Lactilación de lisina específica del sitio mediante expansión del código genético en E. coli y células de mamíferos

Resumen

Este estudio estableció un método que utiliza la expansión del código genético para incorporar con éxito la lactillisina (Klac) en sitios específicos de la enolasa-1 humana (hENO1) y la GFP superplegadora (sfGFP) en Escherichia coli y células de mamíferos.

Resumen

La lactilación es una modificación postraduccional (PTM) descubierta recientemente con diversas funciones biológicas. Desde su identificación inicial en 2019 como regulador de la polarización de los macrófagos, la lactilación de histonas ha surgido como un eslabón clave que conecta el metabolismo celular con la regulación funcional. Bioquímicamente, implica la transferencia covalente de un grupo lactílico a los residuos de lisina, mediada ya sea por lactiltransferasas que utilizan lactil-CoA como donante de acilo o por aminoacil-ARNt sintetas (AARS) a través de un intermediario lactil-AMP. A través de estos mecanismos, los niveles intracelulares de lactato se acoplan directamente a la modificación y función de las proteínas. La lactilación media una serie de procesos celulares críticos, desde funciones fisiológicas como la regulación génica, la reparación del ADN, la reprogramación metabólica y la modulación inmunitaria hasta procesos patológicos como la progresión tumoral y la metástasis. A pesar de la identificación de numerosos sitios de lactilación por parte de la proteómica, lograr la lactilación de lisina específica de sitio mediante mutagénesis sigue siendo un desafío. Para abordar esto, empleamos tecnología de expansión del código genético, utilizando una aminoacil-lisina sintetasa específica de aminoacil-lisina (KlacRS) y su ARNt cognado para incorporar con precisión la lactillisina (Klac) en residuos designados. Esta estrategia permite la generación de variantes homogéneamente lactiladas de proteínas para estudios funcionales directos. Aquí describimos un protocolo simplificado para la lactilación proteica específica del sitio, validado tanto en Escherichia coli (E. coli) como en células de mamíferos, utilizando enolasa-1 humana (hENO1) y GFP superplegadora (sfGFP) como sistemas modelo.

Introducción

La lactilación de lisina (Klac), identificada originalmente en las histonas, ha surgido como un nodo clave que vincula el metabolismo tumoral aberrante con la regulación^{epigenética 1}. La acumulación de lactato resultante de la glucólisis aeróbica aumentada en las células tumorales proporciona una base metabólica para la lactilación, permitiendo que el lactato actúe no solo como un subproducto metabólico, sino como una molécula de señalización que modula directamente la función de las proteínas. Cada vez hay más evidencia que indica que la lactilación participa ampliamente en la iniciación y progresión tumoral coordinando la proliferación de células^cancerosas 2,3,4,5, la metástasis⁶, la reprogramación metabólica⁷ y la resistencia terapéutica ^8,9.

A nivel fenotípico, una lactilación elevada está estrechamente asociada con una mayor agresividad tumoral. Por ejemplo, en el carcinoma de células claras de células renales (CCRC), la lactilación de H3K18 promueve la proliferación y la metástasis al aumentar el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β (PDGFRβ), estableciendo un bucle de retroalimentación positiva entre la acumulación de lactato y la señalización^{oncogénica 10}. De manera similar, en el cáncer colorrectal (CCR), una lactilación elevada de H3K18 impulsa la progresión tumoral mediante la transcripción mejorada del potenciador de autofagia tipo Rubicón (RUBCNL), promoviendo así la maduración del autofagosoma y apoyando la supervivencia de las células^{cancerosas 11}.

Más allá de los efectos directos sobre la agresividad tumoral, la lactilación también media la reprogramación metabólica tumoral al modular la expresión y actividad de genes relacionados con el^metabolismo. En el cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCLC), la lactilación de histonas regula a la baja las enzimas relacionadas con la glucólisis mientras que subregula las enzimas del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), aumentando la captación de glucosa en células tumorales y agravando la desregulación^{metabólica 12}. De forma consistente, el perfil global de lactiloma revela que la lactilación se dirige preferentemente a enzimas implicadas en las vías metabólicas centrales, incluyendo el metabolismo de la glucosa, el ciclo de la TCA, el metabolismo de aminoácidos/ácidos grasos, y estas modificaciones se correlacionan fuertemente con fenotipos^{tumorales agresivos 7}.

