Artículo de método

Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

DOI:

10.3791/70192

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27 de marzo de 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

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Este protocolo estandariza la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para tejidos gruesos integrando la congelación a alta presión (HPF) con el método waffle, el levantamiento por haz de iones de foco criogénico (crio-FIB) y la adquisición paralela simétrica en dosis, produciendo láminas uniformemente finas y muestras vitrificadas para análisis in situ reproducibles en el hipocampo del ratón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La criotomografía electrónica (crio-ET) permite la visualización 3D de la ultraestructura celular nativa, pero su aplicación a tejidos gruesos está limitada por la falta de vitrificación fiable y preparación de láminas de bajo rendimiento. Aquí se presenta un flujo de trabajo de extremo a extremo que integra congelación a alta presión (HPF; ~2100 bar; tiempo de disección a congelación ≤90 s) usando un conjunto "waffle" con lámina de cobre sobre tejido prefino, crio-FIB lift-out y adelgazamiento controlado a láminas de 120–200 nm con compensación por sobreinclinación. El recubrimiento conductor está estandarizado (sputter-Pt 30 mA/15 s; Tapa SIG 0,5–1,0 μm) para minimizar el desgaste de cortinas. Adquisición automatizada y simétrica por dosis (0°, ±3°, ±6°... a ±60–66°; tamaño de paso de 2–3°; dosis total 100–150 e⁻/Å2) se implementa mediante scripts PACEtomo, con el ángulo inicial de inclinación derivado del ángulo de fresado y la orientación de la muestra. El procesamiento con AreTomo 3 proporciona funciones para la corrección de movimiento, estimación de CTF, alineación y reconstrucción de WBP en casi tiempo real; IsoNet puede opcionalmente reducir la anisotropía de cuña faltante. El promedio por subtomogramas (RELION 4.0) sigue una estrategia de pseudo-subtomogramas con informes de resolución basados en un corte FSC de 0,143. Demostró en hipocampo de ratón, el flujo de trabajo produce rutinariamente muestras bien vitrificadas y láminas uniformes (espesor objetivo 150 ± 40 nm) y logra una recogida en serie de inclinación de alto rendimiento (típicamente en series de 5–8 min/tilt). Este protocolo ofrece una vía reproducible para estudiar la biología estructural in situ directamente desde entornos tisulares complejos.

Introducción

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La criotomografía electrónica (crio-ET) ha surgido como una técnica clave para visualizar complejos macromoleculares y arquitecturas celulares en su estado nativo e hidratado 1,2,3,4,5. Al reconstruir volúmenes tridimensionales a partir de series de proyección inclinadas, el crio-ET cierra la brecha entre el contexto celular y la resolución casi atómica, ofreciendo conocimientos sin precedentes sobre biología estructural in situ6. Aunque los flujos de trabajo de tomografía crioelectrónica para muestrascelulares 7 (incluyendo células diluidas por crio-FIB en suspensiones y células adherentes) están ya bien establecidos, su extensión directa a tejidos gruesos y arquitectónicamente intactos sigue siendo altamentedesafiante 8,9,10. Esto es especialmente cierto para tejidos con alto contenido de agua como el cerebro11, donde la vitrificación fiable y la preparación de láminas transparentes al electrón (típicamente <200 nm) siguen generando cuellos de botellapersistentes 12.

Conseguir la vitrificación en los tejidos es un reto debido a su alto contenido de agua y a la transferencia de calor limitada. Aunque la congelación por inmersión es eficaz para muestras delgadas (≤20 μm)13, falla en la mayoría de los tejidos. La congelación a alta presión (HPF) suprime la nucleación del hielo aplicando alta presión, permitiendo la vitrificación de muestras hasta ~200 μm en teoría. Sin embargo, la eficiencia de la HPF convencional suele ser subóptima para vitrificar tejidos. Para mejorar los resultados, los esfuerzos recientes han empleado estrategias como añadir crioprotectores14 y realizar la pre-sección 15,16 (por ejemplo, usar un vibratomo) para reducir mecánicamente el grosor de la muestra antes decongelar 11,17. Aunque estos enfoques pueden mejorar la calidad de la vitrificación, a menudo implican una manipulación prolongada ex vivo y el uso de aditivos químicos que corren el riesgo de alterar las estructuras nativas. Para abordar estas limitaciones, este estudio modificó la estrategia de portadores "waffle" desarrollada originalmente por Kelley et al.18 incorporando una optimización crítica: el tejido cerebral se comprime físicamente usando dos portadores de cobre pulido antes de congelarse, lo que adelgaza la muestra mientras la asegura simultáneamente entre una rejilla filmada y una lámina de cobre. Este diseño no solo promueve una vitrificación rápida y uniforme, sino que también mejora significativamente la estabilidad mecánica, evitando así eficazmente la rotura de la rejilla y la pérdida de muestras durante el manejo posterior, estableciendo una base sólida para obtener muestras de tejido congelado intactas y de alta calidad.

