaVWRI391-0582-
Pipeta 1 - 10 mLVWR, EE. UU.-
Pipeta 100 - 1000 y mu; LVWR, EE. UU.-
Puntas de pipeta 100 - 1000 y mu; LFrilabo, Portugal1-202-50-0-
Pippette 20 - 200 μ LVWR, EE. UU.-
Puntas de pippette 1 - 10 mLVWR, BélgicaVWRI613-7094-
Puntas Pippette 2 - 200 y mu; LVWR, MéxicoVWRI613-6418-
Agar de recuento de placasVWR, Bélgica84608-0500Aislamiento y cultivo de microorganismos
Polisorbato 80VWR, EE. UU.20E2756726-
Cloruro de potasio - KCl VWR, Bélgica11D110008-
Fosfato de Dihidrógeno Potásico - KH2PO4VWR, Alemania26931.263-
Ácido sacilíticoSigma-Aldrich, EE. UU.84210-500GFitoquímicos
SaponinaVWR, Alemania21A124103-
Cloruro de sodio - NaClVWR, Bélgica27788.297-
Fosfato de hidrógeno sódico - Na2HPO4VWR, Bélgica28026.26-
Tiosulfato sódico - Na2S2O3VWR, EE. UU.18D2056589-
EspectrofotómetroVWR, EE. UU.Espectrofotómetro UV-1600PCAjuste de densidad óptica
Staphylococcus aureusColección de Cultura de Tipo Español (CECT)976Cepa de referencia utilizada en este estudio
Caldo de soja tríptico  Merck, Alemania1.05459.0500Aislamiento y cultivo de microorganismos
Agua ultrapura--Para la preparación de muestras

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salam, M. A., et al. Antimicrobial resistance: A growing serious threat for global public health. Healthcare. 11 (13), 1946(2023).
  2. Szabó, S., et al. An overview of healthcare associated infections and their detection methods caused by pathogen bacteria in Romania and Europe. Journal of Clinical Medicine. 11 (11), 3204(2022).
  3. Dadi, N. C. T., Radochová, B., Vargová, J., Bujdáková, H. Impact of healthcare-associated infections connected to medical devices - An update. Microorganisms. 9 (11), 2332(2021).
  4. Russotto, V., et al. What healthcare workers should know about environmental bacterial contamination in the intensive care unit. BioMed Research International. 2017, 6905450(2017).
  5. Ssekitoleko, R. T., et al. The role of medical equipment in the spread of nosocomial infections: A cross-sectional study in four tertiary public health facilities in Uganda. BMC Public Health. 20 (1), 1561(2020).
  6. Bongiovanni, M., Barilaro, G., Zanini, U., Giuliani, G. Impact of the COVID-19 pandemic on multidrug-resistant hospital-acquired bacterial infections. Journal of Hospital Infection. 123, 191-192 (2022).
  7. Witt, L. S., Howard-Anderson, J. R., Jacob, J. T., Gottlieb, L. B. The impact of COVID-19 on multidrug-resistant organisms causing healthcare-associated infections: A narrative review. JAC-Antimicrobial Resistance. 5 (1), dlac130(2023).
  8. Wieler, L. H., Ewers, C., Guenther, S., Walther, B., Lübke-Becker, A. Methicillin-resistant staphylococci and extended-spectrum beta-lactamases-producing Enterobacteriaceae in companion animals: Nosocomial infections as one reason for the rising prevalence of these potential zoonotic pathogens in clinical samples. International Journal of Medical Microbiology. 301 (8), 635-641 (2011).
  9. Ghosh, S., Basu, S., Anbarasu, A., Ramaiah, S. A comprehensive review of antimicrobial agents against clinically important bacterial pathogens: Prospects for phytochemicals. Phytotherapy Research. 39 (1), 138-161 (2025).
  10. McDonnell, G., Russell, A. D. Antiseptics and disinfectants: Activity, action, and resistance. Clinical Microbiology Reviews. 12 (1), 147-179 (1999).
  11. Maillard, J. Y. Antimicrobial biocides in the healthcare environment: Efficacy, usage, policies, and perceived problems. Therapeutics and Clinical Risk Management. 1 (4), 307-320 (2005).
  12. Muteeb, G., Rehman, M. T., Shahwan, M., Aatif, M. Origin of antibiotics and antibiotic resistance, and their impacts on drug development: A narrative review. Pharmaceuticals. 16 (11), 1615(2023).
  13. Coombs, K., Rodriguez-Quijada, C., Clevenger, J. O., Sauer-Budge, A. F. Current understanding of potential linkages between biocide tolerance and antibiotic cross-resistance. Microorganisms. 11 (8), 2000(2000).
  14. Russell, A. D. Similarities and differences in the responses of microorganisms to biocides. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (5), 750-763 (2003).
  15. Maillard, J. Y. Resistance of bacteria to biocides. Microbiology Spectrum. 6 (2), (2018).
  16. Russell, A. D. Bacterial adaptation and resistance to antiseptics, disinfectants and preservatives is not a new phenomenon. Journal of Hospital Infection. 57 (2), 97-104 (2004).
  17. Amsalu, A., et al. Efflux pump-driven antibiotic and biocide cross-resistance in Pseudomonas aeruginosa isolated from different ecological niches: A case study in the development of multidrug resistance in environmental hotspots. Microorganisms. 8 (11), 1647(2020).
  18. Sanchez, P., Moreno, E., Martinez, J. L. The biocide triclosan selects Stenotrophomonas maltophilia mutants that overproduce the SmeDEF multidrug efflux pump. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 781-782 (2005).
  19. Russell, A. D. Introduction of biocides into clinical practice and the impact on antibiotic-resistant bacteria. Journal of Applied Microbiology. 92 (s1), 121S-135S (2002).
  20. Sousa, M., Machado, I., Simões, L. C., Simões, M. Biocides as drivers of antibiotic resistance: A critical review of environmental implications and public health risks. Environmental Science and Ecotechnology. 25, 100557(2025).
  21. Gilbert, P., McBain, A. J. Potential impact of increased use of biocides in consumer products on prevalence of antibiotic resistance. Clinical Microbiology Reviews. 16 (2), 189-208 (2003).
  22. Zhao, A., Sun, J., Liu, Y. Understanding bacterial biofilms: From definition to treatment strategies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 13, 1137947(2023).
  23. Grari, O., et al. A comprehensive review on biofilm-associated infections: Mechanisms, diagnostic challenges, and innovative therapeutic strategies. The Microbe. 8, 100436(2025).
  24. Almatroudi, A. Biofilm resilience: Molecular mechanisms driving antibiotic resistance in clinical contexts. Biology. 14 (2), 165(2025).
  25. Liu, H. Y., Prentice, E. L., Webber, M. A. Mechanisms of antimicrobial resistance in biofilms. npj Antimicrobials and Resistance. 2 (1), 27(2024).
  26. Sharif, S., Yadav, A. K. Bacterial biofilm and its role in antibiotic resistance. The Microbe. 7, 100356(2025).
  27. Assefa, M., Amare, A. Biofilm-associated multi-drug resistance in hospital-acquired infections: A review. Infection and Drug Resistance. 15, 5061-5068 (2022).
  28. Sandu, A. M., et al. Healthcare-associated infections: The role of microbial and environmental factors in infection control - A narrative review. Infectious Diseases and Therapy. 14 (5), 933-971 (2025).
  29. Ogbuagu, O., et al. Novel phytochemicals in traditional medicine: Isolation and pharmacological profiling of bioactive compounds. International Journal of Medical All Body Health Research. 3 (1), 63-71 (2022).
  30. Tegos, G., Stermitz, F. R., Lomovskaya, O., Lewis, K. Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant antimicrobials. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (10), 3133-3141 (2002).
  31. Simões, M., Bennett, R. N., Rosa, E. A. S. Understanding antimicrobial activities of phytochemicals against multidrug resistant bacteria and biofilms. Natural Product Reports. 26 (6), 746-757 (2009).
  32. Górniak, I., Bartoszewski, R., Króliczewski, J. Comprehensive review of antimicrobial activities of plant flavonoids. Phytochemistry Reviews. 18 (1), 241-272 (2019).
  33. Lee, J. H., et al. Anti-biofilm activities of quercetin and tannic acid against Staphylococcus aureus. Biofouling. 29 (5), 491-499 (2013).
  34. Memariani, H., Memariani, M., Ghasemian, A. An overview on anti-biofilm properties of quercetin against bacterial pathogens. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 35 (9), 143(2019).
  35. Borges, A., et al. New perspectives on the use of phytochemicals as an emergent strategy to control bacterial infections including biofilms. Molecules. 21 (7), 877(2016).
  36. Gomes, I. B., Malheiro, J., Mergulhão, F., Maillard, J. Y., Simões, M. Comparison of the efficacy of natural-based and synthetic biocides to disinfect silicone and stainless steel surfaces. Pathogens and Disease. 74 (4), ftw014(2016).
  37. Fernández Fuentes, M. A., et al. Synergistic activity of biocides and antibiotics on resistant bacteria from organically produced foods. Microbial Drug Resistance. 20 (5), 383-391 (2014).
  38. El-Saadony, M. T., et al. Medicinal plants: Bioactive compounds, biological activities, combating multidrug-resistant microorganisms, and human health benefits - A comprehensive review. Frontiers in Immunology. 16, 1491777(2025).
  39. Barbieri, R., et al. Phytochemicals for human disease: An update on plant-derived compounds antibacterial activity. Microbiological Research. 196, 44-68 (2017).
  40. Popovic, L., Rijkers, G. T. Phytochemicals: Principles and practice. Biology. 15 (1), 18(2025).
  41. Yang, Y., Ling, W. Health benefits and future research of phytochemicals: A literature review. Journal of Nutrition. 155 (1), 87-101 (2025).
  42. Jain, A., Madu, C. O., Lu, Y. Phytochemicals in chemoprevention: A cost-effective complementary approach. Journal of Cancer. 12 (12), 3686-3700 (2021).
  43. Rezaee Danesh, Y., Mulet, J. M., Porcel, R. Bridging microbial biocontrol and phytochemical biopesticides: Synergistic approaches for sustainable crop protection. Plants. 14 (22), 3453(2025).
  44. Kocamaz, D., Merchan, O. Environmental perspectives on biopesticides: Current knowledge and research gaps. Pesticides - Balancing Efficient Pest Control with Environmental and Health Safety. , IntechOpen. (2026).
  45. Rahaman, M. T., Moshwan, M. M. Sustainable functionalization of biodegradable materials for mosquito repellent textiles: A review of sources, application, and research directions. Hybrid Advances. 12, 100600(2026).
  46. Sun, S., et al. Impact of extraction techniques on phytochemical composition and bioactivity of natural product mixtures. Frontiers in Pharmacology. 16, 1615338(2025).
  47. Poslinski, H., Hatley, M., Tramell, J., Song, B. H. Harnessing phytochemicals in sustainable and green agriculture. Journal of Agriculture and Food Research. 19, 101633(2025).
  48. Di Veroli, G. Y., et al. Combenefit: An interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations. Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).
  49. Ormeneanu, V. P., et al. Synergistic interactions between natural phenolic compounds and antibiotics against multidrug-resistant K. pneumoniae: A pooled analysis of 216 in vitro tests. Microorganisms. 13 (11), 2497(2025).
  50. Fernandes, S., Gomes, I. B., Simões, M. Antimicrobial activity of glycolic acid and glyoxal against Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens. Food Research International. 136, 109346(2020).
  51. Peleg, M. Modeling the dynamic kinetics of microbial disinfection with dissipating chemical agents-a theoretical investigation. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (2), 539-549 (2021).
  52. Buzrul, S. The Weibull model for microbial inactivation. Food Engineering Reviews. 14 (1), 66-77 (2022).
  53. European Committee for Standardization. Chemical disinfectants and antiseptics – Quantitative suspension test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics used in food, industrial, domestic and institutional areas – Test method and requirements. , European Standard EN 1276. Brussels. (2019).
  54. Oh, S., et al. Microbial community degradation of widely used quaternary ammonium disinfectants. Applied and Environmental Microbiology. 80 (19), 5892-5900 (2014).
  55. Merchel Piovesan Pereira, B., Tagkopoulos, I. Benzalkonium chlorides: Uses, regulatory status, and microbial resistance. Applied and Environmental Microbiology. 85 (13), e00377-e00319 (2019).
  56. Kitis, M. Disinfection of wastewater with peracetic acid: A review. Environment International. 30 (1), 47-55 (2004).
  57. Lin, Y., et al. Underlying the mechanisms of pathogen inactivation and regrowth in wastewater using peracetic acid-based disinfection processes: A critical review. Journal of Hazardous Materials. 463, 132868(2024).
  58. Sykes, E. M. E., White, D., McLaughlin, S., Kumar, A. Salicylic acids and pathogenic bacteria: New perspectives on an old compound. Canadian Journal of Microbiology. 70 (1), 1-14 (2024).
  59. Kantouch, A., El-Sayed, A. A., Salama, M., El-Kheir, A. A., Mowafi, S. Salicylic acid and some of its derivatives as antibacterial agents for viscose fabric. International Journal of Biological Macromolecules. 62, 603-607 (2013).
  60. Ulanowska, M., Olas, B. Biological properties and prospects for the application of eugenol - A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3671(2021).
