Este protocolo experimental demuestra un modelo de rata con canulación de conducto linfático cervical profundo que permite una evaluación directa y cuantitativa del drenaje linfático desde la región de la cabeza. El modelo facilita un análisis detallado de solutos derivados del sistema nervioso central (SNC), poblaciones de células inmunitarias y la distribución y eliminación de terapias dirigidas al SNC.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Modelo de rata canulada por conducto linfático cervical para evaluar el transporte linfático desde la cabeza y el cerebro
En este artículo
Resumen
Resumen
La linfa fluye desde el sistema nervioso central (SNC) a través de una serie de vasos linfáticos (VI) y ganglios linfáticos que convergen en los conductos linfáticos cervicales. Además de mantener el equilibrio de líquidos, estos conductos linfáticos desempeñan un papel clave en el transporte de una amplia variedad de sustancias, incluyendo metabolitos endógenos, moléculas de señalización, células inmunitarias y fármacos pequeños y macromoleculares. Esto es fundamental para la homeostasis fisiológica y la función inmunitaria tanto en las regiones intracraneales (por ejemplo, el cerebro) como extracraneales (por ejemplo, las cavidades nasal y oral). El deterioro del drenaje linfático del cerebro se ha relacionado cada vez más con una serie de trastornos neurológicos y neurodegenerativos. La canulación del conducto linfático cervical permite la recogida de linfa drenando la cabeza y el cerebro, lo que permite medir la concentración y la tasa de transporte de diversas sustancias a través del sistema linfático. También se pueden determinar cambios en estos factores en respuesta a diferentes desafíos (por ejemplo, drogas, estrés, traumatismos) y enfermedades (por ejemplo, ictus, infección, enfermedad de Alzheimer). Aquí describimos un modelo de rata anestesiado, con canulación profunda del conducto linfático cervical que permite la recogida de linfa durante varias horas tras la cirugía. El método puede combinarse con tecnologías de imagen y multiómicas para medir una amplia gama de parámetros de interés en la linfa. Esto facilita la investigación fisiológica y fisiopatológica fundamental de la región de la cabeza y el cuello, así como estudios farmacocinéticos/farmacodinámicos de fármacos, especialmente para el tratamiento de enfermedades del SNC.
Introducción
El sistema linfático, que está distribuido por todo el cuerpo, es esencial para mantener la homeostasis de los líquidos, regular las respuestas inmunitarias y facilitar el transporte de nutrientes y moléculas deseñalización 1. Los linfáticos periféricos comienzan en los capilares linfáticos, que recogen líquido intersticial y solutos y drenan hacia vasos linfáticos colectores (VE) más grandes que poseen una capa muscular lisa circundante; estos vasos luego entregan linfa a los ganglios locales para su procesamientoinmunitario 2,3. La red linfática que drena la región de la cabeza es importante para la homeostasis tanto de los órganos intracraneales (por ejemplo, el cerebro) como extracraneales (por ejemplo, las cavidades nasal y oral). Se cree que la estructura y organización de la red linfática extracraneal se asemejan a las de los linfáticos periféricos de todo el cuerpo, mientras que el sistema linfático intracraneal presenta características anatómicas y funcionales únicas (véase la Figura 1 para una representación esquemática detallada en modelos de ratas)4,5. Aunque los VE típicos están ausentes en el parénquima cerebral, las funciones similares a las linfáticas están mediadas por el sistema especializado de transporte linfático dependiente de glia (glymphático) que facilita el intercambio entre el líquido cefalorraquídeo (LCR) y el líquido intersticial (ISF)6. Mientras que el sistema glymphático permite la mezcla de ISF dentro del parénquima cerebral con el LCR, los VE meníngeo, perivascular y nasofaríngeo transportan los solutos del LCR lejos de la cavidad craneal. Específicamente, la vía linfática meníngea dirige el LCR desde el espacio subaracnoideo hacia las vías venáquicas meníngeas, vinculando la dinámica del líquido intracraneal con la aclaración linfáticaperiférica 7. Paralelamente, las vías perineurales permiten el flujo de LCR y solutos asociados a lo largo de vainas craneales y espinales nerviosas, especialmente a través de los nervios olfativos hacia el plexo linfáticonasofaríngeo 5,8. El trabajo simultáneo de estos sistemas mantiene la homeostasis fluida dentro del cerebro 6,7,8. Los avances recientes en la comprensión del sistema linfático que drena el SNC han aportado nuevas perspectivas sobre la fisiología cerebral y la fisiopatología. Estos hallazgos pueden ofrecer nuevas vías para la intervención terapéutica en las enfermedades delSNC 9.
Figura 1: Representación esquemática de las vías de eliminación linfática del SNC. Estas vías consisten en (A) la vía glifática a través de espacios perivasculares; (B) la vía linfática nasofaríngea y (C) las vías venálgicas meníngeas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Las redes linfáticas que drenan desde la cabeza y el SNC convergen hacia los conductos linfáticos cervicales situados en el cuello, donde la linfa se filtra a través de los ganglios cervicales antes de entrar en la circulación sistémica. Los ganglios linfáticos cervicales se clasifican en ganglios linfáticos superficiales (SLN) y profundos (dCLNs) según su ubicación anatómica dentro del cuello. Se cree que las alteraciones en la composición del líquido linfático dentro de los conductos linfáticos cervicales reflejan variaciones fisiopatológicas subyacentes en el cerebro, siendo la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP), la lesión cerebral traumática (LCT) y el deterioro cognitivo postictus (PSCI) ejemplosrepresentativos 9,10,11,12,13 . Cabe destacar que, en la EA, el drenaje deficiente de las proteínas amiloide-β (Aβ) y tau fosforiladas (P-tau) a través de estas vías linfáticas se ha implicado como un factor que contribuye a la progresión dela enfermedad 9,10,14. Al conectar directamente los conductos linfáticos con las venas adyacentes para redirigir el drenaje linfático, se está investigando la anastomosis venosa linfática (LVA) tanto en animales como en humanos como estrategia terapéutica para potenciar la salida linfática del SNC, facilitando así la eliminación de Aβ en el cerebro y retrasando potencialmente la progresión de la AD 6,15,16. La importancia de esta vía se ilustra aún más con observaciones en ratones sometidos a extirpación quirúrgica de los ganglios linfáticos cervicales (linfadenectomía), lo que resultó en una reducción de la depresión linfática cervical. La depuración deficiente conduce a una acumulación tóxica de Aβ y P-tau, con posterior activación de las vías patológicas de señalización quinasa. Estos cambios se asocian con un empeoramiento progresivo de la tauopatía similar a la EA y un mayor riesgo de comportamientos similares a la ansiedad y la depresión14,16. Además, estudios basados en LCR sugieren que los tumores del SNC, como los linfomas cerebrales, pueden obstruir físicamente la aclaración linfática a través de los conductos linfáticos profundos del cuello cervical mientras que al mismo tiempo elevan las concentraciones de oncoproteínas en elLCR 9,17,18. La evidencia de estudios basados en inflamación del SNC indica además que las células originadas en las meninges pueden migrar a través de los VE meníngeos a los ganglios linfáticoscervicales 8,19. Estas células están formadas principalmente por linfocitos, con poblaciones más pequeñas de células dendríticas, macrófagos y célulasendoteliales 19,20. Durante la inflamación o tras una lesión o cirugía del SNC, el tráfico celular inmunitario linfático se ve evidentemente potenciado, acompañado de niveles elevados de biomarcadores inmunitarios como citocinas, quimiocinas y otros mediadoresinflamatorios 21.
Además de sus funciones pato-fisiológicas, la red linfática cervical es cada vez más reconocida como un conducto importante para la disposición de fármacos. Estudios previos en animales han demostrado que varias formulaciones de fármacos diseñadas para la administración del SNC pueden sufrir eliminación del cerebro a través de los conductos linfáticos cervicales y los ganglios linfáticos (en mayor o menor medida), ejemplificados por agentes administrados intracerebralmente basados en nanopartículas (por ejemplo, lamotrigina, talazoparib) y biológicos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, proteínas trazadoras radiomarcadas)22,23,24,25 . En humanos, los estudios de imágenes por resonancia magnética han demostrado que ciertas moléculas, como el gadoburol, sufren transporte activo desde el sistema glymphático hasta los conductos linfáticoscervicales 26.
