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Artículo de investigación
Este estudio identifica una reducción de la diversidad microbiota intestinal y vías metabólicas alteradas en la diabetes tipo 2 (DMT2), destacando el aumento de proteobacterias y la disminución de taxones beneficiosos, lo que sugiere que la disbiosis microbiana está asociada con la DM2 y puede contribuir a su fisiopatología.
El aumento global de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) subraya la necesidad de comprender mejor sus mecanismos biológicos subyacentes, especialmente aquellos relacionados con las interacciones huésped-microbioma. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar la diversidad microbiana intestinal, la composición taxonómica y las vías metabólicas predichas en pacientes diagnosticados con diabetes tipo 2 en comparación con el grupo emparejado (NM) no diabético. Se analizaron muestras frescas de heces mediante secuenciación de ADNr 16S. Se calcularon la diversidad alfa (índices de Chao, ACE, Shannon y Simpson) y la diversidad beta para evaluar la estructura de la comunidad microbiana. Las diferencias taxonómicas se evaluaron mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon y análisis discriminante lineal del efecto tamaño (LEfSe). La predicción de vías funcionales se realizó mediante investigación filogenética de comunidades mediante la reconstrucción de estados no observados (PICRUSt2) a partir de anotaciones KEGG y MetaCyc. Se aplicó el análisis de aleatorización mendeliana (RM), incluyendo ponderación inversa de varianza, MR-Egger y métodos de mediana ponderada, para evaluar asociaciones genéticamente predichas entre taxones microbianos y diabetes tipo 2. Los resultados mostraron una reducción de la riqueza microbiana, reflejada por índices más bajos de Chao y ECA, y una estructura de diversidad alterada, reflejada en índices de Shannon más bajos y de Simpson más altos, en pacientes con diabetes tipo 2, acompañados de cambios composicionales significativos. Se observó un aumento de la abundancia relativa de Proteobacterias y una disminución de la abundancia de taxones beneficiosos como Lachnospiraceae y Blautia. La predicción funcional indicó una disminución de la abundancia de vías relacionadas con la vía no oxidativa del fosfato de pentosa, la biosíntesis de isobutanol y la biosíntesis de L-isoleucina. El análisis por RM proporcionó evidencia complementaria que apoyaba las asociaciones entre taxones microbianos específicos y la susceptibilidad a la DM2. En conclusión, la DT2DM se asocia con una reducción de la riqueza microbiana, una estructura de diversidad alterada y cambios taxonómicos y funcionales distintos. Estos hallazgos ponen de relieve la relevancia de la microbiota intestinal en la DM2 y apoyan la posible utilidad de biomarcadores y estrategias terapéuticas basadas en el microbioma. Se requieren estudios adicionales para validar estos hallazgos y aclarar los mecanismos subyacentes.
La diabetes mellitus tipo 2 (DT2) se ha convertido en una de las enfermedades crónicas de más rápido crecimiento en el mundo, impulsada por una rápida urbanización, patrones alimentarios occidentalizados y estilos de vida cada vez más sedentarios. Es un factor importante en la morbilidad y mortalidad globales y supone una carga considerable para la saludpública. Aunque la susceptibilidad genética juega un papel, el rápido aumento de la incidencia de diabetes tipo 2 pone de manifiesto la importancia de los determinantes ambientales ymetabólicos 4. Por ello, es esencial identificar mecanismos biológicos modificables para mejorar las estrategias de detección y prevención temprana. Avances recientes han identificado la microbiota intestinal como un regulador clave de la homeostasismetabólica 5. El ecosistema microbiano intestinal influye en el metabolismo de la glucosa, la función inmunitaria, la integridad de la barrera intestinal y la inflamación crónica de bajo grado, todos ellos fundamentales para la patogénesis de laDM2 6. La disbiosis se ha asociado con obesidad, resistencia a la insulina, endotoxemia y alteración del equilibrio energético, lo que sugiere una relación mecanicista entre alteraciones microbianas y progresiónde la enfermedad 7. Además, los metabolitos microbianos, incluidos ácidos grasos de cadena corta, ácidos biliares y aminoácidos de cadena ramificada, han estado implicados en la modulación de la sensibilidad a la insulina y el metabolismo delhuésped 8.
