Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Miografía de alambre para la aorta dorsal y las arterias de resistencia mesentérica de ratones y ratas

596 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

27 de febrero de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Proporcionamos un protocolo detallado para miografías con alambre lado a lado para evaluar la reactividad vascular en arterias de conducto frente a resistencia aisladas de ratones y ratas.

Resumen

La miografía por alambre es una técnica ex vivo ampliamente utilizada para la evaluación cuantitativa de la función vascular en arterias aisladas. Dado que las arterias de conducto grande y las arterias de resistencia pequeñas difieren fundamentalmente en estructura y función fisiológica, analizar ambas clases de vasos en paralelo utilizando arterias extraídas del mismo ratón o ratón permite comparaciones emparejadas que reducen la variabilidad entre animales y revelan cambios funcionales específicos de cada vaso. Este artículo presenta un protocolo paso a paso para evaluar la reactividad vascular en arterias aisladas de conductos y resistencia murinos mediante miografía isométrica por hilo. Describimos la preparación de un tampón fisiológico fresco y oxigenado; disección cuidadosa, limpieza y montaje de los segmentos arteriales; y la normalización para situar los recipientes cerca de su longitud óptima para la generación activa de fuerza. Se proporciona una guía de resolución de problemas y una secuencia experimental de ejemplo para generar curvas de concentración-respuesta acumulativas para vasoconstrictores y vasodilatadores estándar. Este protocolo permite la medición cuantitativa tanto de la función del músculo endotelial como de la liso, y facilita la detección de alteraciones específicas de los vasos en la reactividad vascular asociadas a enfermedades vasculares, como la hipertensión.

Introducción

La hipertensión se caracteriza por una reactividad vascular alterada, como disfunción endotelial e hiperrreactividad del músculo liso vascular frente a vasoconstrictores1. Estos cambios funcionales, junto con la remodelación microvascular y la rarefacción, contribuyen a una perfusión tisular deficiente y a una presión arterial desregulada 2,3,4. Los ensayos ex vivo de vasos aislados son herramientas poderosas para diseccionar los mecanismos celulares y moleculares que controlan el tono vascular en salud y enfermedad, ya que permiten un control preciso del microambiente vascular y la manipulación farmacológica selectiva de las vías de señalización del músculo liso y endotelial.

La reactividad vascular en arterias aisladas se evalúa comúnmente utilizando dos técnicas complementarias ex vivo: miografía por alambre y miografía por presión 5,6. En miografía de alambre, los anillos o segmentos del recipiente se montan sobre pines o cables, y se registra la fuerza isométrica 7,8. En miografía por presión, los segmentos intactos del vaso se canulan y presurizan a una presión intraluminal definida, y el diámetro del vaso se registra mediantevideomicroscopía 9. A diferencia de la miografía por alambre, la miografía por presión permite controlar la presión transmural y el flujo intralumínico. Así, recapitula más fielmente el entorno hemodinámico in vivo de las arterias de resistencia y se utiliza comúnmente para estudiar el tono miogénico, las respuestas mediadas por flujo y las propiedades estructurales o mecánicasvasculares 9,10. Por el contrario, la miografía por alambre es técnicamente más fácil de implementar (sin canulación ni microscopía de vídeo), soporta un mayor rendimiento utilizando sistemas comerciales de múltiples cámaras, y es muy adecuada para generar curvas farmacológicas reproducibles de concentración-respuesta en arterias pequeñas a medianas con diámetros del orden de decenas a varios cientos demicrómetros 5,6. Por ello, la miografía por alambre suele preferirse para el perfilado farmacológico lado a lado de la reactividad vascular en arterias de conductos y resistencia aisladas de ratones o ratas.