Como se ha mencionado antes, los ganglios linfáticos cervicales, tanto los sCLN como los dCLNs, drenan la linfa desde regiones distintas de la cabeza; sin embargo, las regiones craneales específicas drenadas por cada nódulo siguen siendoinciertas. 27,28. Las áreas de drenaje superpuestas, la variabilidad anatómica interindividual y las posibles diferencias estructurales entre especies complican aún más la descripción de los patrones de drenaje linfático cervical tanto en animales comoen humanos 29. Dentro de la compleja red linfática cervical, se han identificado los conductos linfáticos cervicales profundos como las principales vías de salida del LCR, situadas aguas abajo de las ventriculasnasofaríngeas y meníngeas 8. En comparación con los conductos linfáticos cervicales superficiales, que forman redes finas y variables en el tejido subcutáneo y difieren mucho en tamaño y ramificación entre ratas individuales, el conducto linfático cervical profundo ofrece una vía más accesible y práctica para la recogida de linfa derivada del SNC en modelos animalespequeños 20,30. Por tanto, el protocolo actual se centra en establecer un método fiable para recoger linfa del conducto linfático cervical profundo.
Solo un número limitado de estudios realizados en la última década ha descrito la recogida de fluidos linfáticos cervicales para estudiar enfermedades del SNC o analizar la distribución de fármacos. Un estudio previo describió la medición de concentraciones de fármacos en la linfa cervical mediante el enjuaguamiento o la extracción de líquido de secciones aisladas de tejido (como las adyacentes a un solo dCLN)31. Sin embargo, los protocolos experimentales para la recogida continua de linfa de los conductos cervicales en pequeños animales de laboratorio, especialmente ratas, siguen poco desarrollados. Este protocolo establece un método fácilmente accesible y reproducible para canular el conducto linfático cervical (de rata) que permita la recogida continua de la linfa y para investigar el transporte linfático del SNC, las respuestas inmunitarias y la farmacocinética. Su principal ventaja radica en la capacidad de cuantificar el flujo y la composición linfática en intervalos de tiempo definidos, lo que permite la medición cuantitativa de fármacos, lípidos, ácidos grasos y constituyentes celulares. En particular, este modelo captura procesos de transporte linfático que no están adecuadamente representados por técnicas de muestreo o imagen de plasma/LCR, ofreciendo nuevas perspectivas sobre la disposición de fármacos en el SNC, el transporte de lípidos y nutrientes, y la señalizacióninmunitaria 20.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El(los) procedimiento(s) descritos en este protocolo fueron aprobados por el comité de ética animal de la universidad y se realizaron conforme a las directrices éticas experimentales de la Universidad Farmacéutica de China. Antes de iniciar cualquier procedimiento relacionado con animales, obtenga las aprobaciones necesarias del comité de ética institucional u organizacional correspondiente. Se utilizan ratas machos Sprague-Dawley (SD) que pesan entre 220 y 250 g como animales experimentales. Los animales se obtienen de proveedores autorizados de animales experimentales (véase la Tabla de Materiales) y se alojan en jaulas dedicadas con acceso libre a comida y agua hasta el inicio del experimento. En este protocolo, la canulación del conducto linfático cervical profundo izquierdo se describe como un ejemplo representativo. Actualmente, hay poca evidencia que describa diferencias anatómicas entre los conductos linfáticos cervicales profundos izquierdo y derecho. Según observaciones de experimentos previamente realizados, no se han observado diferencias significativas entre ambos lados, incluyendo en las tasas de flujo linfático.
1. Precauciones y procedimientos de seguridad
- Realizar todos los procedimientos conforme a las directrices institucionales de bioseguridad, y todo el personal debe recibir formación adecuada en técnicas microquirúrgicas, manejo experimental de animales y seguridad química antes de llevar a cabo este protocolo.
- Lleva el equipo de protección individual (EPP) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes quirúrgicos y gafas protectoras, durante todo el procedimiento. Como se utiliza un anestésico volátil (isoflurano) que puede causar depresión del sistema nervioso central y toxicidad cardiovascular en humanos tras una exposición prolongada, realiza el procedimiento en un entorno bien ventilado. No se debe traer comida ni bebida al laboratorio, y asegurarse de que el agua corriente esté fácilmente accesible en todo momento.
- Manipular todos los objetos punzantes, incluidas las agujas de jeringuillas, cuchillas de afeitar y microtijeras, con cuidado y desecharlos inmediatamente después de usarlos en recipientes designados para objetos punzantes; bajo ninguna circunstancia se deben reutilizar objetos punzantes desechables.
- Trata todas las muestras biológicas (por ejemplo, linfa recogida) y los fluidos corporales animales (por ejemplo, sangre) como potencialmente peligrosos, y maneja todo el equipo de recogida con cuidado, manteniendo las muestras alejadas de la zona quirúrgica. En caso de una lesión accidental por punzada o contacto cutáneo con sustancias peligrosas, lave inmediatamente la zona afectada con agua y jabón e informe del incidente conforme a los protocolos de seguridad institucionales.
2. Preparación el día antes de la cirugía
- Ayuno o alimenta a las ratas según los requisitos del experimento específico. Este protocolo no exige un estado específico de ayuno o alimentación alimentada.
- Prepara una solución anticoagulante diluyendo heparina o ácido etilendidiaminático tetraacético (EDTA) hasta una concentración final de 10 UI/mL. Precarga esta mezcla (aproximadamente 0,7 mL) en una jeringuilla estéril de insulina de 1 mL equipada con una aguja de 30 G, para pre-cubrir la superficie interna de la cánula de polietileno (PE) (utilizada para la canulación de los conductos linfáticos). Guarda esta mezcla preparada en condiciones estériles hasta su uso.
- Preparar cánulas para la recogida de muestras de linfa montando una cánula de PE en configuración cabeza-cola, utilizando tubos de 0,5 mm de diámetro exterior (DI), 0,3 mm de diámetro interior (DI) para ambas secciones terminales y tubos de 0,6 mm de diámetro interior y 0,5 mm de diámetro interior para la sección media.
- Cortar los segmentos de la cánula a longitudes de 2 cm para la porción proximal que conecta con la aguja de la jeringuilla, 40 cm para la sección media y 8 cm para la parte distal destinada a la canulación.
- Cortar y bisear el extremo distal del conjunto de la cánula en un ángulo de aproximadamente 45° para facilitar una inserción suave en el conducto linfático cervical. Consulte la Figura 2 para una ilustración detallada del conjunto de la cánula.
NOTA: Este bisel facilita una inserción suave en el conducto linfático y reduce el riesgo de obstrucción al aumentar la superficie efectiva de la sección transversal. Tras una canulación exitosa, la sección proximal (2 cm) se desconecta y la linfa se recoge directamente del extremo proximal expuesto de la sección media (como se describe en detalle en los pasos 4.9 y 4.10).
Figura 2: Diagrama esquemático del conjunto de la cánula (no a escala). El diagrama ilustra las dimensiones de cada componente del tubo de PE ensamblado utilizado para construir la cánula. De izquierda a derecha, la cánula ensamblada será denominada en adelante extremo proximal, sección central y extremo distal, respectivamente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
- Prepara el sistema de inhalación de anestesia precargando isoflurano líquido en el recipiente presurizado equipado con vaporizador. Antes de su uso, realiza una prueba (cebado) del vaporizador para confirmar la hermeticidad y asegurar un flujo de gas estable y constante.
- Si es necesario, prepare al candidato a fármaco de prueba en un vehículo adecuado. Realizar estudios de estabilidad para confirmar la integridad de la formulación durante el almacenamiento y durante todo el periodo de administración. Incluye agentes adicionales (por ejemplo, tintes biológicos como Evans Blue) cuando corresponda.
- Prepara los recipientes para la recogida de linfa pre-pesando tubos estériles de microcentrífuga y registrando sus pesos iniciales. Etiqueta cada tubo secuencialmente según los puntos de tiempo de recogida previstos (por ejemplo, intervalos horarios). Añadir heparina concentrada (o EDTA) a cada tubo y eliminar el disolvente mediante evaporación por inyección de nitrógeno, dejando entre 2 y 5 UI de heparina seca (o EDTA) por tubo para evitar una dilución desigual de la linfa acumulada.
3. Preparativos inmediatos antes de la cirugía
- Verifica la patencia de cada cánula enjuagando con la solución anticoagulante preparada. Conecta una jeringuilla al extremo proximal de la cánula ensamblada y libera suavemente un pequeño volumen de solución. Asegúrate de que la solución salga suavemente por el extremo distal sin indicios de fugas. Si se detecta fuga, como suele indicar la fuga de fluido en el(los) punto(s) de conexión, descarta todo el conjunto de cánula y reconstruye uno nuevo según el Paso 2.3.
NOTA: Este paso simultáneamente recubre previamente la superficie interna de la cánula con anticoagulante (este paso también puede realizarse el día antes de la cirugía, de modo que la cánula se recubre durante la noche). - Comienza a administrar isoflurano inhalado a través de una mascarilla de cono nasal aproximadamente 5 minutos antes de comenzar la cirugía. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento a una tasa de parto de 0,4 a 0,6 L/min bajo una presión de 101,3 kPa a 20 °C. Asegúrate de la profundidad de la anestesia evaluando la respuesta al pellizco del dedo del pie.
- Monitoriza continuamente la profundidad de la anestesia. Eutanasia inmediatamente a la rata si se observan signos de angustia o inestabilidad fisiológica.
- Coloca a la rata boca abajo sobre una compresa quirúrgica calentada mantenida a 37 °C. Inclina la cabeza y extiende el cuello, usando un pequeño soporte (almohada) si es necesario, para maximizar la exposición de la región cervical. Asegura la cabeza dentro de la mascarilla anestésica para asegurar la administración continua de isoflurano y sujeta suavemente las extremidades anteriores usando gomas elásticas o cintas quirúrgicas para minimizar el movimiento durante el procedimiento.
- Enjuaga el pelaje de la región cervical con solución fisiológica normal estéril para facilitar el afeitado. Afeita a fondo todo el sitio quirúrgico (usando una cuchilla de afeitar de doble filo), normalmente la zona del cuello y la clavícula, para asegurar la eliminación completa del pelo antes de la incisión (véase la Figura 3A para un ejemplo de la zona del cuello afeitado).
- Limpia toda la zona afeitada con desinfectantes, como un agente que contenga yodo.
- Marque el lugar quirúrgico dibujando una línea punteada de 2,5 cm para confirmar la longitud de la incisión inicial. Coloca la línea ligeramente a la derecha de la línea media del cuerpo de la rata. Coloque el extremo superior de la incisión aproximadamente entre 1 y 1,5 cm por debajo del labio inferior (consulte la Figura 3B para un ejemplo del lugar de la incisión, con las medidas facilitadas por una regla).
Figura 3: Preparación del lugar quirúrgico. (A) La región del cuello se afeita en preparación para la incisión; (B) longitud aproximada y ubicación de la incisión, indicadas por la línea de puntos de 2,5 cm. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
4. Anulación del conducto linfático cervical
- Coloca la rata con la cabeza apuntando hacia el operador. Utiliza un microscopio para este paso debido al diámetro relativamente pequeño del conducto linfático cervical.
- Utilizando un bisturí estéril, incide cuidadosamente la capa superficial de la musculatura cervical a lo largo de la marca mencionada de 2,5 cm de longitud, orientada casi paralela a la línea media (véase la Figura 4A para la capa superficial de piel abierta).
- Se separan suavemente las capas musculares restantes, principalmente la fascia cervical superficial, para exponer la arteria cervical, que normalmente se distingue por su coloración roja.
- Retrae el músculo esternomastoideo y la glándula submandibular e inclínalos cuidadosamente alejándolos del campo quirúrgico para facilitar la identificación del conducto linfático cervical. Emplea un expansor tisular para mantener la ventana quirúrgica y utiliza un hisopo de algodón para mantener temporalmente el tejido muscular a un lado mientras localizas el ganglio linfático y el conducto linfático asociado. Asegúrese de que el expansor tisular esté en su lugar durante todo el proceso de canulación (consulte la Figura 4B para la ventana quirúrgica abierta con el expansor de tejido en su lugar).
- Localizar el conducto linfático cervical (preferiblemente bajo microscopio): El conducto aparece como un vaso opaco e incoloro de aproximadamente 0,2 a 0,5 mm de diámetro y discurre inmediatamente paralelo a la arteria carótida. A menudo se pueden observar uno o más dCLN adyacentes de color carne a lo largo del curso del conducto linfático cervical (véase la Figura 4C para una vista microscópica del conducto linfático cervical profundo expuesto y un dCLN adyacente).
NOTA: Los conductos linfáticos cervicales suelen tener un color muy similar al de los tejidos circundantes, y su identificación suele requerir una inspección cuidadosa, especialmente en ratas con más tejido graso. Para fines quirúrgicos (pero no para estudios sobre el transporte linfático de fármacos o sustancias endógenas), Evans Blue puede inyectarse subcutáneamente bajo el cuello al inicio de la cirugía para que el conducto linfático cervical pueda visualizarse mejor cuando el contraste drena a través de los linfáticos. - Utilizando un par de pinzas romas, pasa suavemente por los tejidos conectivos separados y mantén las pinzas en posición para asegurar que el conducto linfático cervical sea claramente visible dentro del campo quirúrgico.
- Aislar cuidadosamente el conducto linfático cervical de los tejidos conectivos y adiposos circundantes mediante una disección roma, teniendo especial cuidado para evitar daños, ya que el vaso es extremadamente frágil.
- Usa unas microtijeras para hacer una pequeña incisión en la mitad superior del conducto expuesto. No desconectes completamente el conducto; las dos mitades deben permanecer intactas.
- Comprueba y asegúrate de que la cánula preparada previamente recubierta con solución anticoagulante (como se describe en el Paso 2.3) esté libre de burbujas de aire realizando un suave lavado de aire. Inmediatamente antes de la inserción, sujeta cuidadosamente el extremo distal de la cánula con pinzas, orientándola de modo que la cara biselada quede orientada hacia arriba. Luego, avanza suavemente la cánula aproximadamente 2 mm hacia el conducto a través de la incisión, dirigiéndola hacia la cabeza (véase la Figura 4D para una ilustración de la canulación exitosa). La profundidad real de inserción puede variar según la rata individual.
NOTA: Dado que la inserción de la cánula es relativamente superficial en este procedimiento, un punto de fijación adicional en el área circundante puede ser útil. Esto se consigue creando una pequeña punción secundaria cutánea (agujero) aproximadamente a 1,5 cm de la ventana quirúrgica usando tijeras. Esta abertura se estabilizará aún más en pasos posteriores (por ejemplo, con sutura o adhesivo). La Figura 4E demuestra este paso en el contexto del uso de adhesivo de tejido. La cánula debe pasarse por el agujero para ayudar a asegurar su posición. - Desprende la jeringuilla de insulina junto con el segmento proximal corto (2 cm) de la cánula del resto del conjunto de la cánula. La linfa puede recogerse directamente desde el extremo proximal expuesto del segmento medio, de mayor diámetro. Monitoriza la punta distal de este segmento de recogida durante 1–2 minutos. Confirmar la canulación exitosa mediante una salida visible, lenta y constante de líquido linfático desde el conducto canulado.
- Una vez verificada que la canulación ha sido exitosa, asegura la cánula aplicando una pequeña gota de adhesivo de tejido cianoacrilato con una pipeta tanto en el lugar de la incisión del conducto linfático como en el orificio secundario de fijación (véase la Figura 4E para una demostración de la fijación de la cánula). Ten especial cuidado para evitar obstruir el vaso o afectar el flujo linfático.
- Observa el flujo linfático durante varios minutos para confirmar una salida constante (normalmente se forma una gota visible al final de la cánula en menos de un minuto). Una vez verificado, retirar cuidadosamente el expansor tisular de la ventana quirúrgica y recolocar la glándula submandibular en su ubicación original.
- Colocar un tubo microcentrífuga premarcado recubierto de anticoagulante (véase el Paso 2.6) al extremo distal de la cánula para recoger la linfa de flujo libre.
Figura 4: Anulación del conducto linfático cervical. (A) Sitio de la incisión en la región del cuello; (B) ventana quirúrgica abierta con un expansor tisular en su lugar y la glándula submandibular retraída hacia la derecha; (C) conducto linfático cervical y un dCLN visualizados bajo un microscopio. (D) Canulación exitosa, indicada por la línea de puntos verde (vista microscópica). (E) Se aplicó adhesivo tisular en el lugar de la incisión y se realizó una punción secundaria cutánea usando una pipeta. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
5. Periodo postquirúrgico y administración de fármacos
- Al finalizar la canulación del conducto linfático cervical, reposicionar todas las capas musculares a sus ubicaciones originales. Posteriormente, cierra la incisión cutánea con suturas y/o adhesivo de tejido; Normalmente, una incisión de 2,5 cm de largo puede cerrarse correctamente con 8 puntos (véase la Figura 5A para una ventana quirúrgica cerrada con sutura). Retira la(s) goma elástica(s) o las cintas quirúrgicas que se colocan en las extremidades anteriores al completar este paso.
- Administrar fármacos en el LCR mediante una vía adecuada, como intracisterna magna (ICM), intra-cerebroventricular (ICV) o inyección intratecal lumbar (LIT). Usando la administración de ICM como ejemplo, identifica el lugar de inyección en la cisterna magna, situada en la base del cráneo y visible como la única depresión blanda en la superficie dorsal. Afeitar el pelaje circundante según sea necesario para facilitar la visualización (véase la Figura 5B para un área marcada adecuada para la inyección de ICM).
NOTA: Para mantener la presión intracraneal (ICP) durante la inyección de ICM, a menudo se retira un volumen equivalente de LCR antes de la administración del medicamento. Se recomienda usar una jeringuilla nueva y ya llena para la inyección. Doblar la aguja de la jeringuilla puede facilitar la administración (véase la Figura 5C para una demostración de la inyección ICM usando una aguja doblada de la jeringuilla). - Mantén a la rata boca acostada sobre la almohadilla quirúrgica calentada (mantenida a 37 °C) para preservar la temperatura corporal tras la inyección y durante todo el periodo de recogida de la muestra.
Figura 5: Manejo postoperatorio. (A) Sitio de la incisión cerrado usando sutura de seda. (B) Ubicación aproximada de cisterna magna con el pelaje circundante rapado. (C) Administración de un candidato a fármaco mediante ICM usando una jeringuilla de insulina con una aguja doblada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
6. Recogida de muestras de linfa y análisis
- Recoger linfa continuamente en tubos microcentrífugas recubiertos de anticoagulantes, reemplazando los tubos a intervalos predeterminados (normalmente cada hora). Guarda las muestras recogidas con bolsas de hielo usando una nevera. Consulte la Figura 6 para una muestra de linfa cervical recogida en un tubo de microcentrífuga.
- Al finalizar el proceso de recogida de linfa, se sacrifica a la rata de forma humana según los protocolos adecuados.
- Determinar la tasa de flujo linfático midiendo el volumen de linfa recogido durante cada intervalo planificado (cada hora).
- Mide las concentraciones de fármacos (o sustancias de interés) en la linfa utilizando métodos analíticos apropiados, incluyendo HPLC, HPLC-MS o kits de ensayo comercialmente disponibles, para caracterizar su cinética de eliminación del SNC a través del sistema linfático.
- Calcula el transporte de masa de fármacos linfáticos multiplicando las concentraciones medidas del fármaco por los volúmenes linfáticos correspondientes.
Figura 6: Recogida de muestra de linfa. Fotografía de una muestra recogida (aprox. 100 μL) en un tubo de microcentrífuga. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
7. Manipulación y eliminación de residuos tras el procedimiento
- Almacene temporalmente en recipientes designados para residuos médicos dentro de un área de almacenamiento frigorífico dedicada (por ejemplo, un frigorífico) hasta que sean recogidos y eliminados por un equipo profesional de procesamiento de residuos médicos.
- Recoge todos los objetos punzantes desechados en un contenedor designado para objetos punzantes, separado de todos los demás residuos.
- Desechar todos los demás objetos no punzantes utilizados en el experimento (por ejemplo, hisopos de algodón, gomas elásticas, cánulas de PE) en bolsas de residuos médicos, y no desecharlo junto con residuos domésticos o generales. Asegúrate de que no se coloquen objetos punzantes en esta bolsa.
- Limpia y desinfecta todas las herramientas reutilizables restantes conforme a los protocolos de laboratorio.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Se obtuvo un conjunto de datos representativo de tasas de flujo linfático horario (mL/h) utilizando el modelo de canulación linfática cervical (véase la Figura 7 para la tabla correspondiente). En este experimento con tres (n = 3) ratas de estudio, la linfa se recogió continuamente en tubos microcentrífugas, que se reemplazaron cada hora durante un periodo de 6 horas.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo establece un método reproducible para la canulación del conducto linfático cervical en ratas, permitiendo la acumulación continua de linfa durante períodos prolongados. Con una formación microquirúrgica adecuada, el procedimiento puede realizarse de forma eficiente y proporciona muestras linfáticas consistentes bajo condiciones fisiológicas estables, mantenidas por anestesia continua, lo que lo hace adecuado para uso experimental rutinario. Una vez dominado, el procedimien...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores afirman que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran influir en el trabajo reportado en este artículo.