Aunque la evidencia acumulada apoya el papel del microbioma intestinal en la DT2, la mayoría de los estudios existentes se basan en diseños observacionales, que limitan la inferencia causal. Los enfoques alternativos, como la metagenómica shotgun y la metabolómica dirigida, pueden proporcionar conocimientos funcionales de mayor resolución, pero a menudo están limitados por costes, complejidad computacional y viabilidad limitada en estudios exploratorios o a escala piloto. En cambio, la secuenciación de ADNrDNA 16S es un método rentable y ampliamente adoptado para perfilar la composición de comunidades microbianas, aunque su resolución taxonómica está limitada al nivel de especie y no puede cuantificar directamente metabolitos funcionales. Por ello, la secuenciación de 16S rDNA fue seleccionada para este estudio como un enfoque rentable y escalable, adecuado para cohortes clínicas exploratorias, permitiendo a la vez la integración con la predicción funcional posterior y marcos analíticos complementarios. Por lo tanto, integrar el perfilado microbiano basado en 16S con la predicción funcional bioinformática y enfoques complementarios como la aleatorización mendeliana (MR) puede proporcionar un marco equilibrado para explorar tanto relaciones composicionales como potencialmente causales.
Cabe destacar que sigue existiendo una relativa falta de datos centrados específicamente en pacientes con diabetes tipo 2 recién diagnosticados y sin tratamiento. En tales poblaciones, las alteraciones microbianas tienen menos probabilidades de ser confundidas por intervenciones farmacológicas, especialmente la metformina, que se sabe que remodela significativamente la composición y función de la microbiotaintestinal 9. Esto representa una laguna importante en la literatura actual, ya que muchos estudios existentes incluyen poblaciones de pacientes heterogéneas con diferentes exposiciones al tratamiento y una integración limitada del perfilado del microbioma con enfoques analíticos genéticamente informados.
En este contexto, el presente estudio pretendió caracterizar la diversidad de microbiotas intestinales, la composición taxonómica y las vías funcionales predichas en pacientes recién diagnosticados con DM T2 en comparación con el grupo NM, utilizando secuenciación de ADNr16S y análisis bioinformático. Además, se aplicó la aleatorización mendeliana utilizando datos de asociación genómica a nivel genómico disponibles públicamente para explorar posibles asociaciones genéticamente predichas entre taxones microbianos específicos y el riesgo de DM2. Esta estrategia analítica combinada permite obtener conocimientos complementarios a partir del perfilado de comunidades microbianas y de datos genéticos a nivel poblacional. Específicamente, la secuenciación de ADNrDNA 16S proporciona una caracterización directa de la composición microbiana en la población estudiada, mientras que la aleatorización mendeliana aprovecha instrumentos genéticos de cohortes independientes para evaluar si las asociaciones observadas son consistentes con relaciones predichas genéticamente. Esta integración pretende abordar una limitación clave de los estudios de microbioma observacional al proporcionar evidencia complementaria que respalde la robustez de las asociaciones microbiota–T2DM. Por lo tanto, integrar estos enfoques pretende proporcionar validación cruzada en lugar de redundancia, fortaleciendo así la interpretabilidad de las asociaciones microbiota–T2DM.
El presente estudio se centra en tres aspectos. Primero, evalúa alteraciones de la microbiota intestinal en pacientes con diabetes tipo 2 recién diagnosticados y sin tratamiento para reducir la confusión causada por intervenciones farmacológicas. En segundo lugar, integra el perfilado taxonómico con las vías funcionales previstas para proporcionar una visión a nivel sistémico de los cambios metabólicos asociados a la microbiota. En tercer lugar, incorpora análisis de aleatorización mendeliana para evaluar si las asociaciones observadas son consistentes con relaciones predichas genéticamente, proporcionando así triangulación metodológica. En conjunto, estos aspectos proporcionan un marco complementario y reproducible para el análisis del microbioma en lugar de un estudio puramente descriptivo, diferenciando este trabajo de estudios previos que normalmente se basan en diseños observacionales de un solo método y no integran el perfilado microbiano, la predicción funcional y la inferencia genéticamente informada dentro de un marco analítico unificado.
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Todos los procedimientos que involucraron a participantes humanos fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética del Hospital Chongqing Chenjiaqiao (aprobación nº 20240131). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de la recogida de la muestra. Todas las muestras de heces y la información de los participantes se manejaron utilizando códigos de estudio desidentificados, según se indica en la Tabla de Materiales.