Las arterias conducto (gran elasticidad) y las arterias de resistencia (pequeñas arterias musculares) difieren fundamentalmente en estructura y función, y estas diferencias dictan consideraciones y puntos finales experimentales distintos. Las arterias conducto (por ejemplo, la aorta torácica descendente) contienen grandes cantidades de tejido elástico y una masa muscular lisa considerable; Las arterias de resistencia (por ejemplo, arterias mesentéricas) tienen relaciones músculo-lumen lisas relativamente mayores y son determinantes principales de la resistencia periférica y la autorregulaciónlocal 11,12. Dado que el mismo agonista puede activar diferentes respuestas moleculares en estos lechos vasculares, la comparación lado a lado de los conductos y vasos de resistencia del mismo animal proporciona información complementaria útil. Por ejemplo, en las arterias conducidas, la liberación de óxido nítrico derivada del endotelio es la vía relajante predominante por la cual la acetilcolina (ACh) induce la vasorelajación13,14. En contraste, en arterias de resistencia pequeña, la ACh induce relajación mediante óxido nítrico, prostaciclina y, de forma importante, factores hiperpolarizantes derivados del endotelio (EDHF)15,16. Por tanto, la miografía por cable lado a lado de arterias de conducto y resistencia extraídas del mismo ratón o ratón permite comparaciones emparejadas que facilitan la detección de cambios funcionales específicos de cada vaso, al tiempo que reducen la variabilidad entre animales.

La interpretación precisa de los datos de miografía por alambre depende de una atención cuidadosa a un conjunto de variables técnicas: composición y oxigenación de la solución fisiológica de sal (PSS), manipulación y disección de tejidos, técnica de montaje, pretensión óptima en reposo (normalización), temperatura del baño y selección de controles farmacológicosadecuados 6. La normalización se refiere al procedimiento técnico de establecer el punto de funcionamiento mecánico del recipiente para optimizar el desarrollo de la fuerza activa y aproximar las condiciones fisiológicasde operación 5. Prácticamente, para los anillos aórticos, es práctica común usar una pretensión fija, a menudo determinada empíricamente para evitar la sobredistensión y proporcionar respuestas estables. Para arterias de resistencia pequeña, la normalización se realiza determinando primero la circunferencia interna correspondiente a una presión transmural equivalente de 100 mmHg (IC100). El recipiente se establece entonces a una fracción definida de este valor para establecer la circunferencia interna normalizada (IC1). En la práctica, muchos protocolos sitúan IC1 cerca de 0,9 × IC100 para ARM de ratas y alrededor de 1,0 × IC100 para ARM de ratón, aunque estos valores pueden ajustarse en función del tipo de vaso, la especie y los objetivosexperimentales 5,17.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

El siguiente protocolo cumple con las directrices establecidas y ha sido aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Campus de Ciencias de la Salud de la Universidad de Toledo.

PRECAUCIÓN Antes de comenzar, por favor siga las directrices del Comité de Cuidado y Uso Institucional de Animales (IACUC) y del Comité de Bioseguridad Institucional (IBC) en todo momento; utilizar el equipo de protección personal (EPP) adecuado; Ejerce cuidado al usar instrumentos quirúrgicos u otros instrumentos afilados; consultar y cumplir con las Hojas de Datos de Seguridad (SDS) relevantes al manipular productos químicos y tejidos biológicos; manejar el carbogénio como un cilindro de gas presurizado usando reguladores aprobados y almacenamiento seguro; y disponer de residuos biológicos y químicos según los procedimientos institucionales.

1. Preparación del tampón de bicarbonato de Krebs modificado (PSS/Krebs)

NOTA: Composición del tampón de Krebs (concentraciones finales, pH 7,4): 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO4, 1,6 mMCaCl 2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glucosa y 0,03 mM EDTA.

  1. Preparar un stock de gran volumen: disuelva todos los componentes exceptoNaHCO 3, glucosa yCaCl 2 en agua doble destilada para obtener un caldo. Guarda este fondo a 4 °C.
  2. El día del experimento, se añade el volumen requerido de stock (por ejemplo, 1 L), se añade secuencialmenteNaHCO 3, glucosa yCaCl 2, y se oxigena continuamente con carbogen (95% O2/5% CO2).
    NOTA: Para minimizar la precipitación de sales de calcio, prepare y almacene un caldo de 1 MCaCl 2 a 4 °C y añada lentamente el volumen requerido al tampón solo después de que NaHCO3 esté completamente disuelto, removiendo continuamente. Mantener la burbuja de carbogénio durante la adición deCaCl 2 (véase el paso 1.3) para reducir la formación de carbonato de calcio. Si se produce precipitación visible, descarta y prepara un nuevo amortiguador.
  3. Para el equilibrio del pH, burbujea el tampón con carbogénio durante al menos 20 minutos, luego mide el pH y ajusta a pH 7,4 si es necesario.
    NOTA: pH típico pre-burbujeo ≈ 7,7; burbujeo continuo reduce el pH a ≈7,4 fisiológico.
  4. Prepara las cámaras de miógrafo llenándolas con tampón Krebs recién preparado y comienza a burbujear suavemente con carbogen. Ajusta la tasa de burbujeo para asegurar un intercambio de gases adecuado sin agitación vigorosa.
  5. Reserva un alicuota de tampón Krebs recién preparado y oxigenado y enfríalo sobre hielo para la disección de tejidos. Calienta el tampón oxigenado restante a 37 °C (con burbujeo continuo de carbogénios) para su uso durante los experimentos.