Es importante destacar que las consecuencias biológicas de la lactilación dependen mucho del sitio, y esta modificación ha surgido como un determinante clave de la resistencia terapéutica tumoral. En la CRC, la lactilación por K673 de la recombinación meiótica 11 (MRE11) mejora la reparación de la recombinación homóloga (HR), confiriendo así resistencia a la quimioterapia y a los inhibidores de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP^{) 13}. En el glioblastoma (GBM), la interacción entre el miembro de la familia aldehído deshidrogenasa 1 A3 (ALDH1A3) y la piruvato quinasa M2 (PKM2) eleva la producción de lactato, induciendo posteriormente la lactilación K247 de la proteína complementadora de reparación por rayos X (XRCC1) para mejorar la reparación del daño en el ADN, impulsando así la radioresistencia y la quimioresistencia a la temozolomida (TMZ^{) 14}. Estos estudios destacan colectivamente que el control preciso de la lactilación en los residuos definidos de lisina es esencial para la disección mecanicista y la orientación terapéutica.

Los avances en espectrometría de masas de alta resolución han revelado una lactilación generalizada entre enzimas metabólicas, factores de transcripción y transductores de señalización, subrayando su papel amplio en el control del metabolismo, la transducción de señales y la fisiología^celular 15,16,17,18. Hasta la fecha, se han reportado varias enzimas escritoras que catalizan la lactilación; por ejemplo, AARS1 media la lactilación p53 para promover la^{tumorogénesis 19}, y AARS1/2 regula la lactilación del cGAS para suprimir la inmunidad innata; sin embargo, estas enzimas son selectivas por sustrato y actualmente no pueden lograr una lactilación completamente específica del sitio en proteínas^{arbitrarias 20}. Por ello, el campo sigue siendo cuestionado respecto a cómo manipular a Klac de manera dirigida para fines de investigación o terapéuticos.

Los estudios funcionales siguen basándose predominantemente en la mutagénesis dirigida al sitio, sustituyendo típicamente una lisina (K) por glutamina (Q) para imitar el estado no cargado de modificaciones acil-lisina como la acetilación o la^lactilación 21,22,23,24. Sin embargo, este enfoque presenta limitaciones significativas para recapitular fielmente la lactilación nativa: la estructura química y la geometría de la cadena lateral de la glutamina difieren de las de una lisina lactilada y, de manera importante, una sustitución K por Q no puede distinguir entre estados acetilados y lactilados cuando ambas modificaciones podrían ocurrir en el mismo sitio.

La expansión del código genético (ECG) proporciona una solución poderosa a estas limitaciones al permitir la incorporación directa de aminoácidos no canónicos en proteínas en sitios definidos. Mediante el cribado positivo de una biblioteca mutante de Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA sintetasa (MmPylRS), identificamos previamente una variante que mostraba crecimiento dependiente de Klac. Este mutante, con mutaciones L301M, Y306L, L309A y C348F, fue designado KlacRS1^25,26. KlacRS1 aminoacila su ARNt ortogonal cognado con Klac, suprime el codón oclusivo ámbar y permite una incorporación eficiente y específica del sitio de Klac en proteínas objetivo. Además del KlacRS1, se han reportado varias otras variantes de aaRS capaces de incorporación de Klac, incluyendo el LacKRSderivado del Mb PylRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) y el LacKRS3 (Y271M/C313S^)19,27, así como un LacKRS derivado del MmPylRS (C348T/Y384F⁾²⁸. En conjunto, estas herramientas establecen un conjunto genético versátil para producir variantes de proteínas lactiladas específicas para el lugar, con el fin de comprender las consecuencias biológicas de eventos individuales de lactilación.

En nuestros estudios previos, aplicamos este sistema basado en GCE para expresar proteínas ALDOA con lactilación específica de sitio en Lys147 tanto en células de E. coli como en mamíferos. Los análisis funcionales demostraron que la lactilación en Lys147 ejerce un efecto de retroalimentación negativa sobre la glucólisis, mejora la estabilidad térmica y química de ALDOA y promueve su translocación desde el citoplasma al núcleo. Estos resultados no solo revelaron un mecanismo regulatorio previamente no reconocido de ALDOA, sino que también validaron la robustez, versatilidad y utilidad práctica de esta plataforma de lactilación específica^{para el sitio 25,26}. Partiendo de esta base, aquí usamos enolasa-1 humana (hENO1) y GFP supercarpeta (sfGFP) como ejemplos representativos para describir una estrategia simplificada para la incorporación precisa de Klac utilizando nuestro sistema ortogonal KlacRS/tRNA.