Selección de participantes e inscripción
Los pacientes recién diagnosticados con DM T2 que visitaron el Hospital Chongqing Chenjiaqiao entre junio de 2023 y diciembre de 2023 fueron evaluados para comprobar su elegibilidad. Los participantes se inscribían en el grupo DM si tenían entre 20 y 65 años, tenían un nuevo diagnóstico de DM2, aceptaban proporcionar una muestra fresca de heces y completaban la evaluación clínica y los exámenes clínicos requeridos. Los voluntarios sanos reclutados durante el mismo periodo fueron incluidos como el grupo emparejado con no diabéticos (NM) y se les emparejó con el grupo DM lo más estrechamente posible en cuanto a edad, sexo y características demográficas generales. Se excluyó a los participantes si presentaban trastornos hematológicos, enfermedades del sistema nervioso central, enfermedad reumática activa, enfermedad autoinmune, infección gastrointestinal aguda o crónica, diarrea crónica, estreñimiento, úlcera gastrointestinal activa o en proceso de curación, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable, tuberculosis intestinal, tumores gastrointestinales, otras malignidades, insuficiencia cardíaca grave, insuficiencia hepática grave, insuficiencia renal severa, otros metabólicos graves enfermedades, desnutrición, inmunodeficiencia, trastornos metabólicos congénitos, enfermedades psiquiátricas, uso de sedantes-hipnóticos o abuso de drogas. También se excluyó a los participantes si habían recibido antibióticos, agentes supresores de ácido, fármacos para la motilidad gastrointestinal, probióticos, glucocorticoides o inmunosupresores dentro del mes previo a la extracción de heces. Además, se excluyeron las personas que habían experimentado diarrea, se habían sometido a cirugía gastrointestinal o endoscopia, o reportado cambios bruscos en el entorno vital o hábitos alimenticios en el plazo de 1 mes previo a la recogida de heces. Se asignó un código único de estudio a cada participante elegible antes de la recogida de la muestra. De la cohorte elegible, se seleccionaron 12 participantes recién diagnosticados con DT2 y 12 NM para secuenciación posterior de ADNr 16S y análisis del microbioma basados en la disponibilidad de muestras y los requisitos de calidad de secuenciación.
Recogida y almacenamiento de muestras de heces
A cada participante se le proporcionó un recipiente estéril para la recogida de heces etiquetado únicamente con el código asignado para asegurar su desidentificación. Se indicó a los participantes que vaciaran la vejiga antes de defecar para minimizar la contaminación de orina y que recogieran heces frescas directamente en el recipiente estéril sin contacto con el agua del inodoro, orina, desinfectantes u otros posibles contaminantes. Inmediatamente después de la recogida, aproximadamente 1–2 g de heces se transfirieron a un tubo criogénico estéril utilizando una cuchara de muestreo desechable estéril. El tubo se sellaba herméticamente y se colocaba inmediatamente sobre hielo seco o en un recipiente de transferencia preenfriado. Todas las muestras se transportaron al laboratorio en un plazo de 2 horas tras la recogida. Al llegar al laboratorio, se verificó el código del estudio y se inspeccionó cada tubo en busca de fugas o contaminación visible. Se registraron los tiempos de recogida y almacenamiento de todas las muestras. Las muestras de heces se almacenaban posteriormente a −80 °C hasta la extracción de ADN genómico. Las muestras se consideraron aceptables para análisis aguas abajo solo si permanecían completamente congeladas durante el almacenamiento y el transporte y no mostraban evidencia de fugas de tubo ni contaminación externa.
Extracción de ADN genómico
Las muestras de heces se extraían de almacenamiento a −80 °C y se colocaban sobre hielo antes del procesamiento. Cada muestra se descongeló solo hasta que fue posible homogeneizar para minimizar la degradación asociada a ciclos repetidos de congelación-descongelación. Aproximadamente 200 mg de heces se transfirieron a un tubo estéril de microcentrífuga, y el buffer de lisis proporcionado en el kit de extracción de ADN de heces se añadió según las instrucciones del fabricante que figuran en la Tabla de Materiales. Las muestras se vórtizaron vigorosamente durante 30 segundos para lograr una homogeneización completa y luego se incubaron a temperatura ambiente durante 5–10 minutos para facilitar la lisis celular. Tras la lisis, las muestras se centrifugaron a 12.000 × g. durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente a un nuevo tubo estéril de microcentrífuga sin alterar la cápsula. Posteriormente, el ADN genómico fue eluído utilizando el tampón de elución suministrado con el kit o agua libre de nucleasa según el protocolo del fabricante. El ADN extraído se almacenaba a −20 °C para uso a corto plazo o a −80 °C para su preservación a largo plazo. Las muestras de ADN consideradas aptas para análisis aguas abajo parecían claras y libres de partículas visibles.