2. Disección de la aorta torácica descendente y del arco mesentérico

  1. Eutanasia al animal según las directrices de la IACUC. Estandarizar el momento de la eutanasia animal y la extracción de tejidos dentro de una ventana de 2 horas para minimizar los posibles efectos circadianos.
  2. Abre inmediatamente las cavidades torácica y abdominal mediante una incisión mediana y refleja la pared torácica lateralmente para exponer el corazón y los grandes vasos.
    NOTA: No realicéis perfusión sistémica en condiciones estándar, ya que esto podría causar daño endotelial inadvertido. Además, la retención de sangre en los vasos mesentéricos mejora la discriminación visual entre arterias y venas y facilita la evaluación de la integridad arterial. Sin embargo, en algunos modelos patológicos (por ejemplo, trastornos trombóticos), puede ser recomendable una perfusión suave y a baja presión con un amortiguador fisiológico heparinizado y helado para eliminar trombos obstructivos minimizando la lesión endotelial.
  3. Extirpe la aorta torácica descendente. Para facilitar la disección, extirpa los pulmones y el esófago para mejorar la visualización. No agarres directamente la aorta torácica descendente; en su lugar, sujeta suavemente el arco aórtico o la grasa periadvential, levanta ligeramente y corta con cuidado los vasos ramales intercostales por debajo de la aorta. Extirpe la aorta torácica descendente cortándola justo antes de que pase por el diafragma y colócala en una placa de Petri recubierta de Sylgard que contiene un tampón de Krebs oxigenado y helado.
    NOTA: Mantener la temperatura fría para minimizar el tono espontáneo y preservar la viabilidad. El Sylgard negro aumenta el contraste para la disección de vasos.
  4. Elimina toda la sala de juegos mesentérica. Levanta suavemente el arco mesentérico para localizar la arteria mesentérica superior que se ramifica desde la caudal de la aorta abdominal hasta el diafragma. Cortar la arteria mesentérica superior proximalmente y liberar el arco mesentérico del tejido conectivo circundante sin manipulación directa del vaso. Colocar la arcada mesentérica en una placa de Petri separada recubierta de Sylgard que contiene un buffer de Krebs oxigenado y helado.