Tras la vitrificación, el diluvio sigue siendo una barrera importante tanto para el rendimiento como para la calidad. Como técnica temprana y ampliamente adoptada, la crio-ultramicrotomía permite numerosos estudios estructurales fundamentales in situ. No obstante, frecuentemente introduce artefactos de compresión y corte19,20 que comprometen la integridad estructural. En contraste, el fresado de haz iónico crio-focalado (crio-FIB) 21 ofrece una precisión superior y una distorsiónmínima 7,22. Inicialmente, el fresado criofibrino se aplicó directamente a muestras vitrificadas en rejillas para producirláminas 23; sin embargo, este enfoque in situ es principalmente eficaz para muestras delgadas24,25 (por ejemplo, células cultivadas o regiones de tejido periférico) y no pueden acceder a estructuras más profundas dentro de tejidos gruesos y voluminosos. Para superar esta limitación de profundidad, se desarrollaronestrategias de elevación 26, que permitieron la extracción específica de las regiones de interés (ROI) del interior de las muestras. Avances metodológicos posteriores, incluyendo el levantamiento serial27 y la sección serializada en la cuadrícula (SOLIST)28, mejoraron aún más el rendimiento, la estabilidad lamelar y la precisión de la orientación correlativa 3D en tejidos complejos. Más recientemente, las innovaciones han continuado avanzando en el campo, incluyendo el método de fijación de seis lados de Tang et al.29, que mejora la estabilización mecánica durante el levantamiento y el adelgazamiento, así como los novedosos enfoques de fresado en rejilla de Benjamin C. Creekmore et al.11 que permiten el acceso a estructuras profundas preservando el contexto del tejido nativo. A pesar de estos avances, los protocolos siguen variando en eficiencia, reproducibilidad y adaptabilidad según los distintos tipos de tejido. Persiste una brecha crítica en el establecimiento de un flujo de trabajo estandarizado, fácilmente replicable y ampliamente aplicable que integre estas optimizaciones en una línea coherente para diversos tejidos gruesos.

Esta carencia se aborda aquí sintetizando detalles técnicos clave de metodologías establecidas y perfeccionándolos en una cadena de operaciones generalizada de extremo a extremo. Este protocolo no solo emplea el método mejorado HPF-waffle para una vitrificación robusta, sino que también incorpora una serie de pasos optimizados en el levantamiento y adelgazamiento de crio-FIB, como la compensación sistemática por sobreinclinación, el recubrimiento conductor estandarizado y secuencias de fresado calibradas, que en conjunto mejoran la uniformidad de las láminas, reducen artefactos (por ejemplo, el cortinado) y mejoran el rendimiento. A diferencia de protocolos adaptados a tipos celulares específicos u organismos modelo, este flujo de trabajo está diseñado con generalizabilidad en su núcleo, proporcionando un marco versátil adaptable a una amplia gama de tejidos gruesos y complejos, incluidos aquellos relativamente blandos y propensos a la compresión, más allá del hipocampo de ratón demostrado.

Demostró en el exigente modelo del hipocampo del ratón, notable por su susceptibilidad a daños por hielo y complejidad estructural, este flujo de trabajo integrado y generalizado produce de forma fiable láminas de alta calidad (120–200 nm) y permite la adquisición eficiente en serie inclinada (5–8 min/serie). Esta consolidación de las mejores prácticas en un protocolo coherente, accesible y ampliamente aplicable proporciona un marco reproducible que reduce la barrera técnica para implementar crio-ET en la investigación de tejido grueso en diversos contextos biológicos y biomédicos.