Evaluación de la calidad del ADN
La calidad del ADN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa y cuantificación basada en fluorescencia. Se preparó un gel de agarosa al 1% en un tampón de electroforesis, y las muestras de ADN extraídas, mezcladas con tampón de carga, se cargaron en los pozos de gel. Se realizó electroforesis hasta que las bandas de ADN se separaron adecuadamente, tras lo cual el gel fue examinado bajo iluminación ultravioleta o de luz azul. La integridad del ADN se consideraba aceptable cuando se observaba una banda genómica intacta sin degradación marcada ni difuminación excesiva. La concentración de ADN fue posteriormente cuantificada mediante un sistema de cuantificación de ADN basado en fluorescencia. Las muestras se diluyeron entonces hasta la concentración requerida para la amplificación de PCR posterior. Las muestras de ADN de alta calidad solían mostrar una banda distinta en electroforesis en gel de agarosa y estaban suficientemente concentradas para los procedimientos posteriores de amplificación.
Amplificación por PCR de la región 16S rDNA V3–V4
La región hipervariable V3–V4 del ADN bacteriano 16S se amplificaba utilizando cebadores con código de barras. Las secuencias de cebadores fueron las siguientes: cebador frontal 5′-ACTCCTACGGGGGCAG-3′ y cebador inverso 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. Las reacciones PCR se prepararon sobre hielo en un volumen final de 20 μL que contenía 4 μL de tampón PCR, 2 μL de mezcla de nucleótidos (2,5 mmol/L), 0,8 μL de cebadores directos y inversos (5 μmol/L), 0,4 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad, 10 ng de ADN plantilla y agua libre de nucleasa a volumen. Las mezclas de reacción se mezclaban suavemente por pipeteo y se centrifugaban brevemente para recoger el líquido en el fondo del tubo. La amplificación por PCR se realizó utilizando las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 minutos, seguida de 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, recocido a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s, con un paso final de extensión a 72 °C durante 10 min. Para minimizar el sesgo de amplificación, cada muestra se amplificaba en reacciones triplicadas, y los productos de PCR resultantes de la misma muestra se agrupaban posteriormente en un solo tubo. La amplificación exitosa se confirmó mediante la presencia de una banda clara de amplicón del tamaño esperado en la electroforesis en gel de agarosa.
Verificación y purificación de productos por PCR
Los productos PCR fueron verificados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los productos combinados de PCR de cada muestra se cargaron sobre el gel y electroforaron hasta que las bandas del amplicón objetivo quedaron claramente separadas. Las bandas correspondientes al tamaño esperado del amplicón se extirparon usando una hoja limpia y estéril y se purificaron con un kit de extracción en gel según las instrucciones del fabricante que figuran en la Tabla de Materiales. Los productos purificados de PCR se eluían posteriormente en agua sin elución o sin nucleasas. La concentración de cada producto purificado de PCR se cuantificó mediante un sistema de cuantificación de ADN basado en fluorescencia, y los valores de concentración se registraron para la preparación posterior de la biblioteca. La amplificación y purificación exitosas se confirmaron mediante una sola banda clara al tamaño esperado del amplicón en electroforesis en gel de agarosa.