3. Aislamiento y montaje de anillos aórticos en miógrafos de pines

  1. Clava los extremos proximal y distal de la aorta torácica descendente con pasadores de disección para enderezar el vaso. Evita estirar demasiado para evitar daños mecánicos.
    NOTA: Coloca los pasadores en la grasa periadventicial en lugar de atravesar la pared del vaso para minimizar el daño.
  2. Bajo un estereomicroscopio con fuente de luz externa, retira cuidadosamente la grasa periadventicial y el tejido conectivo usando tijeras Vannas finas y pinzas. Evita dañar la pared de la nave.
    NOTA: Es práctica habitual eliminar la grasa periadventicial a menos que el objetivo sea estudiar el papel de los tejidos perivasculares adventiciales en la regulación del tono vascular.
  3. Corta anillos aórticos de 2 mm, haciendo cortes limpios y perpendiculares. Descarta los anillos que estén perforados o visiblemente dañados. Siempre que sea posible, muestrea ubicaciones comparables entre animales para minimizar la variabilidad.
  4. Desconecte una cámara que contiene el buffer de Krebs oxigenado de la máquina de miografía y transpólvala cuidadosamente al estereomicroscopio.
    NOTA: Mover la cámara puede afectar al transductor y alterar los resultados, así que sujeta la cámara con cuidado y colócala suavemente.
  5. Bajo el estereomicroscopio, utiliza el micrómetro para unir los pines del miógrafo y deslizar el anillo aórtico sobre los pines, minimizando la manipulación de la superficie luminal.
  6. Fíjate en la lectura del micrómetro con el anillo completamente relajado; Aplica un estiramiento leve para asegurar el tejido para el transporte.
  7. Conecta la cámara al instrumento y restaura el recipiente a la lectura original del micrómetro.
  8. Una vez montados todos los anillos, calienta las cámaras a 37 °C y controla la temperatura con la sonda suministrada (normalmente 20-30 minutos para alcanzar los 37 °C).
  9. Pone a cero las lecturas de fuerza en la interfaz de usuario, lanza el software de adquisición de datos y comienza la grabación.
  10. Aplicar pretensión incremental a los anillos aórticos a un valor fijo apropiado para el recipiente usando el micrómetro.
    NOTA: Un valor típico de pretensión para anillos aórticos de ratón es 5 miliNewtons (mN)5. Aunque los valores de pretensión reportados para anillos aórticos de rata varían entre estudios, la optimización previa soporta una pretensión de 10 mN en este protocolo18.
  11. Equilibrar los anillos aórticos durante 45-60 minutos en la pretensión seleccionada, con cambios repetidos de tampón usando Krebs a 37 °C.
    NOTA: Es común que los anillos aórticos pierdan parcialmente la tensión y, por tanto, requieren un ajuste fino de la pretensión varias veces usando el micrómetro antes de que la tensión se estabilice.
  12. Pone a cero las lecturas de fuerza en la interfaz de usuario antes de comenzar los protocolos experimentales.

4. Aislamiento y montaje de MRA en miógrafos de alambre

  1. Fija la arcada mesentérica en un patrón horario para enderezar las ramas mesentéricas. Comienza asegurando el ceco, luego sujeta los tramos sucesivos del intestino delgado en sentido horario para tensar suavemente la vasculatura mesentérica sin sobreestirar. Sustituye el buffer por Krebs frescos según sea necesario para eliminar sangre o residuos.
  2. Identifica la arteria mesentérica superior en el centro del plato donde irradian los arcos.
  3. Seleccionar un ARM adecuado para aislamiento; Objetivos típicos: diámetro interno de 200-250 μm (determinado posteriormente durante la normalización).
    NOTA: En animales adultos de experimento, esto corresponde generalmente a ramas de segundo orden en ratones y3-4 ramas de orden 10 en ratas. El orden de ramas se define por bifurcaciones secuenciales desde la arteria mesentérica superior. Las ramasde orden 1 surgen directamente de la arteria mesentérica superior, las ramas deorden 2 surgen de ramas de orden 1, y así sucesivamente.
  4. Bajo un estereomicroscopio, disecciona la vena acompañante y elimina la grasa periadventicia y el tejido conectivo usando tijeras Vannas y pinzas finas.
    NOTA: Los ARM pueden distinguirse de las venas por sus paredes más gruesas y lúmenes más pequeños, que se visualizan fácilmente por la presencia de sangre intraluminal residual.
  5. Relaja los pasadores intestinales cercanos que estiran la pared intestinal adyacente al vaso seleccionado antes de extirpar la arteria para evitar el retroceso del vaso.
  6. Elimina toda la longitud del ARM seleccionado (debe medir >2 mm), realizando cortes limpios y perpendiculares. Con pinzas finas, agarra un extremo de la arteria y transfiere a una placa de Petri limpia que contiene un tampón Krebs helado (platos normales, sin recubrimiento de Sylgard, facilitan el montaje posterior). Inspeccionar la arteria en busca de daños; La presencia de sangre intraluminal facilita la evaluación visual de la integridad.
  7. Extrae un segmento de aproximadamente 2 mm de una región intacta. Desecha cualquier zona que haya sido manipulada durante el transporte o que muestre daños visibles.
    NOTA: El uso de platos transparentes y no recubiertos de Sylgard permite colocar una regla debajo del plato para medir con precisión la longitud del recipiente.
  8. Prepara dos largos de 2,5 cm de alambre de acero inoxidable de 40 μm para su montaje.
  9. Usando pinzas finas, pasa cuidadosamente los cables, uno a uno, a través del lumen para que haya suficiente cable sobresaliendo de ambos extremos para montarlos. Minimiza el trauma endotelial. Después de insertar ambos cables, registrar la longitud exacta con una regla para usarla en el procedimiento de normalización (véase el paso 5.2).
    NOTA: Este es uno de los pasos más técnicamente exigentes y que requieren más tiempo del protocolo, y requiere paciencia y práctica repetida para minimizar el daño endotelial. Después de insertar el primer alambre, a menudo es más fácil sujetar ambos cables juntos y adelantarlos a través del recipiente.
  10. Desconecte una cámara que contiene el buffer de Krebs oxigenado de la máquina de miografía y transpólvala cuidadosamente al estereomicroscopio.
  11. Bajo el estereomicroscopio, transfiere el ARM (cables de sujeción en ambos extremos) a la cámara de miografía. Con el micrómetro, junta las mordazas del miógrafo para sujetar los extremos del alambre entre ellas, de modo que la arteria quede suspendida libremente entre ellas.
    NOTA: En esta fase, es recomendable sujetar los cables de modo que queden unos sobre otros. Esto asegura los cables en su lugar y evita que se retuerzan.
  12. Asegura el cable superior bajo los tornillos de montaje en el lado del micrómetro cercano envolviendo los extremos en sentido horario; Repite para el segundo cable en el lado del transductor.
    NOTA: Aprieta los tornillos suavemente pero con firmeza. Si las tornillas están demasiado flojas, el recipiente puede resbalar; Si se aprieta en exceso, el cable o el transductor pueden dañarse. Después de sujetar el primer extremo, abre ligeramente el espacio entre las mordazas del miógrafo antes de asegurar el extremo opuesto para asegurar una tensión uniforme del alambre.
  13. Mueve ligeramente las mordazas y alinea los cables para que queden paralelos y coplanares, casi tocándose.
    NOTA: Realice todos los ajustes de los cables alejados del recipiente montado para minimizar los daños.
  14. Repite el montaje para todos los MRA.
  15. Cámaras de calor a 37 °C y monitorizar la temperatura (20-30 minutos típicos).
  16. Cero las lecturas de fuerza en la interfaz de usuario antes de iniciar el procedimiento de normalización.

5. Procedimiento de normalización para el ARM

NOTA: Los anillos aórticos se montan con una pretensión fija y predefinida. Por lo tanto, no se realiza un paso de normalización separado.

  1. Establecer parámetros de normalización en el software de adquisición de datos: calibración ocular = 1; presión objetivo = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); circunferencia interna normalizada (IC1) = 0,9 para ARM de rata y 1,0 para MRAs de ratón; tiempo promedio = 2 s; retraso = 60 s.
  2. Introduce los parámetros específicos del recipiente en el módulo de normalización de la siguiente manera:
    1. Para extremos tisulares (mm): fija a1 = 0 y a2 = la longitud medida de la ARM en milímetros (la longitud exacta registrada durante la excisión).
    2. Diámetro del cable de entrada: 40 μm.
    3. Lectura del micrómetro: introduce el valor base del micrómetro registrado con el recipiente montado y completamente relajado.
  3. Inicia el procedimiento de normalización estirando escalonadas la ARM montada en incrementos de 50 μm. Después de cada estiramiento, introduce la nueva lectura del micrómetro en el módulo de normalización y espera 60 s entre los incrementos.
    NOTA: Las caídas bruscas de tensión tras un ajuste del micrómetro suelen indicar deslizamiento del recipiente. Los tornillos de montaje deben apretarse suavemente pero con firmeza.
  4. Espera a que el módulo de normalización represente la tensión de la pared en reposo (mN/mm) frente a la circunferencia interna (μm) y ajusta una curva exponencial. Usando el micrómetro, continúa estirando escalonadas hasta que la curva de tensión-circunferencia intersecte el isóbaro de 100 mmHg. Cuando se estén cerca de la intersección, reducir el tamaño del paso a 10-30 μm para evitar que el recipiente se estire en exceso.
  5. Cuando la curva intersecta el isóbaro de 100 mmHg, observa la circunferencia interna calculada por software y ajusta el micrómetro al valor correspondiente calculado por el módulo para que la preparación descanse en la circunferencia interna normalizada objetivo (IC₁).
    NOTA: Un mal ajuste de curvas suele indicar parámetros incorrectos introducidos en el software, como la longitud del tejido, el diámetro del alambre o las lecturas del micrómetro.
  6. Repite el procedimiento de normalización para todos los ARM montados y luego permite que los recipientes se equilibren durante 30-45 minutos con cambios repetidos de tampón usando Krebs de 37 °C.
  7. Pone a cero las lecturas de fuerza en la interfaz de usuario inmediatamente antes de comenzar los experimentos.
    NOTA: Las diferencias clave de parámetros entre ratones y ratas se resumen en la Tabla 1.
ParámetroMouseRata
Valor de pretensión para anillos aórticos5 mN10 mN
Relación IC1 del objetivo para ARM10.9
Orden típico de rama MRA para un diámetro interno de 200-250 μm2º3tiro - 4décimo

Tabla 1: Diferencias clave de parámetros entre ratones y ratas.

6. Protocolo experimental (secuencia de ejemplo)

  1. Comprobación de viabilidad: Provocar una respuesta contráctil con un desafío despolarizante de alto K⁺ (por ejemplo, 120 mM KCl).
    NOTA: El tampón de alto K⁺ (KPSS) se prepara por sustitución equimolar de NaCl por KCl del tampón estándar de Krebs para mantener la osmolaridad y se oxigena continuamente con 95% de O2/5% de CO2. Para evitar el shock por frío, calienta el KPSS a 37 °C antes de usarlo. Composición del tampón KPSS (concentraciones finales, pH 7,4): 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mMMgSO 4, 1,18 mMKH 2PO₄, 1,6 mMCaCl 2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glucosa y 0,03 mM EDTA.
  2. Realizar al menos tres lavados consecutivos con un nuevo tampón Krebs oxigenado a 37 °C hasta que se restablezca una tensión basal pasiva estable.
    NOTA: Todos los pasos de lavado se realizan retirando completamente la solución de baño y sustituyéndola por un nuevo tampón Krebs oxigenado a 37 °C. Las miografías comerciales suelen tener una función de lavado incorporada que drena las cámaras de miografía.
  3. Genera una curva concentración-respuesta (CRC) acumulada a fenilefrina (PE), añadiendo concentraciones crecientes (por ejemplo, rango 10⁻9 a 10⁻4 M). Permite que cada concentración se estanque antes de añadir la siguiente hasta alcanzar un estancamiento máximo estable.
  4. Realizar al menos tres lavados consecutivos con un nuevo tampón Krebs oxigenado a 37 °C hasta que se restablezca una tensión basal pasiva estable.
  5. Evaluar la función endotelial: Preconstriñar con una concentración submáxima de PE, permitir que la respuesta se estabilice y luego evaluar la relajación dependiente del endotelio con ACh (rango de ejemplo 10⁻⁹ a 10⁻⁵ M). Permite que cada concentración se estanque antes de añadir la siguiente concentración hasta alcanzar una relajación máxima estable. Registrar la relajación porcentual relativa al tono preconstreñido (véase el paso 7.4). Se excluyen las preparaciones que muestren un <70% de relajación.
    NOTA: Las enfermedades de la pared vascular, como la hipertensión, se asocian comúnmente con disfunción endotelial, que a menudo conduce a una respuesta de vasorelajación dependiente del endotelio aACh 19. En estas condiciones, no se deben excluir automáticamente preparaciones que muestren un relajamiento del < 70 %, ya que esto podría representar una verdadera disfunción endotelial relacionada con la enfermedad más que un fallo técnico.
  6. Realizar al menos tres lavados consecutivos con un nuevo tampón Krebs oxigenado a 37 °C hasta que se restablezca una tensión basal pasiva estable.
  7. Prueba otros agentes vasoactivos, con y sin inhibidores específicos de la vía, según lo requiera la pregunta experimental.
  8. Al final del experimento, retira todos los recipientes montados, limpia todas las cámaras con ácido acético al 8%, seguido de tres lavados de agua y finalmente apaga el depósito de gas y la máquina.
  9. Eliminar los residuos biológicos y químicos según los procedimientos institucionales.

7. Análisis y reporte de datos

  1. Definición y registro base. Registra la tensión basal inmediatamente antes del inicio de cualquier desafío vasoconstrictor (es decir, desafío de alto K⁺, CRC vasoconstrictor o preconstricción antes de un CRC vasodilatador).
    NOTA: Para análisis posteriores, es prácticamente más fácil poner a cero las lecturas de fuerza en la interfaz de usuario tras un lavado adecuado de cualquier estimulación previa, inmediatamente antes del inicio de cualquier desafío vasoconstrictor (es decir, tensión base mostrada = 0).
  2. Desafío High-K⁺. Calcular la fuerza activa como: Fuerza activa = Tono máximo después de KCl - Tensión base (unidades: mN). Expresa la fuerza activa normalizada a la longitud unitaria (mN/mm) o al área de sección transversal (mN/mm 2) del segmento arterial montado. La medición del área de la sección transversal requiere un análisis histológico posterior de los segmentos de la arteria montada para determinar el grosor de la pared.
    NOTA: Dado que los anillos aórticos suelen producir una respuesta no estancada, mide la respuesta máxima de alto K⁺ dentro de un tiempo predeterminado (por ejemplo, 10 minutos) en todas las preparaciones, para minimizar la variabilidad. En los ARM, la respuesta máxima de alta K⁺ suele alcanzarse en segundos tras la estimulación.
  3. CRCs contráctiles. Para cada concentración en un CRC acumulado contráctil (por ejemplo, PE), se calcula la fuerza activa de la siguiente manera. Expresa la fuerza activa en cada concentración como un porcentaje de la respuesta provocada por el desafío de alto K⁺. Utilice estos valores porcentuales para ajustar CRCs contráctiles (véase el paso 7.5).
    Fuerza activa = Tono máximo tras la aplicación del fármaco - Tensión base (unidades: mN)
    NOTA: Ciertas condiciones pueden causar variabilidad en las respuestas máximas de alto K⁺ entre preparaciones (por ejemplo, cambios en la masa muscular lisa o en el estado de diferenciación derivados de la patología). En estas circunstancias, expresa la fuerza activa en cada concentración normalizada a la longitud unitaria (mN/mm) o al área de sección transversal (mN/mm 2) del segmento arterial montado.
  4. CRCs relajantes. Para CRCs de relajación tras una preconstricción submáxima (tono de preconstricción), calcular el porcentaje de relajación en cada concentración de la siguiente manera. Utilice estos valores porcentuales para ajustar CRCs de relajación (véase el paso 7.5).
    Relajación = (Tono de preconstricción - Tono tras la aplicación del fármaco) / (Tono de preconstricción - Tensión base) × 100.
  5. Ajuste de curvas. Para CRCs acumulativas contráctiles o relajantes, grafica el logaritmo [concentración del agonista] en el eje x frente a la respuesta normalizada en el eje y. Ajusta la curva trazada con un modelo logístico de cuatro parámetros usando regresión no lineal. Extrae Emax (efecto máximo) y pEC50 (−logEC50) para comparaciones estadísticas, donde EC50 es la concentración del agonista que produce el 50% de Emax.
  6. Presentación de datos: Presenta los CRC normalizados. Para cada uno de los puntos de datos de la curva, utiliza la media del grupo ± error estándar de la media (SEM) o desviación estándar (SD). Incluye trazas originales representativas y proporciona una tabla de parámetros que resuma los valores de Emax y pEC50 (media ± SEM o SD).
  7. Análisis estadístico:
    1. Comparar las CRC entre grupos experimentales utilizando análisis de varianza con medidas repetidas bidireccionales (ANOVA) con una prueba post-hoc adecuada (por ejemplo, Bonferroni). Sin embargo, comprueba las suposiciones (esfericidad, normalidad) y utiliza enfoques alternativos (por ejemplo, modelos de efectos mixtos) cuando faltan datos o están desequilibrados.
    2. Compare pEC50 y Emax entre dos grupos experimentales utilizando una prueba t no emparejada, o ANOVA unidireccional si se comparan más de dos grupos experimentales. Alternativamente, se utilizan pruebas no paramétricas cuando se violan las suposiciones de homogeneidad y normalidad de varianza. Fija la significación estadística en p < 0,05.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