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Protocolo

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Todos los procedimientos que involucran tejido animal cumplieron con SUSTech IACUC (Protocolo SUSTech-JY202501019). Los regentes y el equipo utilizado están listados en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de soporte de muestras

  1. Preparación del portador de HPF (véase Figura 1A)
    1. Obtener un par de portadores HPF de cobre de 6 mm (tipo B). Asegúrate de que uno de los transportistas tenga una superficie plana.
    2. Moja la superficie plana del portabebés y procede a moler. Primero, usa papel de lija de grano 8000 hasta que se eliminen por completo las marcas originales de mecanizado. Luego, cambia a papel de lija de grano 12000 y continúa esmerilando hasta que los arañazos del paso anterior desaparezcan en gran medida, logrando un acabado uniformemente suave. La Figura 2 muestra imágenes típicas de la superficie del portador durante el proceso de rectificado y pulido.
    3. Pulir la superficie molida usando un paño metalográfico suave y pasta de diamante W0.5: primero, aplicar la pasta sobre el paño y luego pulir la superficie en un movimiento circular durante 1–2 minutos hasta lograr un acabado liso y muy pulido. Enjuaga bien el portador con etanol, seguido de agua destilada para eliminar todos los residuos abrasivos.
    4. Sumergir los portadores pulidos en 1-hexadeceno durante un mínimo de 4 horas (o durante la noche) antes de su uso.
      NOTA: Los portadores pulidos y tratados pueden almacenarse sumergidos en 1-hexadeceno.
      PRECAUCIÓN: El 1-hexadeceno es inflamable y perjudicial si se inhala; Trabaja en una campana extractora con EPI.
  2. Preparación de la malla de soporte TEM (véase la Figura 1B)
    1. Utiliza rejillas de cobre de 100 mallas con una película continua de soporte Formvar/carbono.
    2. Cubre ambos lados de las rejillas con oro usando un recubridor: ajusta la corriente a 50 mA y recubre cada lado durante 120 s para lograr una capa de aproximadamente 6 nm por lado.
  3. Preparación de lámina de cobre (véase Figura 1C)
    1. Obtén lámina de cobre de alta pureza con un grosor de 1 μm.
      NOTA: La conductividad térmica del cobre varía con la pureza, y una menor pureza resulta en menor conductividad térmica. Por lo tanto, se requiere lámina de cobre de alta pureza (Cu ≥ 99,9%).
    2. Perfora la lámina de cobre en discos de 3 mm de diámetro usando una perforadora circular.

2. Congelación a alta presión

  1. Coloca una gota de 10 μL de solución de sacarosa al 10% sobre una superficie de vidrio limpia.
  2. Disecciona rápidamente el hipocampo de un ratón recién eutanasiado. Extrae pequeños trozos de tejido de aproximadamente 0,5–1mm 3 usando una cuchilla afilada (véase la Figura 1D).
  3. Transfiere el tejido a las rejillas TEM de soporte de cobre (malla 100) dentro del portador HPF usando un palillo o cepillo fino. Utiliza 2-metilbutano (isopentano) para maniobrar suavemente el tejido en su sitio, minimizando el esfuerzo mecánico en la rejilla.
    PRECAUCIÓN: El 2-metilbutano (isopentano) es extremadamente inflamable. Maneja la cámara con una campana extractora sin fuentes de ignición.
  4. Cubre el tejido y la rejilla con un disco de papel de cobre de 3 mm de diámetro. Completar el conjunto colocando el segundo portador HPF (plano boca abajo) encima para formar el sándwich sellado de "gofre" (véase la Figura 1E).
    NOTA: La lámina de cobre cumple una función mecánica crítica en el conjunto de waffles. Coloca el tejido entre la rejilla TEM y el propio papel de aluminio. Durante el montaje, esta configuración aplica una presión suave, ayudando a formar una franja de tejido más fina y uniforme, ideal para la vitrificación. Además, el papel previene la pérdida de tejido durante la manipulación y ayuda a distribuir la presión durante la congelación a alta presión, reduciendo el riesgo de rotura de la rejilla. Tras la congelación, el papel de aluminio también facilita la separación de los portadores de la rejilla de muestra vitrificada. Sin embargo, este método de preparación puede introducir daños por compresión mecánica y puede no ser adecuado para muestras sensibles a artefactos inducidos por presión. Para estas muestras, deben considerarse técnicas alternativas de corte que logren un grosor adecuado sin compresión, como la sección de vibratomos o el punzonado de muestras.
  5. Iniciar inmediatamente el procedimiento de congelación a alta presión conforme al protocolo operativo del fabricante. Fija la presión objetivo en ~2100 bar y asegúrate de que el tiempo total desde la disección del tejido hasta la congelación no supere los 90 s.
    NOTA: Todo el procedimiento, desde la disección hasta la congelación, debe completarse en un plazo de 90 segundos para minimizar las alteraciones estructurales asociadas con el tiempo prolongado ex vivo . El rango de grosor tisular para cerebros es de aproximadamente 20–40 μm.