Preparación y agrupación de bibliotecas
Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando un kit de preparación de biblioteca de ADN según las instrucciones del fabricante que figuran en la Tabla de Materiales. Las secuencias adaptadoras de secuenciación se ligaron a los amplicones purificados siguiendo el flujo de trabajo estándar de preparación de bibliotecas. Los productos ligados con adaptador se purificaban posteriormente mediante extracción en gel o un método de purificación basado en perlas, dependiendo del protocolo de preparación de la biblioteca seleccionado. Los productos purificados de la biblioteca se evaluaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2% para confirmar la distribución adecuada de fragmentos. Las concentraciones en biblioteca se cuantificaron mediante un sistema de cuantificación de ADN basado en fluorescencia. En función de la concentración de ADN y el tamaño del fragmento, cada biblioteca se normalizó a la misma concentración molar para asegurar una profundidad de secuenciación equilibrada entre muestras. A continuación, se agruparon cantidades molares iguales de bibliotecas individuales en una proporción 1:1 para generar el pool final de la biblioteca de secuenciación. Antes de la secuenciación, la biblioteca agrupada se desnaturalizaba según el protocolo de la plataforma de secuenciación antes de la carga de la muestra. Las bibliotecas consideradas adecuadas para la secuenciación mostraron una distribución clara de fragmentos dentro del rango de tamaño esperado y una concentración suficiente para el análisis de secuenciación posterior.
Secuenciación de extremos emparejados
La biblioteca final agrupada se cargaba en una plataforma de secuenciación de extremos emparejados según los procedimientos operativos estándar del fabricante. La secuenciación de extremos emparejados se realizó utilizando una configuración de 2 × 250 pb, o 2 × 300 pb, para asegurar una profundidad de secuenciación adecuada y una caracterización exhaustiva de la diversidad microbiana en cada muestra. La calidad de la secuenciación se monitorizó durante toda la partida utilizando métricas de calidad generadas por la plataforma. Tras completar la secuenciación, se exportaron archivos FASTQ en bruto de extremo emparejado para cada muestra para análisis bioinformático posterior. Se consideraron aceptables los conjuntos de datos de secuenciación cuando demostraron suficiente profundidad de lectura por muestra, puntuaciones de calidad adecuadas en el Q30 y asignación exitosa de códigos de barras.
Procesamiento de secuencias en bruto
Los archivos FASTQ en bruto de extremo emparejado se importaban en una cadena de análisis bioinformático del microbioma para su procesamiento posterior. Las secuencias se desmultiplexaron en función de los códigos de barras asignados a cada muestra. Posteriormente se realizó filtrado de calidad para eliminar lecturas que contenían puntuaciones de baja calidad, bases ambiguas o artefactos de secuenciación. Las bases de baja calidad situadas en los extremos de las lecturas se recortaron en función de la distribución de puntuaciones de calidad para mejorar la fiabilidad general de la secuencia. Tras el control de calidad, las lecturas de extremos emparejados se fusionaron a través de regiones superpuestas para reconstruir secuencias de longitud completa. Solo se conservaron secuencias fusionadas de alta calidad para análisis posteriores del microbioma.
Generación de variantes de secuencia de amplicones (ASV) y anotación taxonómica
La reducción de ruido de secuencias se realizó utilizando un algoritmo validado de desruido, incluyendo DADA2 o Deblur, para corregir errores de secuenciación y mejorar la precisión de la secuencia. Las secuencias quiméricas se identificaron y eliminaron durante el proceso de eliminación de ruido. Posteriormente se generaron secuencias representativas de ASV y tablas de abundancia correspondientes para cada muestra. La asignación taxonómica de secuencias ASV se realizó utilizando un clasificador Naive Bayes, y la anotación taxonómica se realizó con la base de datos de referencia SILVA 138. Se exportaron tablas de abundancia taxonómica a nivel de filo, familia y género para análisis aguas abajo. El conjunto final de datos de ASV incluyó secuencias representativas, información de abundancia y anotaciones taxonómicas correspondientes para cada muestra.
Análisis de diversidad alfa y beta
Se calcularon índices de diversidad alfa, incluyendo los índices de Chao, ACE, Shannon, Simpson y Coverage, para evaluar la diversidad y riqueza microbiana dentro de la muestra. Los índices de diversidad alfa se expresaron como media ± desviación estándar. La normalidad de los datos se evaluó utilizando la prueba de Shapiro–Wilk. Las variables normalmente distribuidas se compararon entre los grupos DM y NM usando las pruebas t de Student, mientras que las variables no distribuidas normalmente se analizaron mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon. Posteriormente, se calcularon distancias de diversidad beta utilizando una matriz de distancias adecuada para evaluar diferencias en la composición de comunidades microbianas entre muestras. Se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) para visualizar diferencias en la estructura de la comunidad microbiana entre grupos. Además, se realizó un análisis de similitudes (ANOSIM) para determinar si las diferencias entre grupos superaban la variación intragrupal, y se reportaron los valores R y p correspondientes de ANOSIM. El análisis de diversidad alfa reflejó la diversidad microbiana dentro de la muestra, mientras que el análisis de diversidad beta evaluó diferencias en la composición de las comunidades microbianas entre grupos.