  61. Jeyakumar, G. E., Lawrence, R. Mechanisms of bactericidal action of eugenol against Escherichia coli. Journal of Herbal Medicine. 26, 100406(2021).
  62. Di Salvo, L. P., et al. The drop plate method as an alternative for Azospirillum spp. viable cell enumeration within the consensus protocol of the REDCAI network. Revista Argentina de Microbiología. 54 (2), 152-157 (2022).
  63. Bridier, A., Briandet, R., Thomas, V., Dubois-Brissonnet, F. Comparative biocidal activity of peracetic acid, benzalkonium chloride and ortho-phthalaldehyde on 77 bacterial strains. Journal of Hospital Infection. 78 (3), 208-213 (2011).
  64. Fink, R. Terpenoids as natural agents against food-borne bacteria - Evaluation of biofilm biomass versus viability reduction. Processes. 11 (1), 148(2023).
  65. Randall, T. E., et al. Bacterial repair and recovery after UV LED disinfection: Implications for water reuse. Environmental Science: Water Research and Technology. 8 (8), 1700-1708 (2022).
  66. Wang, M., Ateia, M., Hatano, Y., Yoshimura, C. Regrowth of Escherichia coli in environmental waters after chlorine disinfection: Shifts in viability and culturability. Environmental Science: Water Research and Technology. 8 (7), 1521-1534 (2022).
  67. Puxeddu, S., et al. Beyond one-size-fits-all: Addressing methodological constraints in novel antimicrobials discovery. Antibiotics. 14 (8), 848(2025).
  68. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 8, 364(2017).
  69. Maillard, J. Y. Bacterial target sites for biocide action. Journal of Applied Microbiology. 92 (s1), 16S-27S (2002).
  70. Lambert, R. J., Johnston, M. D. The effect of interfering substances on the disinfection process: A mathematical model. Journal of Applied Microbiology. 91 (3), 548-555 (2001).
  71. Cheng, K., et al. Staphylococcus aureus SOS response: Activation, impact, and drug targets. mLife. 3 (3), 343-366 (2024).
  72. Patacq, C., Chaudet, N., Letisse, F. Crucial role of ppGpp in the resilience of Escherichia coli to growth disruption. bioRxiv. , (2020).
  73. Kim, T. K., Jang, M., Hwang, Y. S. Adsorption of benzalkonium chlorides onto polyethylene microplastics: Mechanism and toxicity evaluation. Journal of Hazardous Materials. 426, 128076(2022).
  74. Jang, M. H., et al. Elucidating adsorption mechanisms of benzalkonium chlorides on polypropylene and polyethylene terephthalate microplastics: Effects of BACs alkyl chain length and microplastic characteristics. Journal of Hazardous Materials. 468, 133765(2024).
  75. Wang, Y. W. Evaluation of self-heating models for peracetic acid using calorimetry. Process Safety and Environmental Protection. 133, 122-131 (2018).
  76. Kamatou, G. P., Vermaak, I., Viljoen, A. M. Eugenol - From the remote Maluku Islands to the international market place: A review of a remarkable and versatile molecule. Molecules. 17 (6), 6953-6981 (2012).
  77. Mihara, S., Shibamoto, T. Photochemical reactions of eugenol and related compounds: Synthesis of new flavor chemicals. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 30 (6), 1215-1218 (1982).
  78. Gangwang Liu, G., Liu, H., Zhang, N., Wang, Y. Photodegradation of salicylic acid in aquatic environment: Effect of different forms of nitrogen. Science of the Total Environment. , 435-577 (2012).
  79. Kassir, M., et al. Enhanced photocatalytic degradation of salicylic acid in water-ethanol mixtures from titanium dioxide grafted with hexadecyltrichlorosilane. Physics Procedia. 55, 403-408 (2014).
  80. Houchmandzadeh, B., Ballet, P. A novel procedure for CFU plating and counting. Journal of Microbiological Methods. 206, 106693(2023).
  81. Marro, F. C., Laurent, F., Josse, J., Blocker, A. J. Methods to monitor bacterial growth and replicative rates at the single-cell level. FEMS Microbiology Reviews. 46 (6), fuac030(2022).
  82. Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLOS ONE. 11 (2), e0148469(2016).
  83. Hussain, M. S., Tango, C. N., Oh, D. H. Inactivation kinetics of slightly acidic electrolyzed water combined with benzalkonium chloride and mild heat treatment on vegetative cells, spores, and biofilms of Bacillus cereus. Food Research International. 116, 157-167 (2019).
  84. Basavegowda, N., Baek, K. H. Combination strategies of different antimicrobials: An efficient and alternative tool for pathogen inactivation. Biomedicines. 10 (9), 2219(2022).
  85. Haindongo, E. H., et al. Antimicrobial resistance prevalence of Escherichia coli and Staphylococcus aureus amongst bacteremic patients in Africa: A systematic review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 32, 35-43 (2023).
  86. Kim, M., et al. Widely used benzalkonium chloride disinfectants can promote antibiotic resistance. Applied and Environmental Microbiology. 84 (17), e01201-e01218 (2018).
  87. Barros, A. C., Melo, L. F., Pereira, A. A multi-purpose approach to the mechanisms of action of two biocides: Benzalkonium chloride and dibromonitrilopropionamide. Discussion of Pseudomonas fluorescens viability and death. Frontiers in Microbiology. 13, 842414(2022).
  88. Pironti, C., et al. Comparative analysis of peracetic acid and permaleic acid in disinfection processes. Science of the Total Environment. 797, 149206(2021).
  89. Qiao, C., et al. Advances of carbon-based materials for activating peracetic acid in advanced oxidation processes: A review. Environmental Research. 263, 120058(2024).
  90. Marjani, A., Golalipour, M. J., Gharravi, A. M. The effects of subacute exposure of peracetic acid on lipid peroxidation and hepatic enzymes in Wistar rats. Oman Medical Journal. 25 (4), 256-260 (2010).
  91. Yoo, J. H. Review of disinfection and sterilization - Back to the basics. Infection and Chemotherapy. 50 (2), 101-109 (2018).
  92. Arif, T. Salicylic acid as a peeling agent: A comprehensive review. Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 8, 455-461 (2015).
  93. Staroń, A., Pucelik, B., Barzowska, A., Pulit-Prociak, J. Synthesis and characteristics of biocidal oil composites enhanced with thymol and salicylic acid. Clean Technologies and Environmental Policy. 26 (10), 3481-3505 (2024).
  94. Reyes-Fernández, E. Z., Schuldiner, S. Acidification of cytoplasm in Escherichia coli provides a strategy to cope with stress and facilitates development of antibiotic resistance. Scientific Reports. 10 (1), 9954(2020).
  95. Song, X., Li, R., Zhang, Q., He, S., Wang, Y. Antibacterial effect and possible mechanism of salicylic acid microcapsules against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (19), 12761(2022).
  96. Hyldgaard, M., Mygind, T., Meyer, R. L. Essential oils in food preservation: Mode of action, synergies, and interactions with food matrix components. Frontiers in Microbiology. 3, 12(2012).
  97. Shariati, A., et al. Inhibitory effect of natural compounds on quorum sensing system in Pseudomonas aeruginosa: A helpful promise for managing biofilm community. Frontiers in Pharmacology. 15, 1350391(2024).
  98. Pedreira, A., Fernandes, S., Simões, M., García, M. R., Vázquez, J. A. Synergistic bactericidal effects of quaternary ammonium compounds with essential oil constituents. Foods. 13 (12), 1831(2024).
  99. Cameron, S. J., Sheng, J., Hosseinian, F., Willmore, W. G. Nanoparticle effects on stress response pathways and nanoparticle-protein interactions. International Journal of Molecular Sciences. 23 (14), 7962(2022).
  100. Nabarro, J., et al. Lipopolysaccharide lateral mobility in the Gram-negative bacterial outer membrane is confined and governed by interactions within the conserved Lipid A anchor. bioRxiv. , (2025).
  101. Vaara, M., Nurminen, M. Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (6), 1459-1462 (1999).
  102. Garde, S., Chodisetti, P. K., Reddy, M. Peptidoglycan: Structure, synthesis, and regulation. EcoSal Plus. 9 (2), 0010-2020 (2021).
  103. Nikolic, P., Mudgil, P. The cell wall, cell membrane and virulence factors of Staphylococcus aureus and their role in antibiotic resistance. Microorganisms. 11 (2), 259(2023).
  104. Wang, M., Buist, G., van Dijl, J. M. Staphylococcus aureus cell wall maintenance - The multifaceted roles of peptidoglycan hydrolases in bacterial growth, fitness, and virulence. FEMS Microbiology Reviews. 46 (5), fuac025(2022).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Potenciaci n de biocidasactividad antimicrobianaadyuvantes fitoqu micosconcentraci n bactericida m nimarespuesta a la dosisrespuesta temporalefectos sin rgicoscombinaciones de biocidascontrol microbiano
Video próximamente

Artículos relacionados