Agradecimientos
Los autores agradecen sinceramente al Sr. Zhenglin Hao y a la Sra. Jie Zhao del Centro Experimental Animal de la Universidad Farmacéutica de China por su apoyo en la realización de experimentos con animales.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aguja calibre 30 | Salud Yushou | Utilizado para conectar el extremo proximal de la cánula (0503) con la jeringuilla de heparina | |
| Dispensador de anestesia con vaporizador | Compañía de Instrumentos YYUN | ||
| Pinzas romas | Ciencias de la Vida RWD | F22002-10 | |
| Hisopos de algodón | Biotecnología Qingdao Shultz | MQ-02 | Se usa para mantener el tejido muscular temporalmente en su sitio |
| Almohadilla quirúrgica calefactada | Shanghai Yiheng Instruments | Dimensión 15 y horarios; 20 cm | |
| Heparina sódica | Tecnología Bioquímica de Shanghái Aladdín | H123383 | Dilución requerida antes de su uso |
| Jeringuilla de insulina (1 mL) | Salud Yushou | U100-1ML | Usado solo para el prerecubrimiento de heparina |
| Solución de isoflurano para inhalación | Ciencias de la Vida RWD | R510-22-10 | Usado para anestesia mediante vaporizador |
| Plumas marcadoras | Cualquier marca | N/A | |
| Tubo microcentrífuga (1,5 mL) | Equipamiento experimental Nantong Hairui | HR10003 | Utilizado para la recogida de linfa |
| Microtijeras | Ciencias de la Vida RWD | GD234BA0007925 | |
| Sutura quirúrgica de nailon | Shanghai Yiheng Instruments | 4-0 35CM | |
| Pipeta (ajustable en volumen, rango de medición de 5 a 50 y mu; L) | Dragon Laboratory Instruments Limited | 7030301006 | Usado solo para medir adhesivo de tejido |
| Puntas de pipeta | Biosharp Ciencias de la Vida | BS-10-T | Se usa solo para transferir adhesivo de tejido, sin volumen específico requerido |
| Cánula de polieileno (PE) 0,5 mm de diámetro exterior, 0,3 mm diámetro interior (0503) | AniLab Instrumentos Científicos (Ningbo) | PE-0503 | |
| Cánula de polieileno (PE) 0,6 mm de diámetro exterior, 0,5 mm de diámetro interno (0605) | AniLab Instrumentos Científicos (Ningbo) | PE-0605 | |
| Cuchillas de afeitar | Gillette Shanghai | Q31/0115000301C004 | Se usa solo para afeitar pieles |
| Liga elástica | Cualquier marca | N/A | Usado para sujetar las extremidades delanteras de ratas |
| Gobernante | Cualquier marca | N/A | |
| Hojas scapel (#23) | Ciencias de la Vida RWD | S31010-01 | |
| Solución de cloruro de sodio (0,9%) para infusión | Shijiazhuang Nº 4 Farmacéutico | H20066533 (número de aprobación) | Usado solo para enjuaguar piel |
| Ratas Sprague-Dawley | Tecnología de Animales de Laboratorio del Río Pekín Vital | 101 | Peso de 220 a 250 gramos, sin requisito de edad |
| Luz quirúrgica | Pekín Heo Bio-Tech | XHA011-1 | |
| Microscopio quirúrgico | Tecnología Optoelectrónica de Cewei de Shanghái | SMZ755T | Microscopio disecable sin escenario mecánico, puede equiparse con un soporte retráctil |
| Adhesivo de tejido | Vetbond de 3 años | 1469SB | Ingrediente principal cianoacrilato |
| Expansor tisular (Colibri) | Ciencias de la Vida RWD | R22029-04 | Rango de expansión 20mm/4cm |
Referencias
- Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
- Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
- Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
- Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
- Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
- Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
- Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
- Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
- Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
- Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
- Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
- Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
- Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
- Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
- Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
- Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
- Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
- Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
- Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
- Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
- Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
- Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
- Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
- Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
- Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
- Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
- Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
- Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
- Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
- Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
- Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
- Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
- Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
- Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
- Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
- Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
- Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
- de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