Análisis taxonómico diferencial
La composición de la comunidad microbiana se resumió a nivel de filo, familia y género. Se generaron gráficos de barras apiladas para visualizar la abundancia relativa de taxones dominantes en muestras individuales y grupos de estudio. Se construyeron además curvas Pan/Core y diagramas de Venn para comparar los ASVs compartidos y específicos de grupo entre los grupos DM y NM. Las diferencias en la abundancia de taxones entre grupos se evaluaron mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon. Posteriormente se realizó un análisis de LEfSe para identificar taxones microbianos que contribuyeron más fuertemente a la discriminación entre grupos. El análisis taxonómico diferencial permitió identificar taxones microbianos enriquecidos tanto en el grupo DM como en el NM.
Predicción funcional
Se utilizó PICRUSt2 o una cadena de predicción funcional validada equivalente para inferir vías funcionales microbianas a partir de perfiles de secuenciación de ADNrDNA 16S. Los datos de abundancia de ASV se normalizaron según los requisitos de la cadena analítica seleccionada, y las funciones predichas se mapearon a anotaciones de vías KEGG o MetaCyc. Posteriormente, se compararon las abundancias predichas de las vías entre los grupos DM y NM. Se visualizaron rutas significativamente diferentes utilizando mapas de calor u otros enfoques gráficos apropiados. Las funciones predichas se interpretaron como potencial metabólico microbiano inferido en lugar de una abundancia metabolita medida directamente. El análisis de predicción funcional permitió identificar vías microbianas candidatas que diferían entre grupos, incluyendo vías asociadas al metabolismo de carbohidratos y aminoácidos.
Análisis de aleatorización mendeliana
Las estadísticas resumen del estudio de asociación genómica (GWAS) para la microbiota intestinal se obtuvieron de conjuntos de datos públicos10. Los datos de asociación significativa a nivel genómico para taxones microbianos se obtuvieron del Catálogo GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) del NHGRI-EBI utilizando números de acceso que iban de GCST90032172 a GCST90032644. Se accedieron a datos metagenómicos adicionales de la cohorte FINRISK 2002 a través del Archivo Europeo de Genomas-Fenómenos (ID de investigación: EGAS00001005020). Las estadísticas resumen GWAS para la diabetes mellitus tipo 2 también se obtuvieron del Catálogo NHGRI-EBI GWAS (número de acceso: ebi-a-GCST006867). Se seleccionaron variantes genéticas asociadas a taxones microbianos como variables instrumentales según umbrales estadísticos predefinidos, y se excluyeron variantes en el desequilibrio de ligamento. Los conjuntos de datos de exposición y resultados se armonizaron para asegurar una orientación alelada consistente. Posteriormente, se realizó un análisis de aleatorización mendeliana utilizando el método ponderado por la varianza inversa (IVW) como enfoque analítico principal. Se realizaron análisis de sensibilidad utilizando los métodos de MR-Egger y mediana ponderada. La intensidad del instrumento se evaluó utilizando estadísticas F, mientras que la heterogeneidad entre variables instrumentales se evaluó mediante la prueba Q de Cochran. La pleiotropía horizontal se examinó mediante la prueba de intercepción MR-Egger. Se aplicó la corrección de Bonferroni para tener en cuenta las comparaciones múltiples. Los hallazgos de la aleatorización mendeliana se interpretaron como asociaciones predichas genéticamente en lugar de evidencia definitiva de causalidad.
Salida de datos y punto final
Los resultados analíticos finales incluyeron tablas de abundancia de ASV, gráficos de composición taxonómica, métricas de diversidad alfa, análisis de diversidad beta, resultados taxonómicos diferenciales, perfiles de vías funcionales predichos y estimaciones de aleatorización mendeliana. Se verificaron todos los identificadores de muestra en los conjuntos de datos de secuenciación para garantizar la coherencia con los códigos de estudio desidentificados correspondientes. Se archivaron archivos de secuenciación en bruto, tablas ASV procesadas, salidas estadísticas y archivos fuente de figuras para análisis posteriores y gestión de datos. El protocolo se consideró completo una vez que se generaron y verificaron con éxito datos de secuenciación de alta calidad, perfiles taxonómicos, métricas de diversidad, análisis de vías funcionales predichas y resultados de aleatorización mendeliana.