En la Figura 1 se muestra un esquema que representa el flujo de trabajo general de la miografía por alambre en arterias de conductos y resistencia aisladas de ratones o ratones. Imágenes representativas del aislamiento y montaje de un anillo aórtico torácico de ratón y una ARM de segundo orden se muestran en la Figura 2 y la Figura 3, respectivamente. Capturas de pantalla de software que ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La miografía por alambre sigue siendo un enfoque potente y de alta resolución para interrogar la función vascular ex vivo. Cuando se ejecuta cuidadosamente, este método proporciona criterios cuantitativos fiables que abordan cuestiones biológicas distintas, permitiendo al mismo tiempo una comparación rigurosa de lechos macro y microvasculares dentro del mismo animal. Los estudios de arterias conducto revelan cambios en la mecánica arterial global y la reactividad de grandes vaso...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

El trabajo contó con el apoyo de una beca del NHLBI (R00 HL153896 a I.O.) y fondos de inicio de la Universidad de Toledo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos centrífugos cónicos de 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Tubos centrífugos cónicos de 50 mLThermo Fisher Scientific14-959-49A
Ácido acéticoThermo Fisher ScientificA490-212
AcetilcolinaMillipore SigmaA6625-100G
Balance analíticoMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Carbogénio (95% O2/5% CO2)AirgasCD USP50
Microscopio de disección  ZEISSZEISS Stemi 305
Disección de placa de PetriInstrumentación de Sistemas VivosDD-90-S-BLK
Clavijas de disecciónTecnología Myo danesa400626
Kit de herramientas para disecciónTecnología Myo danesa101017El kit consta de tijeras de disección (1), tijeras multiusos (1), placas de Petri (5), pinzas (3) y pines de disección.
Dumont #5 - Pinzas finasHerramientas Científicas Fines11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Congelador (-20 ºC; C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Cajas con bisagras para congeladorUSA Scientific2310-5848
Guantes (Grande)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Guantes (Mediano)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Guantes (pequeños)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlucosaThermo Fisher ScientificD16-500
Cilindro graduadoThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrismGraphPad SoftwareN/AAnálisis de datos y presentación gráfica
Solución de ácido clorhídricoThermo Fisher ScientificSA48-1
Cubo de HieloThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
LabChart 8 SoftwareAD InstrumentsN/ASoftware de captura de datos
Frigorífico de laboratorioThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
Fuente de luz LEDThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Agitador magnéticoThermo Fisher ScientificFB30786159
Barras magnéticas de agitación (grandes)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Barras magnéticas de agitación (Medio)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Set de muestreo de microcucharas y espátulasThermo Fisher ScientificS43322
Tubos microcentrífugasUSA Scientific1615-5510
Mini microcentrífugaThermo Fisher Scientific07-203-954
Destornillador miniaturaThermo Fisher ScientificNC1349489
Sistema de miógrafo multicableTecnología Myo danesaDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
Medidor de pHThermo Fisher Scientific01-912-351Incluye medidor de pH, sensor LE420, QuickGuide de instalación y pack inicial de tampón de pH
Fenilefrina Millipore SigmaP6126-5G
Controlador de pipetasThermo Fisher Scientific01-001-023
Puntas de pipeta en estantes (10 y micro; L)USA Scientific1111-3810
Puntas de pipeta en estantes (1000 y micro; L)USA Scientific1111-2830
Puntas de pipeta en racks (200 y micro; L)USA Scientific1111-1810
Botellas reutilizables para almacenamiento de medios PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1D
Pipetas Serológicas (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Pipetas Serológicas (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Micropipeta de un solo canal Multi-PackThermo Fisher Scientific13-684-2503 pipetas (0,5-10 y mu; L, 10-100 y mu; L, 100-1000 y mu; L)
Alambre de acero inoxidable (40 & mu; m)Tecnología Myo danesa400447
TemporizadorThermo Fisher Scientific02-261-840
Sistema de Agua Ultra PuraSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Tijeras de primavera VannasHerramientas Científicas Fines15000-00
Matraz volumétricoThermo Fisher Scientific13-756-400
Mezclador de vórticesThermo Fisher Scientific10-320-807
Baños MaríaThermo Fisher Scientific07-202-155
Pesaje de platosThermo Fisher Scientific02-202-101

Referencias

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Reactividad vasculararterias mesentéricasmiografía isométricadisección arterialfunción vascularfunción endotelialfunción del músculo liso

Este artículo ha sido publicado

Video próximamente

Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.