Protocolo

1. Mutagénesis del codón ámbar para la codificación genética de la lactillisina en el gen objetivo

1. Introducir un codón de parada ámbar TAG en la posición 89 del gen hENO1 y la posición 149 del genfGFP s mediante mutagénesis dirigida por sitio siguiendo el protocolo del fabricante, purificar el producto PCR y realizar recombinación homóloga. Utiliza los siguientes imprimadores:
   ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
   ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTGTGTGACGTTCAGTTTTTTG
   sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
   sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
   NOTA: Para la incorporación específica del sitio de lisina lactilada, el sitio objetivo debe mutarse en un codón oclusivo ámbar (TAG), u otros codones sin sentido, y TAA o TGA deben usarse como codón oclusivo genuino.
2. Descongelar las células competentes DH5α sobre hielo, mezclar 5 μL del producto de recombinación con 50 μL de células e incubar sobre hielo durante 30 minutos. Somete la mezcla a un choque térmico de 45 s a 42 °C y luego colócala sobre hielo durante 2-3 minutos. Añade 350 μL de medio LB e incuba a 37 °C con agitación (220 rpm) durante 1 hora.
3. Distribuye las células sobre una placa LB precalentada que contiene ampicilina e incuba a 37 °C durante 12-16 horas. Elige dos colonias individuales para la secuenciación de Sanger y así confirmar la mutación.

2. Expresión de proteína lactilada en células de E. coli

1. Co-transformar 50 μL de células químicamente competentes de E. coli DH10B con aproximadamente 100 ng de cada una de pBad-ENO1-K89TAG, que codifica el gen objetivo, y pEvol-MmKlacRS1 (plásmido de Addgene # 232157), que codifica el par KlacRS y tRNA.
2. Incuba la mezcla sobre hielo durante 25 minutos, haz un choque térmico a 42 °C durante 45 segundos y vuelve al hielo durante 3 minutos. Añade 350 μL de LB medium a temperatura ambiente, agita vigorosamente a 220 rpm durante 1 hora a 37 °C.
3. Esparce el cultivo celular sobre una LB/placa suplementada con 100 μg/mL de Ampicilina (Amp₁₀₀) y 50 μg/mL de Cloranfenicol (Cm₅₀). Incuba las placas a 37 °C durante 12-16 horas.
4. Elige una sola colonia para inocular un cultivo inicial de 4 mL e incuba durante la noche. Al día siguiente, expande la cultura nocturna a 400 mL de LB/_{amperio 100}cm₅₀ y luego agita vigorosamente a 220 rpm, 37 °C, hasta que el diámetro exterior 600 alcance 0,6-0,8.
5. Inducir con 0,2% de L-arabinosa y 1 mM Klac; incubar a 30 °C, 220 rpm durante 16 horas adicionales.

3. Codificación genética de la lactilisina en células HEK 293T

1. Células semilla en placas de 12 pozos a una densidad de 1 x 10⁵ celdas por pozo con 1 mL de medio DMEM. Tras 24 horas de incubación, cuando la confluencia celular alcanza el 70%-80%, realiza la transfección.
   NOTA: Se recomienda una confluencia del 70%-80% para la transfección, mientras que los ensayos de formación de colonias requieren densidades de siembra más bajas, que deben determinarse empíricamente.
2. Para preparar una solución de ADN diluido, añadir 0,75 μg de pcDNA-sfGFP-N149TAG y pNeu-KlacRS (plásmido de Addgene # 232155) en una proporción 1:1 en 38 μL de DMEM sin suero con glucosa alta. Pipetea suavemente arriba y abajo o haz un vórtice breve para mezclar.
3. Para preparar reactivo de transfección diluido, añadir 2,25 μL de reactivo de transfección en 38 μL de DMEM sin suero con glucosa alta. Pipetea suavemente arriba y abajo 3 o 4 veces para mezclar.
   NOTA: Si Opti-MEM puede usarse depende de las instrucciones del fabricante, ya que su contenido sérico puede interferir con la eficiencia de la transfección.
4. Añade inmediatamente el reactivo de transfección diluido a la solución de ADN diluido de una vez.
   NOTA: No mezcles las soluciones en orden inverso.
5. Inmediatamente haz una pipete arriba y abajo 3 o 4 veces o haz un vórtice breve para mezclar. Incuba durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formen complejos de transfección/ADN.
   NOTA: El complejo de transfección/ADN debe utilizarse en un plazo de 20 minutos tras la preparación.
6. Añade la mezcla de transfección/ADN de 50 μL gota a gota sobre el medio en cada pozo y homogeneiza la mezcla girando suavemente la placa.
7. A las 6 horas de la transfección, sustituye el medio por DMEM fresco que contenga 1 mM Klac. Cultivo para 24-48 horas.
   NOTA: Según nuestros datos previos, Klac a concentraciones de 1-5 mM no mostró efectos citotóxicos sobre las células²⁶. La concentración de trabajo de Klac debe optimizarse en función del nivel de expresión proteica. Si la proteína objetivo es propensa a la pérdida de la modificación de lactilación, se recomienda la administración de inhibidores de HDAC (por ejemplo, Tricostatina A) o el inhibidor de sirtuína NAM (nicotinamida).

4. Purificación por etiqueta His-tag de proteínas lactiladas en células de E. coli

1. Extrae las células por centrifugación a 6.900 x g durante 10 minutos a 4 °C. Resuspender en 50 mL de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl). Lisar por ultrasonicación sobre hielo durante pulsos de 3 s, intervalos de 8 s a 200 W durante 30 minutos. Centrifugar a 13.800 x g, 4 °C durante 30 minutos y luego recoger el sobrenadante.
   NOTA: Si la proteína objetivo es susceptible al corte mecánico, el paso de ultrasonicación puede sustituirse por la lisis celular suave utilizando un reactivo de extracción proteico formulado adecuado para E. coli.
2. Filtrar el sobrenadante a través de una membrana de 0,45 μm para recoger las fracciones solubles. Carga los lisados clarificados en una columna de gravedad Ni-NTA de 1 mL. Lavar con aproximadamente 5 mL de Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl,
   5 mM de imidazol) hasta que no se detecta ninguna proteína en el eluato. Eluye la proteína con 1 mL de Buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 200 mM imidazol) durante 5 veces. Guarda todas las fracciones. Revisa si hay proteína eluída con un ensayo rápido de Bradford.
3. Combina las fracciones de proteínas purificadas y realiza el intercambio de tampón en el tampón de almacenamiento (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Alicuelta las proteínas concentradas en 50 μL en cada tubo, congela rápidamente y almacena a -80 °C para el siguiente análisis.

5. Caracterización bioquímica de la proteína lactilada

1. SDS-PAGE y Western Blotting
   1. Separa la proteína por SDS-PAGE (90 V durante 20 minutos, luego 150 V durante 50 minutos). Tiñe el gel con Coomassie Blue, calienta durante 15 s en un microondas y detén con solución detinente (40% etanol absoluto, 10% ácido acético glacial y 50% agua desionizada) en un shaker (50 rpm, 15 min). Repite el paso de destinción hasta que las bandas proteicas sean claramente visibles.
   2. Activa una membrana PVDF en metanol durante 1 minuto. Monta la pila de transferencia en el orden: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro, esponja. Realiza la transferencia a 250 mA durante 1 hora en un tampón preenfriado. Bloquea la membrana con leche desnatada al 5% durante 1,5 horas y luego lava 3 veces con TBST (10 min cada una).
   3. Incubar con anticuerpos primarios (Anti-His 1:10.000; Anti-L-Lactil Lisina 1:1.000) a 4 °C durante la noche. Lava 3 veces con TBST.
      NOTA: Las proporciones óptimas de dilución deben determinarse empíricamente para los anticuerpos obtenidos de diferentes fuentes comerciales.
   4. Incubar con anticuerpo secundario de conejo (1:10.000) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Lava 3 veces con TBST. Imagen usando quimioluminiscencia y datos guardados en Image Lab.
2. Análisis de espectrometría de masas
   1. Para un análisis de masas intactas, se diluyen las proteínas hasta una concentración final de 0,1 μg/μL con agua que contenga 0,1% de ácido fórmico (FA) y luego se someten a un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC). La fase móvil consistía en disolvente A (0,1% de FA en agua) y disolvente B (acetonitrilo, ACN) a un caudal de 0,3 mL/min.
   2. Mide los pesos moleculares de hENO1-89Klac usando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupola (Q-TOF) de alta resolución con el rango m/z ajustado a 300-2000. Recopila y procesa todos los datos utilizando el software MassLynx.
   3. Para el análisis proteómico, se analizan los lisados celulares digeridos como se describió anteriormente, utilizando un sistema de cromatografía líquida de nanoflujo acoplado a un espectrómetro de masas tribrido de alta resolución equipado con un analizador. La fase móvil consistía en el disolvente A (0,1% de FA en agua) y disolvente B (ACN/agua, 8:2, v/v) a un caudal de 300 nL/min.
   4. Separar péptidos en una columna capilar C18 de fase inversa (75 μm x 250 mm) con un gradiente de 90 minutos: 3%-8% B (0-5 min), 8%-28% B (5-60 min), 28%-38% B (60-75 min), 38%-100% B (75-80 min) y 100% B (80-90 min). Adquiere espectros MS1 sobre m/z 350-1800 con una resolución de 120.000 y un objetivo AGC de 4e5. Generar espectros MS2 mediante fragmentación de disociación colisional (HCD) de mayor energía (energía de colisión = 32%), con una primera masa de m/z 110, una resolución de 30.000 y un objetivo AGC de 5e4.
3. Análisis de citometría de flujo
   1. Lava las pilas dos veces con un buffer PBS preenfriado, seguido de centrifugación a 1.380 x g durante 3 minutos después de cada lavado. Resuspende el pellet celular obtenido tras centrifugación en 500 μL de tampón PBS y pipetea suavemente para mezclar. Filtrar la suspensión celular a través de una gasa estéril de 300 mallas, recoger el filtrado en un tubo de citometría de flujo para minimizar la interferencia de los agregados celulares durante la detección. Analizar la muestra preparada utilizando un citómetro de flujo con láseres duales, con excitación a 405 nm y detección a 488 nm para las señales de fluorescencia correspondientes.

Resultados

Primero evaluamos la especificidad de incorporación de Klac en proteínas de E. coli. El gen de la enolasa humana 1 (hENO1) fue diseñado para contener un codón oclusivo ámbar en el residuo K89 (hENO1-89TAG), y este constructo se coexpresó con el KlacRS ortogonal y su par de ARNt afines en E. coli. En ausencia de suplementación de 1 mM de Klac, no se detectó hENO1 de longitud completa; en cambio, cuando se añadió 1 mM Klac al medio de crecimiento, se produjo hENO1 de longitud completa que contení...

Discusión

Aquí describimos una estrategia para la incorporación específica de Klac en proteínas tanto en células procariotas como eucariotas. Al introducir un codón oclusivo ámbar en la posición deseada del gen objetivo y coexpresarlo con el par ortogonal KlacRS/ARNt en las células huésped, la auténtica lisina lactil puede incorporarse con precisión en proteínas de células vivas, proporcionando una herramienta poderosa para investigar la biología específica de la lactilación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
6*his,Su etiqueta Anticuerpo monoclonal recombinante	Proteintech	84814-1-RR	Una clase de inmunoglobulinas específicas dirigidas a las 6 y veces; Su etiqueta (un péptido corto compuesto por seis residuos consecutivos de istidína, HHHHHH) en proteínas recombinantes.
Sistema UPLC ACQUITY	Aguas		Cromatografía líquida UltraPerformance
Anti-L-Lactilsilisina mAb del conejo	PTM Biolabs	PTM-1401RM	Una clase de inmunoglobulinas específicas dirigidas a la L-Lactil Lisina (Klac), una modificación post-traduccional (PTM) de proteínas.
Kit de clonación de un solo paso ClonExpress II	Vazyme	C112	Basándose en una tecnología simple, rápida y eficiente de clonación sin interrupciones de ADN, los fragmentos insertados pueden clonarse direccionalmente en cualquier sitio de cualquier vector.
Citómetro de flujo CytoFlex	Beckmann Coulter		Citómetro de flujo con detección de alta sensibilidad y capacidad de análisis multicolor
DH10B	Biorabbit	EC005H-S	Un tipo de células competentes para la transformación de plásmidos, la clonación génica y el cribado azul-blanco.
DH5 y alfa;	Vazyme	C502	Un tipo de células competentes para la transformación de plásmidos, la clonación génica y el cribado azul-blanco.
Sistema EASY-nano LC 1200	Thermo Fisher Scientific		Cromatografía nanolíquida para separar muestras complejas de alta sensibilidad y alta resolución
Espectrómetro de masas Orbitrap Eclipse Tribrid	Thermo Fisher Scientific		un sistema insignia de alta gama para cromatografía-espectrometría de masas (LC-MS) de tribridos
Polimerasa de ADN Superfidelidad Phanta Max	Vazyme	P505	Una enzima única de alta fidelidad que combina amplificación rápida y fidelidad
PolyJet	SignaGen	SL100688	El reactivo de transfección in vitro de ADN de PolyJet está formulado para ser un potente reactivo de transfección que garantiza una transfección eficaz y reproducible con menor citotoxicidad.