3. Fresado y levantamiento de FIB

NOTA: Realiza los siguientes pasos utilizando un microscopio de doble haz equipado con una etapa criogénica. Mantén la temperatura de la muestra por debajo de -170 °C en todo momento.

  1. Preparación de la rejilla receptora
    1. Obtener una nueva rejilla dorada de 300 mallas para servir como rejilla receptora final para el procedimiento de levantamiento.
    2. Bajo un estereomicroscopio a temperatura ambiente, encaje suavemente la rejilla en un anillo AutoGrid de criofibrilación compatible con fibrilación artificial.
    3. Guarda el AutoGrid ensamblado directamente en un horno seco mantenido a aproximadamente 40 °C para minimizar la acumulación de escarcha antes de su uso.
      NOTA: Durante el recorte, asegúrate de que la rejilla quede plana y centrada para evitar curvas o desalineaciones.
  2. Extracción y montaje de la rejilla de tejido vitrificado
    1. Mientras sumerges continuamente el conjunto en nitrógeno líquido (LN₂), separa cuidadosamente la rejilla vitrificada de TEM (que contiene el tejido y la lámina de cobre) de los componentes circundantes del conjunto "waffle".
      NOTA: El separador de lámina de cobre normalmente facilita la separación de la rejilla de los portadores.
    2. En una estación de trabajo de carga criogenial preenfriada, montar la rejilla de tejido aislado en un segundo anillo AutoGrid crio-FIB bajo protección LN₂.
  3. Rejillas de co-carga en el transbordador de transferencia criogénica
    1. Carga ambas AutoGrids en las ranuras designadas de la lanzadera de transferencia criogénica.
    2. Orienta cada AutoGrid de modo que la muesca de fresado esté orientada hacia fuera y sea vertical.
    3. Mantén el transbordador cargado bajo inmersión LN₂ o preenfriado hasta que se transfiera al microscopio FIB/SEM.
  4. Localización y recubrimiento conductor en la FIB/SEM
    1. Tras la criotransferencia al microscopio, se desplaza hasta la rejilla de tejido con bajo aumento SEM.
    2. Aplica un recubrimiento conductor y protector en toda la superficie de la rejilla.
      1. Recubre la superficie de la rejilla con platino (Pt) a 30 mA durante 15 s.
      2. Deposita una cápsula organometálica de Pt de 0,5–1,0 μm de grosor utilizando el Sistema de Inyección de Gas (SIG).
      3. Aplica una capa final de Pt recubierta con sputter sobre la superficie de la rejilla a 30 mA durante 15 s.
        NOTA: El gorro GIS es fundamental para reducir los artefactos de cortina.
  5. Aislamiento y levantamiento de bloques tisulares (véase Figura 3)
    1. Selección y orientación del emplazamiento
      1. Navega hasta la región de interés (ROI) seleccionada en la rejilla de tejido usando la imagen del haz de electrones SEM.
      2. Orienta la muestra para fresado frontal. La posición típica de la etapa se ajusta a 110° de rotación y 7° de inclinación, y esta posición presenta la superficie de la muestra en un ángulo adecuado para el acceso al haz de iones.
        NOTA: En ausencia de marcadores fluorescentes, se puede emplear una estrategia de precribado. Esta estrategia tiene como objetivo localizar la región del tejido objetivo y excluir áreas que contengan crioprotectores u otros componentes no tissulares. Después de seleccionar una región aparentemente libre de hielo superficial, moler una pequeña zanja de prueba usando una corriente de haz mayor (por ejemplo, 15 nA a 30 kV) en la orientación frontal estándar y pulir usando una corriente de haz menor (por ejemplo, 1 nA a 30 kV). Cambiar al haz de electrones para examinar la sección transversal: el tejido presenta un excelente contraste bajo el haz de electrones, una característica especialmente pronunciada en estructuras membranosas y regiones ricas en elementos pesados; en cambio, el crioprotector suele mostrar un contraste uniforme bajo el haz de electrones. Esto permite una verificación rápida antes de proceder con el procedimiento completo de retirada.
    2. Fresado de zanja para aislar el bloque (Figura 3A)
      1. Defina una zanja rectangular que rodea el bloque de tejido objetivo usando el haz iónico operado a 30 kV.
      2. Comienza a fresar a cierta distancia del bloque usando una corriente relativamente alta de 15 nA para lograr una rápida eliminación del material.
      3. A medida que las paredes de la zanja se acercan al bloque a unos pocos micrómetros, reduce la corriente del haz iónico a 7 nA. Reducir la corriente permite un control más preciso y minimiza el daño por haz de iones y el calentamiento del material biológico en la región de interés.
      4. Deja un lado del bloque unido al material grueso como una "pestaña" para sujetarlo temporalmente.
    3. Fresado opcional por undercut para bloques gruesos (Figura 3B)
      1. Para bloques de tejido con un espesor estimado superior a 20 μm, realiza un paso de fresado por debajo del lado contrario para facilitar el levantamiento final.
      2. Gira la etapa (por ejemplo, a -70°) y ajusta la inclinación de la etapa (por ejemplo, a 23°) para acceder a la parte inferior del bloque.
      3. Fresa la conexión inferior usando la FIB a 30 kV y una corriente de 3 nA.
    4. Acoplamiento a la aguja del micromanipulador (Figura 3C)
      1. Para unir la muestra a la aguja, realiza patrones de fresado secuenciales de sección transversal.
        NOTA: El bloque de oro puede extraerse de la barra de una cuadrícula de oro de 300 mallas.
    5. Levantamiento del bloque de tejido (Figura 3D)
      1. Cortar la "pestaña" restante que conecta el bloque con la muestra a granel usando la FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Maniobra con cuidado la aguja del micromanipulador para levantar el bloque de tejido ahora aislado, de modo que quede completamente libre de la zanja y de la rejilla original circundante. Luego, retrae la aguja y transporta el bloque a la rejilla del receptor.
    6. Transferencia de bloques, soldadura y re-recubrimiento
      1. Navega la aguja hasta una rejilla de receptores dorados de 300 mallas preenfriada.
      2. Baja el bloque sobre una casilla de cuadrícula elegida. Coloca el bloque de tejido en contacto con la película en la rejilla y luego levanta el bloque verticalmente para romper el contacto. Moler una rebanada de ~3–4 μm de grosor desde el bloque sobre la película de rejilla usando el haz iónico (30 kV, 1 nA) (Figura 3E).
        NOTA: Si hay restos de hielo, prelimpia el sitio de fijación con un patrón rectangular (30 kV, 50 pA). Asegúrate de que el bloque entre en contacto con la película de la rejilla para reducir la carga electrostática, que puede desplazar aleatoriamente el corte.
      3. Suelda la rebanada de forma segura fresando usando patrones de sección transversal limpia a ambos lados de la unión (30 kV, 30 pA) (Figura 3F).
      4. Reaplicar el recubrimiento conductor/protector tal y como se describe en el Paso 3.4.2 (Figura 3G).
        NOTA: Para este paso de chapado GIS, la duración puede reducirse dependiendo del tamaño del bloque.
    7. Adelgazamiento de lamelas
      1. Gira la etapa (por ejemplo, a -70°) y ajusta una inclinación inicial de la etapa (por ejemplo, 15°) (Figura 3H).
        NOTA: El portamuestras presenta una pre-inclinación de 45°.
      2. Define la posición final de la lámina dentro de una zona lisa del bloque tisular.
        NOTA: Confirme que el área seleccionada está libre de contaminación por hielo.
      3. Realizar fresado sistemático utilizando las corrientes del haz iónico especificadas en la Tabla 1. Se avanza de corrientes más altas a menores a medida que se acerca al plano objetivo (Figura 3I,J). Opcionalmente, cuando se encuentra a menos de 1–2 μm de la lámina, se puede fresar una zanja de alivio de tensiones aproximadamente a 1,5 μm de distancia para evitar la flexión o el enrollamiento de la lámina30,31.
        NOTA: Cuando el material restante está dentro de ~1 μm del plano objetivo, limita el grosor eliminado por pasada.