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Las características demográficas y clínicas de referencia de la cohorte clínica inicialmente evaluada se presentan en la Tabla 1. Posteriormente se seleccionó un subgrupo representativo compuesto por 12 participantes recién diagnosticados con diabetes tipo 2 y 12 participantes con TMN para la secuenciación de ADNr 16S y análisis posteriores del microbioma.
Evaluación de la profundidad de secuenciación
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En los últimos años, el microbioma humano, especialmente la microbiota intestinal, ha surgido como un factor complejo e influyente en el metabolismo del huésped, la regulación inmunitaria y el desarrollo de enfermedades. En un huésped sano, la microbiota intestinal contribuye a la homeostasis inmune y a la integridad de la barrera intestinal11. La disbiosis se ha asociado con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo trastornos metabólicos, enfermedades ...
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Los autores afirman que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran considerarse un posible conflicto de intereses.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:
Linrui Xie y Kemiao Chen realizaron análisis de datos y redactaron el manuscrito. Xican Pan participó en la recogida de muestras y en los procedimientos experimentales. Xuemei Zhong y Xiaoyu Li concibieron y diseñaron el estudio, supervisaron el proyecto y revisaron críticamente el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.
Los autores agradecen a todos los participantes y al personal implicados en la recogida de muestras y el procesamiento de datos por sus contribuciones a este estudio.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Primers universales para la región 16S bacteriana |
| Congelador 80 °C | Haier Biomedical | DW-86L626 | Almacenamiento de muestras a largo plazo |
| Sistema de gel de agarosa (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Validación del producto PCR |
| Perlas magnéticas AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | Purificación de ADN y selección de tamaño |
| Tubos de Bead-beating (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Lisi mecánica de células microbianas |
| Estación de trabajo bioinformática | Dell | Precision 7920 | Análisis de datos con QIIME2 y R |
| Pipeline DADA2 | Bioconductor | Versión 1.28 | Descomposición de secuencias y generación de ASV; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Versión 2023.5 | Descomposición de secuencias y corrección de errores; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Repositorio público de conjuntos de datos metagenómicos; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accesos GCST90032172–GCST90032644 | Base de datos pública de estadísticas resumidas de asociación genómica; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Sistema de secuenciación Illumina MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Plataforma de secuenciación de alto rendimiento |
| Base de datos KEGG | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Versión 107 | Base de datos de anotación de vías funcionales; https://www.genome.jp/kegg |
| Base de datos MetaCyc | SRI International | Versión 27.1 | Base de datos de vías metabólicas; https://metacyc.org |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424R | Centrífuga de enfriamiento para preparación de muestras |
| Kit de preparación de biblioteca Nextera XT | Illumina | 20018705 | Preparación de biblioteca para secuenciación |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Para PCR de alta fidelidad |
| Termociclador PCR | Bio-Rad | T100 | Instrumento de amplificación PCR |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Versión 2.5.2 | Predicción de vías funcionales a partir de datos de secuenciación 16S rDNA; https://github.com/picrust/picrust2 |
| KIT QIAamp Fast DNA Stool Mini | QIAGEN | 51504 | Extracción de ADN de muestras de heces |
| KIT de extracción de gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | Purificación de ADN de gel de agarosa |
| Fluorómetro Qubit | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Cuantificación de ADN |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versión 4.3.1 | Análisis estadístico y análisis de aleatorización mendeliana; https://www.r-project.org |
| Base de datos SILVA 138 | Proyecto SILVA ribosomal RNA database | Versión 138 | Base de datos de referencia para anotación taxonómica; https://www.arb-silva.de |
| Tubo de recolección de heces | Sarstedt | 76.9923.001 | Tubo de recolección de muestras de heces estéril |
| KIT de ADN de heces | Omega | D4015-02 | KIT de extracción de ADN |
| Paquete TwoSampleMR | MR-Base | Versión 0.5.7 | Análisis de aleatorización mendeliana en R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |