Un protocolo para el enriquecimiento basado en el tamaño de gotas lipídicas de células epiteliales y tejidos mamarios bovinos

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo lograr la separación y enriquecimiento de las gotas lipídicas basadas en el tamaño mediante centrifugación secuencial, permitiendo una investigación precisa y reproducible de los mecanismos del metabolismo lipídico y los procesos biológicos asociados a las gotas lipídicas.

Resumen

Este protocolo describe un enfoque secuencial de centrifugación diferencial para enriquecer gotas lipídicas (LDs) de diferentes tamaños a partir de células epiteliales mamarias bovinas (BMECs) y tejidos mamarios, permitiendo un análisis resuelto por tamaño más allá de los métodos convencionales de aislamiento masivo de LD. Como centros reguladores dinámicos del metabolismo lipídico intracelular, los LD cumplen funciones críticas al almacenar lípidos neutros (como triglicéridos y ésteres de colesterilo) y coordinar su síntesis, hidrólisis y transporte. Desempeñan un papel central en el mantenimiento de la homeostasis energética, el apoyo a la biogénesis de membranas y la facilitación de la transducción celular de señales. La extracción de LD es esencial para investigar los mecanismos reguladores del metabolismo lipídico. Estudiar el metabolismo lipídico de las glándulas mamarias tiene implicaciones significativas para el desarrollo infantil, la salud humana, la economía agrícola y la biología celular fundamental. Por ello, describimos un método diferencial de centrifugación para extraer los LDs de los BMECs y del tejido de las glándulas mamarias. A diferencia de los enfoques convencionales de aislamiento de LD a granel, este protocolo permite el enriquecimiento basado en el tamaño de subpoblaciones de LD ajustando secuencialmente las fuerzas centrífugas. La integridad y el enriquecimiento relativo de las fracciones de LD se evalúan preliminarmente mediante tinción BODIPY493/503, proporcionando un enfoque práctico y reproducible para análisis posteriores del metabolismo lipídico y procesos asociados a LD.

Introducción

Las gotas lipídicas (LD) son orgánulos dinámicos dentro de las células que sirven como sitios principales de almacenamiento para los lípidos^{neutros 1}. La acumulación anormal de LDs está asociada a una amplia gama de enfermedades, que van más allá de la obesidad e incluyen condiciones como la enfermedad hepática^{grasa 2}, enfermedades^{cardiovasculares 3}, diabetes⁴ y cáncer⁵. Por el contrario, un número insuficiente de LDs también puede tener consecuencias graves, lo que lleva a la pérdida de reservas de energía celular y a posteriores deterioros^{funcionales 6}. En el contexto de la economía agrícola, la insuficiencia de LDs en rumiantes puede resultar en una secreción insuficiente de grasa de la leche, lo que da lugar a la depresión de la grasa de la leche, lo que a su vez compromete el valor nutricional y la comercialización de los productos^{lácteos 7}. Actualmente, la regulación del metabolismo del LD ha surgido como un área importante de investigación.

El desarrollo de técnicas de extracción para LDs desde el siglo XX ha buscado consistentemente extraer LDs en mayor cantidad, con mayor pureza y mejor preservada actividad biológica. Esto implica el establecimiento y optimización continua de metodologías. Actualmente, varias empresas han diseñado kits comerciales para LD^{separation 8}. Aunque estos kits reducen considerablemente el tiempo de separación y solo requieren el uso de centrifugadoras convencionales, para muestras difíciles de disociar, el reactivo no puede ajustarse y es complicado optimizar los pasos de la prueba. Además, la extracción de LDs desempeña un papel indispensable en la elucidación de los mecanismos de la enfermedad, incluidos los de enfermedades metabólicas como el hígado^{graso 9}, el cáncer¹⁰ y las enfermedades neurodegenerativas¹¹, sirviendo como una sonda multidimensional para descifrar vías patológicas. Las composiciones de proteínas y lípidos también pueden diseccionarse extrayendo LDs para revelar la diversidad de las funciones biológicas de las^{LD 12}.

La formación de grasa lechera no es simplemente un proceso de degradación del sustrato; más bien, representa un proceso altamente orquestado de síntesis y empaquetado de lípidos llevado a cabo por células epiteliales mamarias. ¹³. La generación de grasa lechera en vacas lecheras depende del mecanismo de secreción de la membrana apical de estas células: los triglicéridos sintetizados en el retículo endoplasmático forman LDs citoplasmáticos, que luego son transportados a la membrana apical y secretados mediante gemación. Durante este proceso, los LD se ven envueltos por una membrana de glóbulos de grasa lechera derivada de la membrana apical, lo que da lugar a la formación de glóbulos de grasa lechea estructuralmente^{estables 14}. La glándula mamaria bovina sirve como un modelo clásico para estudiar la lactancia en mamíferos, y los mecanismos centrales que rigen la síntesis y secreción de LD están altamente conservados^{en humanos 15}. Establecer métodos para extraer LDs tanto de las BMECs como del tejido mamario puede conectar la producción ganadera y la salud humana. Posteriormente, se pueden aprovechar análisis proteómicos y lipidómicos de los LDs extraídos para mejorar la producción y la calidad de la leche, garantizando la seguridad y protección.

El método actual se basa principalmente en la característica de baja densidad de las LD, que hace que floten hasta la cima del gradiente durante la^{centrifugación 16}. El procedimiento de extracción consta de tres pasos principales: recogida de muestras, ultracentrifugación para flotación LD y lavado LD. Se añade sacarosa (2,5 M) al tampón para proteger las LDs, y la velocidad de centrifugación se ajusta según los requisitos experimentales; normalmente, los LD grandes pueden enriquecerse a fuerzas inferiores a 10.000 x G, mientras que se emplean velocidades mayores (por encima de 10.000 x g) para extraer LDs pequeños, ya que los LD más grandes pueden romperse bajo estas condiciones. Finalmente, los LDs extraídos se someten a múltiples lavados para evitar la contaminación, y la pureza de la extracción se evalúa preliminarmente mediante tinción BODIPY493/503.

Los métodos convencionales de aislamiento de LD logran principalmente la recuperación masiva de poblaciones heterogéneas de LD, limitando el análisis de diferencias estructurales y funcionales dependientes del tamaño. El protocolo actual amplía los enfoques estándar al permitir el enriquecimiento basado en el tamaño de subpoblaciones de LD mediante centrifugación diferencial secuencial, facilitando la investigación del crecimiento, renovación, tráfico intracelular y utilización diferencial de LD por vías lipolíticas o autofágicas. Este enfoque logra el enriquecimiento en lugar de la purificación absoluta, y puede producirse una superposición parcial entre fracciones de tamaño debido a distribuciones continuas de tamaño y propiedades físicas compartidas.

Protocolo

Determinar el tamaño de la gota lipídica objetivo para el enriquecimiento (Figura 1).

1. Configuración del reactivo

1. PBS: Peso 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3,58 g de Na₂HPO₄·12H₂O y 0,24 g KH₂PO₄ en 800 mL ddH₂O. Ajusta el pH a 7.4 con HCl, mezcla bien y reduce el volumen a 1 L. Conserva a 4 °C hasta 1 año después del autoclavado.
2. Sacarosa (2,5 M): Pesa 856 g de sacarosa y disuelvé en 400 mL de ddH₂O. Remueve bien hasta que la sacarosa esté completamente disuelta, luego ajusta el volumen a 1 L. Autoclave la solución y guarda a 4 °C durante hasta 3 meses.
3. Buffer A: Pesa 1,79 g de Tricine y disuelve en 400 mL de ddH₂O. Ajusta el pH a 7,8 con KOH. Tras ajustar el pH, añade 50 mL de solución de sacarosa 2,5 M previamente preparada. Mezcla bien y ajusta el volumen a 500 mL. Tras el autoclave, el buffer puede almacenarse a 4 °C durante hasta 3 meses.
4. Amortiguador B: Pesa 0,95 g de HEPES, 1,49 g de KCl y 0,038 g de MgCl₂·6H₂O por separado en 180 mL ddH₂O. Ajusta el pH a 7,4 con KOH, mezcla bien y lleva el volumen a 200 mL. Después de la autoclave, guarda a 4 °C hasta 3 meses.
5. PMSF (1.000x, 0,2 M): Pesa 0,175 g de PMSF y disuelve en 5 mL de DMSO. Conservar protegido de la luz a -20 °C durante hasta un año.
   NOTA: El PMSF es altamente tóxico; Deben tomarse medidas de protección adecuadas. Durante la preparación, asegurarse de protección total contra la luz; El PMSF es difícil de disolver y puede alicitarse en tubos microcentrífugas de 1,5 mL.

2. Extracción de LDs de las células

1. Cultura de BMEC
   1. Saca cinco tubos de celdas BMEC congeladas del frigorífico a -80 °C y descongelalas rápidamente en un baño maria a 37 °C. Centrifuga los tubos a 250 x g durante 4 minutos y 30 segundos después de descongelar completamente.
   2. Desecha el medio de criopreservación con un pipetador, añade 1 mL de FBS al 10% para resuspender las células, mezcla y añade suavemente las células a una placa de cultivo celular de 100 mm que contenga 6 mL de FBS al 10%. Mecía suavemente el plato para asegurar una distribución celular uniforme e incuba a 37 °C con un 5% de CO₂.
   3. Monitorizar la morfología celular al microscopio y realizar subcultivos cuando las células alcancen una confluencia del 80%–90%.
      NOTA: Asegurar la condición óptima de las células y un número suficiente de células antes de la extracción de LD para mejorar el rendimiento y la reproducibilidad.
   4. Desecha el medio de cultivo original en la placa de Petri con una pipeta, y añade 1 mL de PBS a lo largo de la pared de cada plato. Después de lavar dos veces, añade 1 mL de tripsina a cada plato y incuba a 37 °C durante 3 minutos y 30 s.
   5. Observa si las células están completamente digeridas bajo el microscopio, añade 1 mL de FBS al 10% para terminar la digestión una vez terminada la digestión. Resuspende suavemente las células pipeteando, transfierelas a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y centrifuga a 250 x g durante 4 min 30 s.
   6. Descarta el sobrenadante y repite los procedimientos descritos en el Paso 1.2.
   7. Expande las células usando aproximadamente 30 recipientes de cultivo o vasos de cultivo más grandes, o utiliza recipientes de cultivo más grandes para cultivos celulares. Añade 150 μmol/L de t10,c12-CLA (diluido en DMEM) para tratar las células la noche antes de la extracción. Utiliza 7 mL de medio de cultivo por cada plato de cultivo de 100 mm. El tiempo de cultivo depende del tamaño de los lúcidos que necesiten separarse.
      NOTA: Según optimizaciones previas, tratar los BMECs con t10,c12-CLA durante 6 horas para enriquecer los LDs grandes o durante 12–24 horas para enriquecer LDs pequeños. Dado que las células contienen pocas LDs, normalmente se añaden ácidos grasos exógenos para inducir la acumulación de LDs. En este estudio, se añade t10,c12-CLA a las células cultivadas para inducir la acumulación de LDs.
2. Recogida de muestras
   1. Descarta el medio original, añade 1 mL de PBS bien frío y lávalo 3 veces. No descartes PBS durante el lavado final. Usando como ejemplo 30 platos de celdas de 100 mm, recogiendo celdas de cada 10 placas en un tubo centrífuga de 15 mL, cada tubo contiene aproximadamente 1x108, lo que resulta en un total de 3 tubos centrífuga.
      NOTA: Mantenga todas las muestras a ≤4 °C durante todo el proceso de extracción para evitar la degradación de proteínas en los LDs.
   2. Tras el equilibrio, centrifugar a 1.000 x g, 4 °C durante 10 minutos.
   3. Descarta el PBS. Añade 10 mL de Buffer A prepreparado y 10 μL de PMSF (1.000x, 0,2 M) al tubo de la centrífuga. Mezcla bien y incuba en hielo durante 20 minutos.
3. Lisis celular y fraccionamiento inicial
   1. Las células disruptivas mediante un homogeneizador ultrasónico tipo sonda operaban en ciclos pulsados de 5 s ON y 10 s OFF, resultando en un tiempo total efectivo de sonicación de 10 minutos durante un periodo de 30 minutos. Ajusta el instrumento al 40% de potencia (correspondiente a una amplitud de sonda de aproximadamente 76 μm) utilizando una sonda de 3 mm de diámetro.
      NOTA: Conserva las muestras sobre hielo durante todo el procedimiento para evitar el sobrecalentamiento.
   2. Centrifuga el homogenado a 3.000 x g y 4 °C durante 10 minutos para eliminar núcleos y restos celulares. Recoge el sobrenadante como el supernadante postnuclear (PNS).
4. Ultracentrifugación de LDs flotantes
   1. Filtra el sobrenadante a través de un colador de celda de 100 μm.
   2. Pipetear 10 mL de PNS en un tubo centrífugo de 15 mL. Añadir 2 mL de sacarosa (2,5 M) y 2 mL de Buffer B de forma secuencial en la parte superior del PNS (el volumen de sacarosa puede reducirse adecuadamente mientras se incrementa el volumen del Buffer B para mejorar la pureza del LD), y luego centrifugar por primera vez (5.000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Después de la centrifugación, recoge la capa lechosa y cremosa de LD en la parte superior del tubo. Para recoger LDs, primero se añaden 100 μL de Buffer B a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL, y luego se utiliza una pipeta de 20 μL para aspirar suavemente la capa flotante de LD varias veces, recogiendo la mayor cantidad posible de LDs.
      NOTA: Los LD forman una capa de crema flotante en la parte superior; Evita aspirar la solución subyacente tanto como sea posible para evitar la contaminación.
   4. Realiza una segunda centrifugación (10.000 x g, 4 °C, 30 min) y recoge los LDs.
   5. Transfiere la solución a un tubo ultracentrífuga compatible con un rotor de cubo oscilante, tapa y equilibra los tubos. Realiza la tercera centrifugación en una ultracentrífuga (50.000 x g, 4 °C, 40 min) y recoge los LDs.
      NOTA: Equilibrar con precisión los tubos (hasta 0,0001 g) para asegurar un funcionamiento seguro de la ultracentrífuga.
   6. Tras el equilibrio, realiza la cuarta centrifugación (150.000 x g, 4 °C, 50 min) para continuar recogiendo los LDs. Optimiza la velocidad y duración según el tamaño objetivo del LD.
      NOTA: La centrifugación prolongada o repetida a alta velocidad puede interrumpir los LDs. En cambio, la centrifugación de corta duración a 10.000 x g durante el lavado elimina principalmente impurezas y tiene un impacto mínimo en la integridad de la LD. Este método es adaptable; Puede ser necesaria optimización para diferentes tipos celulares o tejidos.
5. Lavar los LDs
   1. Resuspende los LDs recogidos en el Buffer B en frío y centrifuga a 10.000 x g y 4 °C durante 5 minutos.
   2. Retira cuidadosamente el sobrenadante y repite el paso de lavado al menos cuatro veces usando el mismo volumen de tampón, fuerza centrífuga y tiempo de centrifugación. Para LDs pequeños, aumenta la fuerza centrífuga según sea necesario para asegurar una separación eficiente.
   3. Tras el lavado final, agrupa las fracciones de LD, mezcla suavemente y guárdalas a −80 °C.
      NOTA: No omitas los pasos de lavado, aunque cierta pérdida de sueño lúcido sea inevitable. Sigue lavando hasta que no queden restos visibles de membrana.

3. Extracción de LDs del tejido

1. Recogida de muestras
   1. Obtener muestras de tejido mamario bovino de nitrógeno líquido. Pesa 5 g de papel de seda y descongélalo sobre hielo hasta que no queden cristales de hielo.
   2. Enjuaga el tejido con PBS o solución fisiológica.
   3. Pica el tejido en trozos de 1-2 mm usando tijeras quirúrgicas.
   4. Transfiere el tejido picado a un mortero preenfriado que contenga 12 mL de Buffer A y 10 μL de PMSF (1.000x, 0,2 M). Muele la mezcla sobre hielo durante aproximadamente 10 minutos.
   5. Incuba el homogenado sobre hielo durante 20 minutos.
   6. Tras una molienda exhaustiva, recoge el homogeneado en un tubo centrífugo de 15 mL.
   7. Centrifugar a 2.500 x g, 4 °C durante 10 minutos. El sobrenadante resultante es el SNP.
2. Ultracentrifugación de LDs flotantes
   1. Filtra el sobrenadante a través de un colador de celda de 100 μm.
   2. Pipetear 10 mL de PNS en un tubo centrífugo de 15 mL. Añade 2 mL de sacarosa y 2 mL de Buffer B de forma secuencial. Realiza la primera centrifugación (4.000 x g, 4 °C, 20 min). Recoge el material lechoso, parecido a la crema.
   3. Realiza una segunda centrifugación (7.000 x g, 4 °C, 30 min) y recoge los LDs.
   4. Realiza una tercera centrifugación (10.000 x g, 4 °C, 40 min) y recoge los LDs.
   5. Transfiere el sobrenadante a un tubo SW40 y realice la ultracentrifugación (50.000 x g, 4 °C, 50 min). Recoge los LDs.
   6. Realizar una quinta centrifugación (100.000 x g, 4 °C, 60 min). Recoge los LDs.
3. Lavar los LDs
   Consulta el método de lavado para los LDs extraídos por células.

4. Validación preliminar de la pureza del LD mediante tinción

1. Preparar con antelación una solución de colorante fluorescente lipídico neutro de 10 μg/mL bajo condiciones protegidas de la luz (BODIPY: Buffer B = 1:100, V/V).
2. Añade una cantidad adecuada de LDs mezclados y el Buffer B a un tubo de microcentrífuga. En condiciones protegidas de la luz, añade una cantidad adecuada de solución de colorante fluorescente lipídico neutro. Mezcla bien y incuba durante 10 minutos.
3. Prepara una lámina limpia para el microscopio. Dispensa 2,5 μL de la mezcla sobre la cubierta. Coloca suavemente la lámina sobre la mezcla, evitando burbujas de aire. Observa bajo un microscopio de fluorescencia invertida.

5. Validación de la pureza de LD mediante Western blot

1. La concentración de proteínas de las fracciones de LD se midió utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA.
2. Para el análisis Western blot, mezcla 20 μg de proteína de cada muestra con 5x SDS carga de tampón y calienta a 99 °C durante 10 minutos para asegurar una desnaturalización completa.
3. Después, se separan las proteínas mediante SDS–PAGE en geles de poliacrilamida con gradiente del 10% según sus pesos moleculares.
4. Tras la electroforesis, transfiere las proteínas a membranas PVDF preactivadas y luego bloquea con un 5% de BSA a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Posteriormente, incubo las membranas durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios, incluyendo anti-perilipina 2 (1:500) y anti-β-actina (1:5000).
5. Lava las membranas tres veces con 1 TBST durante 10 minutos cada una, luego incuba con anticuerpo secundario anticonejo conjugado con HRP (1:5000) durante 1,5 h a temperatura ambiente.
6. Tras tres lavados adicionales con TBST, detectar bandas proteicas usando un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y visualizar con un sistema de imagen en gel.

6. Puntos de pausa y directrices de almacenamiento

1. Mantén el PNS en hielo durante hasta 1–2 horas antes de la ultracentrifugación.
2. Mantén los LDs recogidos en hielo durante hasta 1–2 horas antes de lavarlos. Para almacenamiento a corto plazo, guarda los LDs a 4 °C durante hasta 24 horas. Para almacenamiento a largo plazo, almacenar las LDs a −80 °C y limitar los ciclos de congelación-descongelación a no más de uno para preservar la integridad de la LD.
3. Durante todas las pausas experimentales, mantener las muestras sobre hielo con las tapas de los tubos cerradas para minimizar la contaminación.

7. Resolución de problemas

1. Capa delgada flotante: ajusta el volumen del tampón o la fuerza de centrifugación.
2. Mala flotación: aumenta la velocidad de centrifugación o extiende el tiempo.
3. Contaminación: asegura un manejo estéril y tampones filtrados.
4. Rotura de LD: mantén las muestras sobre hielo, reduce la fuerza de centrifugación o vuelve a suspender suavemente.

Resultados

Flujo de trabajo y marco metodológico
Se estableció un esquema de árbol de decisión (Figura 1) para guiar la selección de condiciones de centrifugación según los objetivos experimentales. Específicamente, se usaron fuerzas centrífugas ≤10.000 x g para enriquecer grandes LDs (≥2 μm), mientras que fuerzas >10.000 x g se aplicaron para enriquecer LDs pequeños (<1 μm). Este marco proporciona una base práctica para lograr una...

Discusión

Los LD son orgánulos únicos caracterizados por un núcleo lipídico neutro encerrado por una monocapa de fosfolípidos. Brotan del retículo endoplásmico y cambian dinámicamente de tamaño y número, facilitando el transporte intracelular y la comunicación extensa con otras estructuras subcelulares para coordinar la homeostasis lipídica^celular 17,18,19. Este comportamiento dinámico se modera aún más m...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	25200072	reactivo
Kits de preparación rápida en gel 10% PAGE	Beijing BIOMAN	PG112	reactivo
100 & mu; Colador de células M	Beyotime	FSTR100	reactivo
Plato de cultivo celular de 100 mm	Corning	490167	reactivo
Amersham Imager 600	GE Ciencias de la Vida en la Atención Sanitaria	600	Equipamiento
Autoclave	Panasonic	MLS-3751L	Equipamiento
Kit de ensayo de proteínas BCA	Beijing Dingguo.	BCA01	reactivo
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	reactivo
Centrifugadora	Eppendorf		Equipamiento
DMEM	HyClone	SH30022.01	reactivo
DMSO	Solarbio	D8370	reactivo
Suero fetal bovino	Gibco	2492319	reactivo
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	reactivo
Anticuerpo secundario anticonejo AffiniPure conjugado con HRP	Proteintech	SA00001-2	reactivo
KCl	HUSHI	20030666	reactivo
KH2PO4	HUSHI	10017608	reactivo
MgCl2	HUSHI	20059028	reactivo
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI	S112623	reactivo
NaCl	HUSHI	10019328	reactivo
Buffer de carga instantánea de proteínas Omni-Easy	Tecnología Biomédica de Epizymas de Shanghái	LT101S	reactivo
Kit de detección de quimioluminiscencia ultrasensible Omni-ECL	Tecnología Biomédica de Epizymas de Shanghái	SQ201	reactivo
PBS	HyClone	SH30256.01	reactivo
Penicilina y Estreptomicina 100 y más veces;	NCM Biotecnología	CLOOC5	reactivo
Medidor de pH	METTLER TOLEDO	S220K	Equipamiento
Pipeta	Eppendorf		Equipamiento
PMSF	Coolaber	CP8651	reactivo
Kit de transferencia de membrana PVDF	GenScript	eBlot L1	reactivo
Conejo anti-Perilipina 2	Abcam	15294-1-AP	reactivo
Conejo anti-β-actina	Proteintech	20536-1-AP	reactivo
Microscopio de fluorescencia invertida de grado de investigación	Olimpo	IX73	Equipamiento
Sacarosa	Solarbio	S8271	reactivo
SW 40 Ti Rotor	BECKMAN COULTER	331301	Equipamiento
Trans-10, ácido linoleico conjugado cis-12	CAIMÁN	90145	reactivo
Tricine	Coolaber	CT11331	reactivo
Ultracentrífuga	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	Equipamiento
Trituradora de celdas ultrasónicas	SCIENTZ	JY92-11N	Equipamiento