4. Recogida de datos crio-ET

  1. Tras una preparación exitosa de la lama, carga cuidadosamente la rejilla en un microscopio electrónico de transmisión (TEM) equipado con un soporte criogénico, un filtro de energía y software de tomografía (por ejemplo, SerialEM).
  2. Adquiere un mapa de atlas de toda la cuadrícula (por ejemplo, Figura 4A; aumento típico es 155×).
  3. Navega hasta la posición de la lámina y adquiere un mapa de montaje (por ejemplo, Figura 4B; aumento típico de 3600× con un desenfoque de -100 μm).
  4. Establecer la magnificación nominal de grabación y verificar que el tamaño del píxel es adecuado para la resolución deseada; en el presente estudio, se utilizó un tamaño de píxel de 2,109 Å. Ajusta los parámetros de iluminación correspondientes, incluyendo el tamaño del punto, el diámetro de apertura C2 y el área de iluminación, para lograr una tasa de dosis optimizada para el detector directo de electrones.
  5. Configura las condiciones de enfoque y de prueba de iluminación para que coincidan con las establecidas para el parámetro Record.
  6. Realiza la recogida de datos usando los scripts32 de PaceTomo, siguiendo los siguientes pasos:
    1. Preselecciona objetivos en el mapa de montaje usando la función de "añadir puntos" en el navegador, asegurando que la primera característica muestre suficiente contraste.
    2. Selecciona los objetivos usando el PACEtomo_selectTargets.py script32, ajustando el área destacada en la ampliación de vista previa si es necesario. Las regiones típicas de interés se muestran en la Figura 4C.
    3. Adquiere series de inclinación usando un esquema simétrico de dosis (por ejemplo, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... hasta ±60°–66°) con un incremento de 2° o 3°. Establecer parámetros de adquisición en el script PACEtomo.py: el ángulo de inclinación inicial se determina por el ángulo de fresado especificado en el Paso 3.7.1 (es decir, 8°), con su signo dependiente de la orientación de carga de la muestra en la crio-EM; los ángulos de inclinación mínimo y máximo se refieren a valores absolutos; y el tamaño del paso corresponde al incremento de inclinación (por ejemplo, 3°).
      NOTA: Este ángulo de inclinación inicial está diseñado para posicionar la lámina de forma horizontal y perpendicular al haz de electrones. Si se desconoce el ángulo de fresado, inclina la imagen para mostrar la lámina a su máxima altura aparente; esto proporciona una alineación suficientemente precisa.
    4. Mantener una dosis acumulada de electrones de 100–150 e⁻/Å2 distribuida en todas las inclinaciones. Si está disponible, utiliza un filtro de energía con un ancho de rendija de 10 eV.
    5. Iniciar la adquisición de datos. Se implementan enfoques y seguimientos automatizados en cada ángulo de inclinación. El tiempo típico de adquisición para una sola serie de inclinación es de 5–8 minutos.
      NOTA: En la Tabla 2 se proporciona una guía de solución de problemas.

5. Procesamiento de datos

  1. Corregir el movimiento en serie de inclinación de procesos, estimación CTF, alineación y reconstrucción de tomogramas 3D usando AreTomo3 33 para realizar tres pasos principales: (1) corrección de movimiento de fotogramas de imagen en bruto, (2) estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) para cada imagen inclinada, y (3) alineación de toda la serie de inclinación.
    1. Tras el alineamiento, reconstruye tomogramas tridimensionales (3D ) mediante el algoritmo de retroproyección ponderada. Las entradas necesarias para este paso incluían: fotogramas de imagen en bruto, archivos de metadatos mdoc (que documentan los parámetros de adquisición de la serie de inclinación) y el eje de rotación predeterminado de la muestra.
  2. Corrección de cuña ausente
    1. Tras la reconstrucción, someten los tomogramas generados a corrección de cuña ausente usando IsoNet34.
  3. Selección y curación de partículas
    1. Realiza la selección de partículas en EMAN 2.935 usando el método de coincidencia de plantillas. Tras la selección automática, los falsos positivos (es decir, regiones no objetivo o regiones erróneamente seleccionadas) se excluyeron manualmente para garantizar la calidad del conjunto de partículas seleccionado.
  4. Promediado subtomograma
    1. Importa la serie de inclinación y sus coordenadas de partículas correspondientes a RELION 4.0. Realiza el promedio de subtomogramas siguiendo el flujo de trabajo estándar descrito en la documentación RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), lo que garantiza la adhesión a las mejores prácticas establecidas para la reproducibilidad.

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Resultados

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La aplicación exitosa de este protocolo permite la producción de láminas tisulares vitrificadas de alta calidad y la posterior reconstrucción de tomografías que revelan la ultraestructura celular nativa. Los siguientes resultados, demostrados utilizando tejido hipocampal de ratón, son representativos de un experimento exitoso.

Los bloques de tejido procesados mediante congelación a alta presión con el método "waffle" exhibían una apariencia uniforme y transpar...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El flujo de trabajo presentado aquí establece una cadena generalizada, optimizada y reproducible para la crio-tomografía electrónica in situ de tejidos nativos y gruesos. Su contribución principal no radica en la invención de técnicas singulares, sino en la integración sistemática, el refinamiento y la estandarización detallada de todo el proceso, desde una vitrificación robusta mediante un método modificado de waffle-HPF hasta un protocolo de levantamiento y adelgazamiento de c...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen al personal del Centro de Crio-EM de la Universidad del Sur de Ciencia y Tecnología su apoyo técnico. Este proyecto fue apoyado por la National Science and Technology Innovation (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – National Science and Technology Major Project, Subvención nº 2022ZD0211905) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones nº 32200998 y nº 32161133022).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-HexadecenoSigma-AldrichH2131Químicos y Reactivos
2-MetilpentanoSigma-AldrichM65807Químicos y Reactivos
Anillo de agrafeThermo Fisher Scientific1131750; 1188953Consumibles
Lámina de cobreMateriales metálicos de Fengcheng1 & micro; Grosor mConsumibles
Rejillas TEM de soporte de cobre (malla 100)Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., LtdBZ10021bConsumibles
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Equipamiento 
CriofibrilaciónThermo Fisher ScientificAquilos 2Equipamiento 
Crio-FIB AutogridThermo Fisher Scientific1205101Consumibles
Cuadrículas (malla UltrAufoil R 1.2/1.3 300)QuantifoilAltrAufoilConsumibles
Congelador de alta presiónLeica MicrosystemsEM ICEEquipamiento 
Portador HPF, cobreLeica MicrosystemsTipo B (6 mm)Consumibles
Encohador de Sputter IónicoQuórumQ150RS plusEquipamiento 
Pasta de pulido metalográficaLab-testecW0.5Consumibles
Tejido de pulirGORALB00809Consumibles
LijaPapel de lija de la marca EagleGrano 8000, grano 12000Consumibles
EstereomicroscopioLeica MicrosystemsS9iEquipamiento 
SacarosaSigma-Aldrich200-334-9Químicos y Reactivos
Software de adquisición de la serie Tilthttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Software
Alineación y alineación de la serie Tilt Software de reconstrucciónhttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Software
Software de adquisición de la serie Tilthttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoSoftware
Alineación y alineación de la serie Tilt Software de reconstrucciónhttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetSoftware
Alineación y alineación de la serie Tilt Software de reconstrucciónhttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Software
Alineación y alineación de la serie Tilt Software de reconstrucciónhttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.htmlRelion 4Software

Referencias

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